Bant Yöntemi ve El Tipi Mikrodizileyici Kullanılarak Doku Mikrodizisinin Manuel Yapımı

Özet

Bu protokol, farklı derinliklerdeki FFPE donör bloklarını kullanarak bir doku mikrodizisinin manuel olarak nasıl oluşturulacağına dair bant yöntemini özetlemektedir.

Özet

Doku mikrodizisi (TMA), birçok formalin sabit parafin gömülü (FFPE) numunesinin tek bir parafin bloğunda temsil edilebildiği önemli bir araştırma aracıdır. Bu, farklı donör FFPE bloklarının ilgilendiği bölgeden çıkarılan doku çekirdekleri kullanılarak ve bunların tek bir TMA parafin bloğu halinde düzenlenmesiyle elde edilir. İnşa edildikten sonra, tamamlanmış TMA'dan kesitler, protein ekspresyonunun yanı sıra aynı anda birçok numunedeki genomik ve transkripsiyonel değişiklikleri değerlendirmek için immünohistokimya, kromojenik, floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve RNA ISH çalışmaları yapmak için kullanılabilir, böylece doku kullanımını en aza indirir ve reaktif maliyetlerini azaltır. Birkaç farklı TMA yapım tekniği vardır. En yaygın yapım yöntemlerinden biri, en az 4 mm uzunluğunda önerilen aynı uzunluktaki çekirdeklerle en iyi şekilde çalışan alıcı yöntemidir. Ne yazık ki, doku blokları teşhis işlemi sırasında ağır bir şekilde rezeke edilebilir ve sıklıkla 4 mm'den daha az "ideal olmayan" donör blok kalınlıklarına neden olur. Mevcut makale ve video, çift taraflı yapışkan bant yöntemine odaklanmaktadır; Bu ideal olmayan donör bloklarla son derece uyumlu olan düşük yoğunluklu (<50 çekirdekli) TMA'lar oluşturmak için alternatif bir manuel, düşük maliyetli, kullanımı kolay ve hızlı bir yöntem. Bu protokol, patolojik gözden geçirme ve inşaat sonrası doğrulamanın kritik önemine odaklanarak, bu yöntemi kullanarak bir TMA'nın nasıl oluşturulacağına dair adım adım bir kılavuz sağlar.

Giriş

Formalin sabit parafin gömülü (FFPE) dokular morfolojik ve immünohistokimyasal protein ekspresyon çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır¹. Bununla birlikte, keşif araştırması genellikle değerli dokuları tüketebilecek çok sayıda doku üzerinde birkaç belirtecin incelenmesini gerektirir. 1980'lerde tanıtılan doku mikrodizisi (TMA), birçok farklı FFPE doku bloğundan küçük örnek bölgeleri tek bir parafin bloğunda birleştiren ve birçok doku örneğinin aynı anda incelenmesine izin veren önemli bir araştırma aracıdır². Bu nedenle, TMA'lar son derece değerli ve genellikle nadir görülen doku örneklerinin aşırı kullanımından kaçınırken, aynı zamanda birçok bireysel numune üzerinde aşağı akış uygulamalarının gerçekleştirilmesiyle ilişkili maliyetleri de azaltır ^3,4.

TMAs^5'in yapımı için, otomatik ve yarı manuel yaklaşımlar ^6,7 dahil olmak üzere birkaç farklı teknik ^mevcuttur. Bu son yaklaşımların çoğu, donör bloklardan delinmiş doku çekirdeklerinin prekast bir kalıba yerleştirildiği alıcı yöntemini kullanır. Ancak bu yöntem için en az 4 mm kalınlığında "ideal" donör blokların kullanılması önerilmektedir ^6,7. Ne yazık ki, donör bloklar, özellikle de araştırma için hazır hale getirilmeden önce klinik tanı amaçlı kapsamlı bir şekilde kesitlenmiş olanlar, genellikle 4 mm'den daha az kalınlığa sahiptir, bu da 4 mm'lik bir derinliğe ulaşmak için yeniden gömme mümkün değilse veya arzu edilmezse, alıcı yöntemini kullanarak TMA yapımında kullanımdan hariç tutabilir. Dahası, bu prosedürler genellikle bir tezgah üstü manuel doku mikrodizileyicisi veya ortalama bir araştırma laboratuvarı için kolayca erişilemeyen veya uygun fiyatlı olmayan pahalı otomatik aletler kullanabilir. Buna karşılık, çift taraflı yapışkan bant yöntemi veya bant yöntemi, ucuz, yaygın olarak bulunan, yeniden kullanılabilir veya tek kullanımlık el tipi doku mikrodizileyicileri^kullanan ideal olmayan donör bloklarla uyumlu manuel bir TMA yapım yöntemidir ^8,9,10. Bu yöntem, bloğu, tamamlandıktan sonra çekirdek uzunluğuna bakılmaksızın TMA'nın üst kısmı ile aynı hizada olan ters çevrilmiş dik çekirdeklerin etrafına dökerek inşaat sürecini tersine çevirir. Sonuç olarak, tüm numuneler ilk kesitlendiğinde TMA bölümlerinde bulunur, bu da oluşturucunun bu ideal olmayan bloklardan en iyi şekilde yararlanmasını sağlar. Bu nedenle, bant yöntemi, uzman olmayan araştırma laboratuvarları için uygun maliyetli ve uygulanabilir bir alternatiftir.

TMA inşaatı zorlukları olmadan değildir ve çekirdeklerin çıkarılacağı doku bölgelerini seçerken dikkatli olunmalıdır, bu da patolojik incelemeyi TMA yapım sürecinin kritik bir parçası haline getirir^11,12. Bu nedenle, bu protokol, TMA'ları inşa eden ve kullanan bireylerin farkında olması gereken TMA yapısı ile ilişkili bazı patolojik tuzakları ve patoloji incelemesinin neden bir TMA bloğunun ömrü boyunca devam etmesi gerektiğini vurgulayarak TMA yapımında patolojik gözden geçirmenin derin önemini vurgulamayı amaçlamaktadır.

Bu protokol, AIDS ve Kanser Örnek Kaynağı (ACSR) Teknik Çekirdek Laboratuvarı'nda, bant yöntemini kullanarak ideal olmayan donör bloklardan TMA'lar oluşturmak için atılan adımları özetlemektedir; ACSR'nin, HIV malignite araştırmalarını teşvik etmek için HIV kanser dokularından biyoörneklerin toplanmasına ve adil bir şekilde dağıtılmasına adanmış NIH tarafından finanse edilen bir biyodepo olduğu.

Protokol

Tüm donör bloklar toplama sırasında tanımlanmamış ve onaylanmış Mayo Clinic IRB protokollerine (PR16-000507 ve PR2207-02) uygun olarak TMA inşaatı için kullanılmıştır.

1. Patoloji incelemesi

1. TMA yapımında kullanılacak FFPE doku donör bloklarını alın.
2. Tanıyı doğrulamak ve dokuya açıklama eklemek için kurul sertifikalı bir patolog tarafından histolojik inceleme için seçilen her FFPE doku donör bloğu için yeni oluşturulmuş bir hematoksilin ve eozin (H & E) boyalı slayt¹³ gönderin.
   NOT: H&E boyama, bu protokolde olduğu gibi, evde yapılabilir veya boyama için patolojik bir çekirdek hizmetleri laboratuvarına gönderilebilir. TMA'ları oluştururken hatırlanması gereken en önemli kavramlardan biri, FFPE donör bloklarındaki dokuların, şekli, tümör içeriği ve doku canlılığı artan blok derinliği ile önemli ölçüde değişebilen 3 boyutlu (3D) yapılar olmasıdır. Patolog, 3D dokunun 2 boyutlu bir temsili olan H&E boyalı doku bölümünün gözden geçirilmesine dayanarak, doku çekirdeğini çıkarmak için en iyi bölgeyi belirlemelidir.
3. Histolojik inceleme sırasında, patologun H&E boyalı slaytlarda ilgilenilen / ilgilenmeyen dokuları tanımladığından ve açıklama eklediğinden emin olun. Slayta açıklama eklemek için aşağıdaki adımları izleyin.
   1. İlgilenilen dokuyu daire içine almak için bir slayt işaretleme kalemi kullanın.
   2. Aynı işaretleme kalemini kullanarak, daire içine alınmış bölge içinde kaçınılması gereken alanları lekeleyin.
   3. Çekirdek örnekleme ve ekstraksiyon için ideal olduğu düşünülen alanları işaretlemek için işaretleme kalemini kullanın.
      NOT: Doku şeklinin ve bileşiminin bloktaki doku derinliği ile değişebileceğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, doku çekirdeğinin bileşimi, çekirdeğin çıkarıldığı yere bağlı olarak değişebilir, bu da devam eden patolojik rehberliğe duyulan ihtiyacı vurgular.
   4. Patolojik incelemeye yardımcı olmak için gerekirse H&Es ile birlikte hastalığa özgü immünohistokimyasal boyalar için ek doku gönderin. Bu tür lekelere örnek olarak HER2 pozitif meme kanseri 14 için ERBB2 boyaması, Kaposi sarkomu¹⁵ için HHV-8, B hücreli lenfomalar için CD20 16, RNA kalitesi¹⁷ için global bir belirteç olarak U6, Epstein-Barr virüs pozitifliğini belirlemek için EBER¹⁸ ve mezenkimal kökenlerin ve doku kalite kontrol belirtecinin doğrulanması olarak Vimentin ^19,20 verilebilir.

2. TMA inşaatı için hazırlık

1. Patoloji incelemesi tamamlandıktan sonra, TMA yapımında kullanılacak donör blokların nihai listesini derleyin ve bir TMA haritası oluşturun (Şekil 1A). TMA haritası, tamamlanan TMA'da çekirdeklerin nerede bulunacağını ve elde edilen TMA'dan elde edilen kaydırağa monte edilmiş doku örneklerini gösteren şematik bir taslaktır.
2. Oryantasyon amacıyla, TMA haritasının çekirdekleri 3 x 3 veya 4 x 4 matris gibi eşit bir matrise yerleştirmekten kaçındığından ve en az 1 yönlendirme işaretçisi içerdiğinden emin olun.
   NOT: Oryantasyon çekirdekleri, dokusuz renkli oryantasyon araçları^21'den alınan çekirdekler veya TMA temasından belirgin şekilde farklı dokular içeren doku blokları olabilir. Dik çekirdeklerin önceden dökülmüş bir balmumu kalıbına yerleştirildiği alıcı yönteminden farklı olarak, bant yöntemi, ters çevrilmiş, dik çekirdeklerin etrafına erimiş balmumu dökerek bir TMA oluşturur. İnşaat sürecinin bu tersine çevrilmesi, inşaat haritası olarak bilinen ikinci bir harita gerektirir.
3. TMA haritasının ayna görüntüsünü oluşturarak inşaat haritasını oluşturun (Şekil 1B). İnşaat haritası, tamamlanan TMA'da doğru yerde görünmesi için inşaat sırasında her bir çekirdeğin nereye yerleştirilmesi gerektiğini gösterir. İnşaat haritasını kaydedin.
4. Haritalar oluşturulduktan sonra, metal TMA taban kalıbını hazırlayın. Çekirdek yerleşimini yönlendirmek ve çekirdek ayrımını düzenlemek için tek kullanımlık kağıt damalı ızgara kullanın.
   NOT: Ek pdf'de, 26 mm x 20 mm iç boyutlara sahip ticari olarak temin edilebilen metal taban kalıplarıyla kullanılmak üzere maksimum 40 çekirdek (artı iki yönlü çekirdek/boşluk için) için 6 x 7 (42 noktalı) şablon ızgarası verilmiştir. Kağıt ızgarasını yazdırın ve kesin.
5. Damalı ızgarayı boyuta göre kesin ve ızgaranın arkasına bir parça çift taraflı çubuk bant (DSST) yapıştırın. Izgarayı ve DSST bandını metal tepsiye yerleştirin ve ızgaranın üstüne, yani metal taban kalıbındaki kağıt ızgaranın üstüne ikinci bir DSST parçası ekleyin (Şekil 2A).

3. Çekirdek yerleşimi

1. Patolojik olarak gözden geçirilmiş H&E'yi karşılık gelen doku bloğunun üzerine yerleştirin ve doku bloğunun nerede delineceğini belirlemek için patolog işaretlerini kullanın (Şekil 2B).
2. FFPE donör bloğunu uygun yerde manuel bir çekirdek zımba (Şekil 2C) kullanarak delin.
   NOT: Çekirdek zımbalar çeşitli çaplarda mevcuttur. Bu yöntemde 2 mm çapında bir el tipi çekirdek zımba kullanılır.
   1. Yeniden kullanılabilir bir çekirdek zımba kullanıyorsanız, her doku zımbasından önce ve sonra temizlendiğinden emin olun.
3. Çekirdeği çekirdek zımbadan çıkarın ve çıkarılan çekirdeği DSST kaplı ızgaranın artı işaretlerine yerleştirmek için bir iğne çekme kullanın (Şekil 2D). Çekirdek ızgaraya yerleştirildiğinde, çekirdeğin doku ucu DSST'ye (doku yüzü aşağı) temas edecek şekilde ters ve dik olduğundan emin olun. Ayrıca, çekirdeğin inşaat haritasında belirtildiği gibi ızgara üzerinde uygun konuma yerleştirildiğinden emin olun.
4. Tüm donör bloklar özlü hale gelene ve çekirdekler uygun konumlarına yerleştirilene kadar tekrarlayın.

4. TMA'nın tamamlanması

1. Masaüstü fırını açın, 78 °C'ye ayarlayın ve sıcaklığa ulaşmak için yeterli süre tanıyın.
2. Yapılacak her TMA için, 45 g parafin peletini fırına dayanıklı bir kapta eritin.
3. Plastik bir kaseti etiketleyin ve çekirdekleri içeren metal taban kalıbının üzerine yerleştirin (Şekil 2E). Çekirdeklerin yüksekliği metal tepsinin derinliğini geçmemelidir, çünkü kaset yerleştirildiğinde uzun çekirdekler eğilir veya devrilir.
4. Taşmayı yakalamak için kalıbı kasetle birlikte bir tepsiye yerleştirin ve erimiş parafini kasetten yavaşça çekirdeklerin tepsisine dökün (Şekil 2F).
5. TMA'nın gövdesinde hava kabarcığı olmadığından emin olmak için erimiş parafinin taşmasına izin verin. Parafinin kasetin üst kısmına dolduğundan emin olun, böylece parafin katılaştıktan sonra parafin bloğuna gömülür ve sıkıca bağlanır.
6. Bloğu hareket ettirmeyin veya rahatsız etmeyin ve oda sıcaklığında 30 dakika soğumasını bekleyin. Ardından, tamamen katılaşması için 4 ° C'de 30 dakika daha soğutun.
7. Tamamen katılaştıktan sonra, metal taban kalıbını kasetle bağlı parafin çekirdek bloğundan yavaşça ayırın.
   NOT: DSST, inşaat süreci boyunca yapışkanlığını korur ve sıklıkla yeni oluşturulan parafin bloğa tutturulur. Varsa, DSST'yi ve ızgarayı şimdi tamamlanmış TMA bloğunun üstünden yavaşça çıkarın.

5. TMA'nın doğrulanması

1. TMA inşa edildikten sonra, yeni tamamlanan TMA'yı kesmek için bir mikrotom kullanın. Bir veya daha fazla tam yüzlü doku bölümünü kesin.
2. Bölümleri önceden ısıtılmış su banyosuna aktarın ve bölümleri kaydırarak monte edin.
   NOT: Yeni inşa edilen bloklar, tüm çekirdekleri içeren tam yüz dokusu bölümleri elde etmek için genellikle blok kaplamalı (fazla parafinin kesilmesi) gerektirir.
3. Kuruduktan sonra, H&E boyama¹³ ve gerekirse ek immünohistokimyasal boyama için yeni kesilmiş kızağa monte edilmiş bir TMA bölümü gönderin.
4. Lekeli TMA H&E kesitlerini patolojik inceleme için gönderin.
   NOT: TMA patoloji incelemesi sırasında, kurul onaylı bir patolog, tercihen TMA donör bloklarını gözden geçiren aynı patolog, istenen ilgi çekici dokuların gerçekten mevcut olduğundan emin olmak için TMA H & E lekeli çekirdeklerini gözden geçirir. Adım 1.3.4'te donör blok incelemesi için herhangi bir ek doku veya hastalığa özgü immünohistokimyasal leke gönderilmişse, bu lekeler TMA kesitlerinde tekrarlanmalı ve patolojik inceleme için TMA H&E ile birlikte gönderilmelidir.
5. TMA patolojik validasyon incelemesinin sonuçlarını kaydedin.

Sonuçlar

Burada açıklanan TMA konstrüksiyonunun bant yöntemi, ACSR Teknik Çekirdek Laboratuvarı'nda dokuları korumak için kullanılan ve son derece değerli dokuların araştırmacılara tutumlu ve adil bir şekilde dağıtılmasına izin veren tercih edilen yöntemdir.

İnşaat sürecinin kritik bir bileşeni, TMA çekirdeğinin elde edilmesi gereken belirli bir donör bloğundaki ilgili dokunun tanımlanmasıdır. Bu, eğitimli bir patologun yeni oluşturulmuş bir H&E slaytını gözden geçirdiği patolojik inceleme ile belirlenir (Şekil 3). Bir işaretleyici kullanarak, patolog H&E slaytındaki alanı çevreler, bu da çekirdeğin bu dairenin içindeki donör bloktan elde edilmesi gerektiğini gösterir (Şekil 3). Patolog ayrıca kaçınılması gereken nekrotik alanlar veya ek doku çekirdeklerinin elde edilebileceği iyi huylu alanlar gibi ek alanları da işaretleyebilir (Şekil 3). Çekirdekler daha sonra belirtilen alanlardan delinir ve TMA'nın yapımına dahil edilir.

Bir TMA'nın bant yöntemiyle başarıyla tamamlanması için iki temel metrik vardır. Birincisi, görsel inceleme ile değerlendirilen, beklenen pozisyonlarda ve birbirinden uzak mesafelerde doku çekirdeği noktalarının varlığıdır. Şekil 4A, B, iki başarılı tamamen bant yöntemi TMA'sını ve bunlara karşılık gelen H&E slaytlarını göstermektedir. TMA bloklarının görsel incelemesi, çekirdeklerin her TMA'da mevcut olduğunu ve düzenli olarak aralıklı olduğunu gösterir. Bant yöntemi yapım sürecinde ortaya çıkabilecek başlıca inşaat sorunlarından bazıları, balmumu katılaşmasından önce metal tabanın erken çıkarılması nedeniyle blok ve kasetin ayrılmasını içerir (Şekil 4C). Bant yöntemiyle oluşturulmuş TMA'larda gözlemlenen bir diğer potansiyel sorun, gömülü çekirdeklerin çekirdek devrilmesi ve veya yerleştirilmesi sürüklenmesidir (Şekil 4D); Erimiş parafinin aşırı derecede çalkantılı dökülmesinden kaynaklanabilecek bir sorun, zayıf yapışkan DSST ile daha da desteklenebilir. Şekil 5, TMA1'in çekirdekleri için H&E görüntülerini göstermektedir. Bir çekirdek (nokta 1) hariç hepsi TMA1'in H&E'sinde bulunur. Şekil 5 ayrıca bazı çekirdeklerin tam dairesel doku noktaları (yani, nokta 4, 6, 13, 17) olarak mevcut olduğunu, diğerlerinin ise tamamen mevcut olmadığını (yani, nokta 3, 8, 9, 12) göstermektedir. Bu son durumlarda yaşanan doku kaybı nadir değildir ve tüm çekirdekleri tam olarak ortaya çıkarmak için gereken yetersiz kesitlemeden kaynaklanıyor olabilir. Alternatif olarak, eksik veya toplam doku yokluğu (yani, nokta 1), bu çekirdeğin düşük doku kalitesinden kaynaklanabilir ve bu da boyama işlemi sırasında doku kaybına neden olabilir.

İkinci başarı metriği, TMA çekirdeklerinin ilgilenilen dokuyu yakalayıp yakalamadığı açısından değerlendirilir. Bu, önceden delinmiş donör blok H&Es'e (Şekil 3) kıyasla bireysel TMA H&E çekirdeklerinin patolojik incelemesi ve doğrulanması (Şekil 5) ve gerektiğinde / gerçekleştirilen diğer ek immünohistokimyasal boyalar ile elde edilir. Şekil 6, Vimentin, U6, EBER ve CD20 dahil olmak üzere TMA1'de gerçekleştirilen örnek lekeleri göstermektedir. Vimentin pozitif dokular (kahverengi leke), tüm dokuların mezenkimal kökenli olduğunu ve lekelenebilecek kalitede olduğunu gösterir. U6 pozitifliği (koyu mor/mavi leke), dokudaki RNA kalitesinin iyi olduğunu gösterir ve gen transkriptlerini hedef alan EBY gibi RNA in situ hibridizasyon (ISH) boyalarına iltifat eder. Şekil 5'teki U6 sonuçları, RNA kalitesinin lenfoma dokusunda (nokta 9) ve normal bademcik dokusu oryantasyon kontrolünde (nokta 22) yüksek olduğunu, ancak nokta 19'daki normal dokuda olmadığını göstermektedir. Bu EBER boyamasını takiben normal dokuda ve oryantasyon kontrolünde negatif, ancak lenfoma dokusunda güçlü bir şekilde pozitifti (nokta 9). Lenfoid kökenli dokular için beklendiği gibi, hem 9 hem de 22 numaralı noktalar B hücresi belirteci CD20 için pozitif boyandı, ancak normal omurilik dokusundan kaynaklanan nokta 19 bunu yapmadı. Tüm TMA çekirdekleri için boyama sonuçları Tablo 1'de özetlenmiştir ve bu TMA doku çekirdekleri için doku ek açıklamasını doğrulamaktadır.

Şekil 1: TMA haritaları. Tüm FFPE blokları ve yönlendirme kontrolleri seçildikten sonra, TMA haritası (A) olarak bilinen, her bir donör blok çekirdeğinin bitmiş blokta nerede bulunacağını özetleyen ayrıntılı bir harita oluşturulur. Bant yöntemini kullanarak bir TMA inşa ederken, inşaat haritasının (B) TMA haritasının ayna görüntüsü olduğuna dikkat etmek önemlidir, çünkü bu yöntem inşaat sürecini tersine çevirir, çekirdekleri prekast bir kalıba sokmak yerine dik doku çekirdeklerinin etrafına erimiş parafin döker. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bant yöntemini kullanarak TMA'nın oluşturulması. (A) Katman 2 adet çift taraflı çubuk bant (DSST) ve metal taban kalıbının dibinde takip sırasına göre bir kağıt ızgara; ilk DSST parçasını (2A kesici uç), ardından tek kullanımlık kağıt ızgarasını ve ardından ikinci DSST parçasını metal taban kalıbının altına yerleştirin. (B) Her donör blok için, yeni bir H&E üretilir ve ilgilenilen dokuyu, bloğun nerede delineceğini ve mümkünse bir doku çekirdeğini çıkarmak için delinmekten kaçınılması gereken yeri belirtmek için H&E'yi işaretleyen bir patolog tarafından gözden geçirilir. (C) Donör bloğu bir bertaraf veya yeniden kullanılabilir el tipi TMA zımba ile delin. (D) Bir iğne ucu kullanılarak, her bir çekirdek dik durur, tümör ızgarayı kaplayan DSST'ye yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirilir. (E) Dik çekirdekleri içeren metal tepsinin üzerine önceden etiketlenmiş plastik bir kaseti dikkatlice yerleştirin. (F) Erimiş parafin, kasetin altındaki dik çekirdekleri çevrelemek ve batırmak için kaset kafesi aracılığıyla tepsiye yavaşça dökülür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Donör blok H&E boyası. Her donör bloğundan H&E boyalı kesitler, çekirdek toplama için ilgilenilen alanları / dokuları (yani, canlı kanser (CA) veya iyi huylu (BN) dokular) ve kaçınılması gereken alanları (yani, nekrotik doku alanları). Açıklamalı H&E ile belirtildiği gibi doku bloğunun uygun alanları daha sonra tanımlanır, delinir ve inşa edilen TMA'ya dahil edilir. Elde edilen TMA çekirdek zımba H & E, daha sonra, ilgilenilen dokunun çekirdek zımbada yakalandığını doğrulamak için donör blok H & E'nin delinmemiş bölgesine geri yönlendirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Temsili Sonuçlar . (A,B) Patolojik inceleme için bant yöntemi TMA'ları ve beraberindeki H&E'ler başarıyla tamamlandı. (C) Kaset metal taban kalıbından erken çıkarıldığında plastik kaset ve parafin bloğun ayrılması. (D) Erimiş parafinin çalkantılı dökülmesinden kaynaklanan devrilmiş ve taşınmış çekirdekleri gösteren tamamlanmış bant yöntemi TMA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 5: TMA çekirdek H&Es. TMA1 için H & E boyalı bölüm, TMA'yı (nokta 1-21) ve oryantasyon çekirdeklerini (nokta 22 ve 23) oluşturmak için kullanılan her doku çekirdeği için ayrı ayrı H&E'yi gösterir. Gösterilen görüntüler, görüntüleme yazılımına bağlı bir dijital kamera ile donatılmış 4x objektif kullanılarak elde edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Örnek immünohistokimyasal ve RNA ISH. TMA1'den tam yüz kesitleri IHC tarafından vimentin ve CD20 ekspresyonu için ve RNA kalitesini (U6) ve EBV durumunu EBER ISH aracılığıyla değerlendirmek için RNA ISH ile değerlendirildi. Görüntüler, bir tümör dokusu (nokta 9), bir normal doku (nokta 19) ve iki oryantasyon kontrolünden biri (nokta 22) dahil olmak üzere üç çekirdek için örnek görüntüler göstermektedir. Vimentin pozitifliği kahverengi boyama, U6 pozitifliği mavi/mor boyama, EBER mavi/mor boyama ve CD20 kahverengi boyama ile gösterilir. Gösterilen görüntüler, görüntüleme yazılımına bağlı bir dijital kamera ile donatılmış 4x objektif kullanılarak elde edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Yapılı TMA dokularına ve yapılan lekelere genel bakış: Tablo, (a) temsili TMA lekelerinin her birinde doku bulunup bulunmadığını (b) her H&E lekeli doku noktasında tümör bulunup bulunmadığını ve (c) bitişik TMA kesitlerinde yapılan ek immünohistolojik lekelerin sonuçlarını özetlemektedir: "-" negatif, n / d = yapılmadığını gösterir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek dosya. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

TMA yapım sürecinin en kritik bileşenlerinden biri, TMA çekirdeklerinin elde edileceği FFPE donör bloklarının patoloji incelemesidir⁴. İnceleme sırasında, kurul sertifikalı bir patolog, her bir donör bloğundan temsili bir H & E lekeli doku bölümünü inceler. H&E'nin taze kesilmiş bir doku kesiti kullanılarak üretilmesi zorunludur, böylece karşılık gelen donör bloğunun en iyi temsili olur. FFPE dokularının, doku profili blok derinliği ve geniş kesitleme ile önemli ölçüde değişebilen 3 boyutlu yapılar olduğu göz önüne alındığında, eski H&E'lerin kullanılması önerilmez; Bu, H&E'nin üretilmesinden bu yana gerçekleşmiş olabilir ve potansiyel olarak FFPE bloğunun temsilini yanlış hale getirebilir. Gözden geçirme süreci, uygun vakaların seçimi ve çekirdeklerin elde edilmesi gereken doku alanlarının belirlenmesi ve ayrıca çekirdekleri toplarken kaçınılması gereken alanların belirlenmesi için gereklidir. Patolojik incelemenin yokluğunda, uygun olmayan dokuları dahil etme olasılığı önemli ölçüde artar. Bu tür dokuların dahil edilmesi, inşa edilen TMA'yı etkisiz ve amaçlanan amacı için uygun hale getirme potansiyeline sahiptir. Daha da önemlisi, bu tür etkisiz TMA'ları bilmeden kullanmak, yanlış ve yanıltıcı verilerle sonuçlanmak için muazzam bir potansiyele sahiptir. Bu, FFPE dokularının profilinin ve dolayısıyla türev çekirdeklerinin artan derinlikle önemli ölçüde değişebileceği bilgisi ile birleştiğinde, inşa edilmiş bir TMA bloğunun ömrü boyunca devam eden patoloji incelemesinin önemini vurgulamaktadır. İdeal olarak, çekirdeklerin doku profillerindeki değişikliklerin yakalanmasını ve kaydedilmesini sağlamak için H&E'ler her 15^{. veya} 20. bölüm kullanılarak oluşturulmalıdır^. En azından, bu potansiyel değişiklikleri izlemek için bir projenin başında ve sonunda H&Es oluşturulmalı ve gözden geçirilmelidir. Bu noktalar ve TMA'nın bir araştırma aracı olarak önemi ışığında, patolojik derlemenin TMA yapım sürecine ve TMA bloğunun ömrü boyunca sıkı sıkıya gömülmesi zorunludur.

FFPE blokları, araştırma amacıyla serbest bırakılmadan önce rutin tanısal işlem sırasında genellikle kapsamlı bir şekilde bölümlere ayrılır. Sonuç olarak, donör blok derinliği ve dolayısıyla donör blok çekirdek uzunlukları genellikle 4 mm'lik alıcı yöntemden daha azdır. Burada, temel avantajı ideal olmayan FFPE doku bloklarından gelen çekirdeklerle uyumluluğu olan bant yöntemi yapım protokolünü kullanarak TMA'ların nasıl oluşturulacağını gösterdik. Bant yöntemi büyük bir araştırma değerine sahip olmasına ve TMA bloklarını oluşturmak için ucuz, kullanışlı ve erişilebilir bir yöntem sunmasına rağmen, zorlukları ve sınırlamaları olmadan değildir. Tek bir TMA bloğunda 100-1.000'lerce çekirdeği barındırabilen hem otomatik hem de manuel alıcı yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bant yöntemi⁹ kullanılarak oluşturulan TMA'lar için maksimum 40 çekirdek önerilir. Diğer bir sınırlama ise inşaat kolaylığı ile ilgilidir. Alıcı yönteminde, delikli çekirdekler sadece her bir çekirdeği kendi bireysel kuyusuna yerleştirerek çekirdek stabilitesi sağlayan prekast bir kalıba yerleştirilir, böylece çekirdek göçünü önler ve aynı zamanda oldukça düzenli çekirdek yerleşimini ve ayrımını teşvik eder²². Ayrıca, alıcı yöntemi tamamen manuel, yarı manuel ve tam otomatik olmanın isteğe bağlı rahatlığını sunar. Buna karşılık, manuel bant yöntemi, her bir çekirdeğin bir iğne çekme kullanılarak elle dikkatli ve nazik bir şekilde yerleştirilmesini gerektirir. Bant yönteminde prekast kalıbın bulunmaması, alıcı yöntemle yaşanan son derece düzenli yerleştirme ve ayırmayı engellese de, damalı bir ızgaranın dahil edilmesiyle bu eksikliğin üstesinden gelinir. Damalı ızgaranın, blok kenarı yerleşimini önlemek için metal tepsinin ortasına yapıştırılması önemlidir, bu da çekirdeği yerinde tutan yetersiz parafin varsa çekirdek kaybı riskini artırır. Ayrıca, alıcı yöntemiyle mümkün olan küçük çekirdek ayırmalarının, manuel çekirdek yerleştirme ve iğne seçiminin bitişik çekirdekler arasına sığması ihtiyacı nedeniyle bant yöntemiyle elde edilemeyeceği de belirtilmelidir. Çekirdekler, DSST kaplı ızgaraya temas eden en küçük yüzey alanı veya çekirdeğin ayak izi ile bağımsız dik bir şekilde yerleştirilir. Bu kurulum, alıcı yönteminden önemli ölçüde daha az çekirdek kararlılığı sağlar ve erimiş parafin dökülürken çekirdek devrilmesi ve veya göçü için gelişmiş bir risk verir. Gerçekten de, protokoldeki en kritik adımlardan biri erimiş parafini dökmektir. Parafinin tamamen sıvı olmasını sağlamak için fırından çıkarıldıktan sonra bunun hızlı bir şekilde yapılması ve dökülmenin minimum türbülansla nazikçe yapılması esastır. İlginç bir şekilde, Chen ve ark., alıcı bloğu oluştururken ve donör blok çekirdeklerini yerleştirirken iğneleri yönlendirmek için boş bir parafin bloğunun üzerine yerleştirilen 7 x 11 eşit olarak dağıtılmış 2 mm çaplı deliklere sahip bir şablona benzeyen oldukça yeni bir yardımcı cihaz geliştirdi²³. Alıcı blok yapımına yardımcı olmak için tasarlanmış olmasına rağmen, böyle bir cihaz, yerleştirmeyi yönlendirmek, ayırmayı düzenlemek ve inşaat işlemi sırasında çekirdek stabilitesini artırmak için bant yöntemine kolayca uyarlanabilir.

Çekirdek kararlılığının en önemli efektörlerinden biri, bir bant yöntemi TMA'ya dahil edilen çekirdek sayısıdır. Bunun nedeni, çekirdek sayısı arttıkça, artan çekirdek sayısına uyum sağlamak için çekirdeğin çapının azalması gerektiğidir ve bu da DSST'ye bağlı çekirdek ayak izini azaltır. Bant yöntemi TMA yapımı için minimum 1 mm'lik bir çekirdek çapı önerilir, çünkü daha küçük çaplı çekirdeklerin özellikle dengesiz olduğunu ve çok yumuşak parafin dökülmesiyle bile devrilmeye eğilimli olduğunu bulduk. 16 G iğne (1.1 mm çekirdek çapı) ve 4 mm çapında bir zımba kullanan iki farklı şirket içi yöntemi araştıran yeni bir çalışma, 1.1 mm (% 26.5) ile önemli doku kayıpları yaşadı, ancak 4 mm çekirdekler²⁴ ile değil. Bu, küçük çekirdeklerin sadece inşaat sırasında değil, çalışmak için sorunlu olabileceğini gösteriyor gibi görünüyor. Dahası, daha küçük çaplar orijinal donör bloğunu ve daha büyük çekirdekleri temsil etmeyebilir, bu da patolojik yorumlamayı zorlaştırır ve yanlış donör doku temsili olasılığını arttırır.

Oryantasyon bloklarının dahil edilmesi ve yerleştirilmesi TMA yapımında büyük önem taşımaktadır. Bununla birlikte, bu, bant yöntemiyle oluşturulmuş TMA'lar için özellikle önemlidir. Bu, bant yönteminin inşaat sürecini tersine çevirmesinden ve böylece mekansal yönelim bozukluğu riskini arttırmasından kaynaklanmaktadır. Her bloğa en fazla üç yönlendirme çekirdeği eklemenizi ve bloğu en iyi şekilde yönlendirmek için örnek çekirdeklerden uzağa yerleştirilmelerini öneririz. Oryantasyon çekirdekleri, inşa edilmiş TMA temasından belirgin şekilde farklı dokular içeren doku bloklarından alınan çekirdekler veya dokusuz renkli oryantasyon araçları²¹ olabilir; burada ikincisi patolog olmayanlar için özellikle yararlıdır. Düzenli olmayan matris desenli çekirdek yerleşimi ile birleştiğinde, oryantasyon çekirdekleri oryantasyon bozukluğu riskini en aza indirir.

Bant ve alıcı yöntemleri kullanılarak inşa edilen TMA'lar arasındaki çekirdek uzunluğundaki belirgin fark, inşaat yöntemini seçerken karar verme sürecine donör blok derinliğinin dahil edilmesinden kaynaklanmaktadır. Burada özetlenen protokol, donör bloklar sırasıyla <4 mm ve 4 mm derinliklere sahip olduğunda TMA'ların bant ve alıcı yöntemleri kullanılarak oluşturulduğu bir eşik kullanır. Donör blok derinliğinin inşaat yöntemi seçimine dahil edilmesinin evrensel olmadığını belirtmek önemlidir. TMA'ların donör blok derinliğinden bağımsız olarak her iki yöntem kullanılarak da inşa edilmesi mümkün olsa da, daha uzun çekirdekler, bant yöntemini kullanarak TMA yapımı sırasında plastik kasetin yerleştirilmesine müdahale edebilir ve veya devrilebilir veya eğilebilir. Karar verme sürecine kriterleri dahil etme veya çıkarma seçimi, laboratuvarın kullanabileceği olanaklara, maliyete ve istenen nihai ürüne bağlıdır. Bu protokolün parametreleri altında, TMA'dan oluşturulan bir bant yönteminden elde edilebilecek slayta monte TMA bölümlerinin sayısı, alıcı yöntemle oluşturulmuş bir TMA'dan elde edilenden önemli ölçüde daha azdır. Donör blok derinliğini arttırmak ve alıcı yöntemle uyumlu hale getirmek için FFPE dokularını yeniden bloke etmek mümkün olsa da, re-blok içinde aynı doku oryantasyonunu elde etme olasılığı düşüktür. Buna karşılık, bu, muhtemelen önemli doku kaybını içerecek olan tam yüz bölümü elde etmek için geniş bir blok yüzü gerektirebilir. Blok cepheden sonra, TMA ile oluşturulmuş bir bant yöntemi, tüm çekirdeklerin mevcut olduğu yaklaşık 50 kaydırağa monte TMA bölümü verir. Bununla birlikte, kesin sayı bloktan bloğa değişecektir ve TMA'yı oluşturmak için kullanılan çekirdeklerin uzunluğuna ve kesilen bölümlerin kalınlığına bağlıdır (5 μm'ye karşı 4 μm). Ayrıca, farklı çekirdek uzunlukları nedeniyle, TMA'nın aşamalı olarak bölümlendirilmesi nedeniyle çekirdeklerin farklı zamanlarda tükeneceği de belirtilmelidir; devam eden patolojik incelemeye duyulan ihtiyacı yeniden vurgulayan bir özellik.

Alıcı yöntemi, daha az sıkıcı ve daha hızlı bir inşaat süreci de dahil olmak üzere bant yöntemine göre önemli faydalar ve avantajlar sunsa da, bant yöntemi deneyimli yüksek verimli laboratuvarlara yönelik değildir. Ortalama bir laboratuvara, özellikle de kaynak sınırlı ortamlardakilere, değişken derinliklerdeki donör bloklarına erişimi olan, ancak TMA inşaat hizmetlerine erişimi olmayan laboratuvarlara yöneliktir. Bununla birlikte, gelecekteki uygulamalar, yüksek verimli laboratuvarlarda uygun numune havuzunu geliştirmek ve donör blokların yeniden bloke edilmesi ihtiyacını ortadan kaldırmak için bu yöntemin otomasyonunu görebilir. Sonuç olarak, açıklanan TMA bant yöntemi yapım protokolü, pahalı ekipmanlara ihtiyaç duymadan uzman olmayan laboratuvarlarda kolayca kurulabilir. Bununla birlikte, yeni kullanıcıların, değerli dokular kullanarak TMA yapımına geçmeden önce bant yöntemi tekniğini tanımak için ilk başta FFPE doku blokları, dokusuz renkli oryantasyon araçları²¹ veya hatta dokusuz renkli parafin blokları kullanmaları önerilir. Yapımları, hem TMA bloklarını inşa edenlerin hem de kullananların farkında olması gereken potansiyel tuzaklar olmadan olmasa da, bu görünüşte cilalanmamış "ev yapımı" TMA inşaat yöntemi, araştırma için yüksek kaliteli, biyolojik olarak ilgili TMA'lar sağlayabilir. Gerçekten de, bant yöntemiyle oluşturulmuş TMA'lardan kaynaklanan TMA bölümleri, ACSR biyodeposunda en çok talep edilen doku örneklerinden biridir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51 microscope	Olympus	BX51
cellSens imaging software	Olympus	x
Cotton Balls	FisherBrand	22-456-880
Double sided tape (removable)	Scotch	383534
DP72 camera	Olympus	DP72
Economy Lab Oven	FisherBrand	13246516GAQ
Forceps	Various	x
Formula "R" (paraffin)	Leica	3801450
Glass microscope slides	FisherBrand	12-550-15
Low Profile Micotome Blades	Accu-Edge	4689
Microtome	Leica	RM2265
Permanent marker	Electron Microscope Sciences	72109-12
Quick Ray manual tissue microarrayer set	Unitma	UT06
Stainless-Steel Base Molds	FisherBrand	22-038-209
Tissue Cassette Cooling Tray	Electron Microscope Sciences	63314
Tissue Processing/Embedding Cassette	FisherBrand	15-182-701E
Waterbath	Triangle Biomedical Sciences	TFB-120
Wooden stick	FisherBrand	22363158