Morfogenez, Desenleme ve Hücre Farklılaşmasında Erken Adımları Anlamak için Tavuk Rekombinant Uzuvları Testi

Özet

Rekombinant uzuvlar, hücre farklılaşma sürecini ve embriyonik sinyallerin etkisi altında kalıpların üretilmesini incelemeye izin veren güçlü bir deneysel modeldir. Bu protokol, farklı organizmalardan elde edilen diğer hücre tiplerine uyarlanabilen, tavuk ekstremite-mezodermal hücrelere sahip rekombinant uzuvlar üretmek için ayrıntılı bir yöntem sunar.

Özet

Hücre farklılaşması, gelişmekte olan doku ve organların kurulması sırasında farklı uzmanlaşmış hücre tiplerinin oluşumuna yol açan ince ayarlı hücre bağlılığı sürecidir. Bu süreç yetişkinlikte aktif olarak sürdürülür. Hücre farklılaşması, organların gelişimi ve homeostazı sırasında devam eden bir süreçtir. Hücre farklılaşmasının erken adımlarını anlamak, morfogenez gibi diğer karmaşık süreçleri bilmek için gereklidir. Bu nedenle, rekombinant tavuk uzuvları, embriyonik modelleme sinyalleri altında hücre farklılaşması ve desen üretiminin incelenmesine izin veren deneysel bir modeldir. Bu deneysel model in vivo bir ortamı taklit eder; yeniden toplanmış hücreleri, erken bir ekstremite tomurcuğundan elde edilen ektodermal bir örtüye birleştirir. Daha sonra, ektodermler, gelişimine izin vermek için bir civciv embriyo reseptörüne transfer edilir ve implante edilir. Bu tahlil esas olarak mezodermal ekstremite tomurcuk hücrelerini değerlendirmek için kullanılmıştır; Bununla birlikte, diğer organizmalardan diğer kök veya progenitör hücrelere uygulanabilir.

Giriş

Omurgalı uzuv, hücre farklılaşmasını, hücre çoğalmasını, hücre ölümünü, desen oluşumunu ve morfogenezi^incelemek için zorlu bir modeldir ^1,2. Gelişim sırasında, uzuvlar lateral plaka mezoderm^1'den türetilen hücrelerden şişkinlikler olarak ortaya çıkar. Ekstremite tomurcukları, bir ektoderm tarafından kaplanmış mezodermal hücrelerin merkezi bir çekirdeğinden oluşur. Bu erken yapıdan, bütün ve iyi biçimlendirilmiş bir uzuv ortaya çıkar. Ekstremite tomurcuğu ortaya çıktıktan sonra, üç eksen tanınır: (1) proksimo-distal eksen ([PD] omuzdan parmaklara), (2) dorso-ventral eksen ([DV] elin arkasından avuç içine kadar) ve (3) anterior-posterior ([AP] başparmak parmağına). Proksimal distal eksen, ekstremite tomurcuğunun distal ucunda bulunan apikal ektodermal sırta (AER), uzmanlaşmış ektoderme bağlıdır. AER, büyüme, hayatta kalma bakımı, proliferasyon ve sinyal alan hücrelerin farklılaşmamış durumu^{için gereklidir 2,3}. Öte yandan, polarize edici aktivite bölgesi (ZPA) anteroposterior paternleme^4'ü kontrol ederken, dorsal ve ektoderm dorsoventral desenleme ^7,8'i kontrol eder. Üç boyutlu modellemenin entegrasyonu, bu üç eksen arasındaki karmaşık çapraz konuşmayı ima eder⁵. Uzuv gelişimi sırasında moleküler yolun anlaşılmasına rağmen, bütün bir uzuv oluşturmak için modellemeyi ve uygun büyümeyi kontrol eden mekanizmalar hakkındaki açık sorular cevapsız kalmaktadır.

Edgar Zwilling, gelişmekte olan uzuvlarda ekstremite mezenkimal hücreleri ve ektoderm arasındaki etkileşimleri incelemek için 1964 yılında rekombinant uzuv (RL) sistemini geliştirdi⁶. RL sistemi, ayrışmış-yeniden agregaye edilmiş ekstremite tomurcuk mezodermini embriyonik ekstremite ektodermine monte ederek donör civciv embriyosunun dorsal kısmına greft eder. Ektoderm tarafından sağlanan sinyaller, farklılaşma genlerinin ve modelleme genlerinin uzay-zamansal bir şekilde ekspresyonunu indükler, böylece uzuv gelişimi sırasında meydana gelen hücre programlarını özetleyebilen uzuv benzeri bir yapının oluşumunu indükler ^7,8,9.

RL modeli, ekstremite bileşenlerinin özelliklerini ve mezodermal ve ektodermal hücreler arasındaki etkileşimi anlamak için değerlidir⁶. Bir RL, ekstremite tomurcuk mezodermal hücrelerinin ektodermal^{bir örtü 6} içinde deneysel olarak birleştirilmesi veya yeniden birleştirilmesiyle oluşturulan uzuv benzeri bir yapı olarak tanımlanabilir. RL'nin morfogenezi, ektodermal modelleme sinyallerine cevap verecek mezodermal hücrelerin (veya diğer tiplerin) özelliklerine bağlıdır. Bu deneysel sistemin avantajlarından biri çok yönlülüğüdür. Bu özellik, farklı gelişim aşamalarından hücreler, uzuv boyunca farklı konumlardan veya bütün (ayrışmamış) veya yeniden toplanmış hücreler 7,8,9,10 gibi mezodermal hücrelerin kaynağını değiştirerek çoklu kombinasyonların oluşturulmasına izin verir. Başka bir örnek, embriyonik ektodermi tavuk dışındaki türlerden, örneğin kaplumbağa¹¹, bıldırcın veya fare^12'den elde etme yeteneğidir.

Bu anlamda, RL tekniği uzuv gelişimini ve uzuv mezenkimal ve ektodermal hücreleri arasındaki etkileşimleri evrimsel bir bakış açısıyla incelemeye yardımcı olur. Bu teknik aynı zamanda farklı progenitör hücre kaynaklarının, embriyonik ektoderm^12,13,14 tarafından sağlanan sinyallerden yararlanarak uzuv benzeri bir yapıya farklılaşma yeteneğini analiz etmek için büyük bir potansiyele sahiptir. İn vitro kültürlerin aksine, RL, gelişmekte olan bir uzuvdan gelen embriyonik sinyalleri yorumlayarak bir hücre popülasyonunun farklılaşmasını ve morfogenetik potansiyelini değerlendirmeye izin verir ^9,15.

Bu protokolde, yeniden toplanmış mezodermal ekstremite tomurcuk hücreleri ile başarılı RL gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlanmıştır, böylece bu protokolü farklı yeniden topaklanmış hücre kaynakları veya hatta farklı ektoderm kaynakları ile uyarlama imkanı açılmaktadır.

Protokol

Bu araştırma, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México'nun (UNAM, Mexico City, Meksika) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu protokolün genel adımlarının şematik bir akış şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir.

1. Embriyo inkübasyonu ve canlılığın belirlenmesi

1. Döllenmiş tavuk yumurtalarını 38 ° C'de ve% 60 bağıl nemde, 22 HH aşamasına ulaşana kadar yaklaşık üç buçuk gün boyunca inkübe edin (Hamilton ve Hamburger, 1951'e göre)¹⁶.
   NOT: Taze döllenmiş tavuk yumurtası 15 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
   1. Döllenmiş yumurtaları inkübe etmek için, yumurtaları sivri uçlu tarafı aşağı doğru nemlendirilmiş inkübatöre dikey olarak yerleştirin. Kuluçka sırasında yumurtaları döndürün, çünkü gelişmekte olan embriyonun kabuk zarına yapışmasını önlemek için gereklidir.
      NOT: Döllenmiş tavuk yumurtaları yerel çiftliklerden elde edilebilir. Döllenmiş Beyaz Leghorn tavuk yumurtası genellikle geç embriyolarda tüylerin pigmentasyonunu önlemek için kullanılır. Üç yapı elde etmek için yeterli yumurtayı ayrı ayrı inkübe etmeyi düşünün: (1) uzuv mezodermal hücreleri, (2) uzuv ektodermleri ve (3) RL'yi aşılamak için donör embriyolar.
2. Üç buçuk günlük inkübasyondan sonra, kuluçka makinesinden yumurtaları çıkarın,% 70 etanol ile silin ve havanın kurumasına izin verin.
3. Kan damarlarını gözlemlemek ve embriyoyu bulmak için yumurtayı konserve eden gelişmekte olan embriyoları tanımlayın. Embriyosu olmayan yumurtaları atın.
   NOT: Bu noktada, mezodermal hücreler, ektodermler ve RL için konakçılar elde etmek için yumurtaları dağıtın.

2. Ektodermleri doldurmak için ekstremite mezodermal hücrelerinin elde edilmesi

NOT: Manipülasyonları başlatmadan önce, çalışma alanının, mikroskopların ve tüm enstrümantallerin% 70 etanol çözeltisi ile süpürülerek dezenfekte edilmesi şiddetle tavsiye edilir.

1. Bir pencere açmak için yumurta kabuğunun künt ucuna künt forseps ucu ile dokunun ve forsepsleri kullanarak kabuğun yaklaşık 1 cm x 1 cm'sini çıkarın.
2. Yumurtaları plastik veya karton bir tutucuya aktarın ve stereomikroskop altında birer birer yerleştirin. Hava membranını tanımlayın ve ardından hiçbir damarın bulunmadığı küçük bir delik açarak çıkarın. Bu bölgeyi ince cerrahi forseps yardımıyla çekin.
   NOT: Hava membranı, yumurtanın pencerelenmesinden hemen sonra gözlenen beyaz ve opak membran olarak tanımlanabilir.
   1. Embriyo ile temas edebilecek küçük yumurta kabuğu parçalarını çıkarın.
      NOT: Protokolü başlatmadan önce embriyoların 22 HH aşamasında olduğunu doğrulayın. Daha erken aşamalardaki embriyolar, yumurta kabuğu penceresini bantla kapattıktan sonra inkübatöre geri gönderilebilir.
3. İnce cerrahi forseps kullanarak amniyonun yırtılarak açılmasını sağlayarak amniyotik kesesi tamamen açın (bkz.
   NOT: Amniyon, embriyoyu yakından kaplayan ve amniyotik sıvı ile doldurulmuş şeffaf bir zar olarak tanımlanabilir.
4. Bir çift künt forseps kullanarak embriyoyu yumurtadan dikkatlice çıkarın ve daha sonra buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin çözeltisi (1x PBS) içeren steril bir Petri kabına aktarın. Kalan yumurtalar için bu adımı tekrarlayın. Mezodermal hücreleri elde etmek için sadece ~ 8-10 embriyonun yeterli olduğunu düşünün.
5. Embriyoları buz gibi soğuk 1x PBS'de bir kez yıkayın ve bir stereomikroskop yardımıyla ( Malzeme Tablosuna bakınız), kalan zarları geri çekin. Arka bacak tomurcuklarını bulun.
   NOT: Ekstremite tomurcukları, embriyonun ön-arka ekseni boyunca kanattan çıkıntılar halinde yer alan yuvarlak yapılardır. Arka bacaklarda ön ayaklardan daha posterioral olarak bulunur.
6. Embriyoları temiz 1x PBS'de tutun ve bir çift ince cerrahi forseps kullanarak, her bir arka bacak tomurcuğu uzunlamasına kesin. Tüm arka bacak tomurcuklarını incelemek için tomurcuğu embriyonun yanına çok yakın kesin. Bu adımı kalan embriyolarla tekrarlayın.
7. Uzuv tomurcuklarını boş bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın.
8. 1x PBS'nin fazlalığını gidermek için bir pipet ucu kullanın ve PBS'yi 500 μL'lik %0,5 tripsin çözeltisi ile değiştirin (bkz. Uzuv tomurcuklarını bir termoblokta 37 ° C'de 7 dakika boyunca inkübe edin.
9. Tripsin çözeltisini çıkarın ve Hanks Dengeli Tuz Çözeltisinde 2 mg / mL'de 500 μL kollajenaz tip IV ile değiştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız), ardından 8 dakika boyunca 37 ° C'de bir termoblokta inkübe edin.
   NOT: Tripsin inkübasyonu ektodermleri hafifçe ayırırken, kollajenaz mezodermal hücreleri ayrıştırır.
10. Kuluçkadan sonra, mümkün olduğunca fazla kollajenaz çıkarın ve enzimleri inaktive etmek için% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1 mL soğuk Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta-yüksek glikoz (DMEM-HG) ortamı ile değiştirin. Karışımı hafifçe ~ 10 kez pipetleyin.
11. Hücreleri içeren süspansiyonu, ektodermleri geride bırakmak için 70 μm'lik bir hücre süzgeci ile filtreleyin.
    NOT: Filtreleme ayrıca sindirilmemiş uzuv tomurcuklarını da giderecek ve arkasında tek hücrelerin süspansiyonunu bırakacaktır.
12. Filtrelemeden sonra, süspansiyonu tekrar 5-10 kez pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj yapın, ardından süpernatanı atın.
13. Fazla kollajenazı yıkamak için% 10 FBS ile desteklenmiş 1 ml DMEM-HG kullanın. Süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
14. Pipetleme ile ortamı dikkatlice atın ve daha sonra tüpün altındaki hücreleri rahatsız etmeden% 10 FBS ile desteklenmiş 1 mL taze DMEM-HG ile değiştirin.
15. Hücrelerin bir termoblokta 37 ° C'de 1-1.5 saat boyunca inkübe edildikten sonra kompakt bir pelet (yeniden agrega) oluşturmasına izin verin.
    NOT: Mezodermal hücreler peleti oluştururken, ekstremite ektodermlerinin elde edilmesi uygundur.

3. Ekstremite ektodermlerinin elde edilmesi

1. Bölüm 2'deki 1-6 arasındaki adımları, ektodermleri elde etmek için seçilen diğer 22 HH tavuk embriyosu ile ayrı ayrı tekrarlayın.
   NOT: Bu amaçla embriyo sayısı, istenen RL'nin son sayısı ile orantılıdır. 2:1 ektoderm-RL oranı uygundur.
2. Arka bacak tomurcuklarını elde ettikten sonra, bunları boş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Fazla 1x PBS'yi çıkarın ve steril 1x PBS'de 500 μL% 0,5 tripsin ile değiştirin. Karışımı bir termoblok içinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
3. Enzimatik sindirimden sonra, uzuv tomurcuklarını içeren tripsin çözeltisini steril bir Petri kabına aktarın.
4. Fazla tripsini bir mikropipet kullanarak mümkün olduğunca çıkarın; Petri kabını, tüm uzuv tomurcukları kaplanana kadar FBS'nin% 10'u ile desteklenmiş buz gibi soğuk 1x PBS ile doldurun.
   NOT: FBS, at serumu ile değiştirilebilir.
5. Stereomikroskop altında uzuv tomurcuklarını tanımlayın; ektodermi, ekstremite mezodermal hücrelerinden hafifçe ayrılmış şeffaf bir membran olarak tanımlayın (Şekil 1B).
6. Ekstremite tomurcuğunun en proksimal ucunu ince cerrahi forseps yardımıyla tutarken, diğer forsepsleri kullanarak ektoderm tabakasını dikkatlice ayırın ve ayırın.
   NOT: Ektodermlerin elde edilmesi, mezodermal hücre kümelenmesi ve ektodermlere bağlanması nedeniyle zor olabilir, böylece yapışkan hale gelmelerine neden olabilir. Petri kabındaki sadece ektodermleri korumak için mezodermal hücrelerin sürekli olarak atılması önerilir.
7. Ektodermleri buz gibi soğuk 1x PBS-%10 FBS çözeltisinde tutun.
   NOT: Ektodermler, yeniden toplanan mezodermin hazır olmaması durumunda 4 °C'de saklanabilir. Bununla birlikte, peletin kuluçka süresini ektodermal elde etme ile koordine etmek tercih edilir.

4. Mezodermal hücrelerin ektodermal kapak içine monte edilmesi

NOT: Bunun için, boş ektodermlerin, oluşturulmuş bir mezodermal hücre peleti içeren steril 1x PBS-% 10 FBS çözeltisi içeren bir Petri kabında bulunması gerekir.

1. Pelet oluşturulduktan sonra (bakınız bölüm 2), pipetle pipetle ortamın ~600 μL'sini tüpten atın.
2. Pelet'i bir pipet ucu kullanarak ve parçalamadan veya tahrip etmeden alttan dikkatlice ayırın.
3. Pelet tüpün dibinden tamamen ayrıldığında, peleti boş ektodermleri içeren Petri kabına aktarmak için tüpü baş aşağı çevirin (Şekil 1C).
4. Bir çift ince cerrahi forseps yardımıyla peletin küçük bir parçasını kesin ve ektoderme mümkün olduğunca yakın yerleştirin.
5. Bir torbaymış gibi, ektodermi cerrahi forsepslerle açın ve pelet parçasını ektodermal kapağa mümkün olduğunca sıkı bir şekilde yerleştirin. Bu adımı istediğiniz kadar RL için yineleyin (Şekil 1D).
   NOT: Pelet parçalarını birer birer kesin ve 1x PBS-%10 FBS çözeltisini temiz tutmak için ektodermleri doldurun. Peletin büyüklüğünün her ektoderme karşılık gelmesi gerekir.
6. Ektoderm ve mezodermin oda sıcaklığında ~ 30 dakika boyunca birlikte iyileşmesine izin verin ve daha sonra embriyo konağına greftleyin. Kullanılmayan ektoderm ve mezodermi atın.

5. Doldurulmuş ektodermin konakçı embriyoya nakli
 

NOT: Ektodermleri nakletmeden önce, biri embriyo manipülasyonu ve RL aşılaması için olmak üzere bir tezgah üzerinde yan yana iki stereomikroskop yerleştirin. Diğeri ise doldurulmuş ektodermleri embriyoya transfer edilmeye hazır tutmak içindir.

1. Doldurulmuş ektodermleri aşılamak için istenen yumurta sayısını seçin.
2. Künt forsepslerin ucunu kullanarak, bir pencere açmak için 22 HH konakçı embriyonun yumurta kabuğuna dokunun. Hava zarını tanımlayın ve bir çift ince cerrahi forseps kullanarak tamamen çıkarın.
3. Embriyonun sağ kanadını ortaya çıkarmak için ön ayağın yakınındaki amniyotik kesesi açın. Yalnızca prosedürü gerçekleştirmek için gereken miktarı açın.
4. Ön ayak pozisyonu tarafından yönlendirilerek, bir tungsten iğne ile yara tırmalama yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız) 2-3 somit uzunluğunda, kanayana kadar mezoderme hafifçe zarar verin.
5. Bireysel olarak doldurulmuş bir ektodermi (RL) civciv embriyosuna aktarın ve rekombinant ekstremitenin tabanını somit yarasının üzerine yerleştirin.
   NOT: RL transferi plastik pipetle veya açılı yarık bıçakla yapılabilir.
6. RL'yi 0,025 mm çapında ve 0,5-1 mm uzunluğunda iki parça paladyum tel ile doğru şekilde sabitleyin (bkz. Konakçı embriyonun kanadına tutturulmasını ve vaskülarize edilmesini sağlamak için RL'nin tabanını yara ile hizalayın (Şekil 1E).
7. Pencereyi bantla kapatın ve yumurtayı inkübatöre geri koyun. Embriyoları analiz için istenen zaman noktalarında toplayın.

Sonuçlar

İyi performans gösteren bir rekombinant uzuvun tanınması
Aşılamadan sonra, manipüle edilen embriyolar, RL'nin gelişmesine izin vermek için inkübatöre geri gönderildi. Kuluçka süresi, deneyin gereklilikleri ile ilişkiliydi. Bununla birlikte, RL implantasyonun 12 saatinden sonra kolayca ayırt edilebilir. İmplantasyonun yeterli olup olmadığını belirlemek için RL, donör embriyonun mezodermal duvarına güvenli bir şekilde tutturulmuş bir çıkıntı olarak gözlendi (

Tartışmalar

Genel olarak, RL protokolü beş adıma ayrılabilir: (1) embriyo inkübasyonu, (2) ektodermleri doldurmak için uzuv mezodermal hücrelerinin elde edilmesi, (3) ektodermlerin elde edilmesi, (4) mezodermal hücrelerin ektodermal kapakların içine monte edilmesi ve (5) doldurulmuş ektodermlerin konakçı embriyolara nakli. RL tekniğinin en büyük sınırlaması, uygun şekilde performans göstermek için sabır gerektiren birçok kritik noktaya sahip olan uzun, ayrıntılı protokoldür. Protokolü başarıyla tamamla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01