İskelet Kas Liflerinde Subsellüler Glikojen Dağılımının İletim Elektron Mikroskobu Kullanılarak Ölçülmesi

Özet

Modifiye edilmiş bir fiksasyon sonrası prosedür, dokudaki glikojen parçacıklarının kontrastını arttırır. Bu yazıda, iskelet kasında lif tipine özgü hücre altı glikojen dağılımı hakkında tarafsız ve nicel veriler elde etmek için dokunun nasıl ele alınacağını, görüntülemenin nasıl yapılacağını ve stereolojik yöntemlerin nasıl kullanılacağını açıklayan adım adım bir protokol sunulmaktadır.

Özet

İletim elektron mikroskobu kullanımı ile, bireysel kas lifleri içeren sabit numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde edilebilir. Bu, hacim fraksiyonları, yüzey alanı / hacim oranları, morfometri ve farklı hücre altı yapıların fiziksel temas bölgeleri gibi ultrayapısal yönlerin nicelleştirilmesini sağlar. 1970'lerde, hücrelerde glikojen boyamasının arttırılması için bir protokol geliştirildi ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak glikojen ve glikojen parçacık boyutunun hücre altı lokalizasyonu üzerine bir dizi çalışmanın yolunu açtı. Çoğu analiz, glikojen kas lifleri içinde homojen olarak dağılmış gibi yorumlarken, sadece tek bir değer (örneğin, ortalama bir konsantrasyon) sağlarken, iletim elektron mikroskobu, glikojenin farklı hücre altı bölmelerde bulunan ayrık glikojen parçacıkları olarak depolandığını ortaya koymuştur. Burada, doku toplanmasından, bireysel iskelet kası liflerinin farklı hücre altı bölmelerindeki glikojen hacim fraksiyonunun ve parçacık çapının kantitatif olarak belirlenmesine kadar adım adım protokol açıklanmaktadır. 1) Doku örneklerinin nasıl toplanacağı ve boyanacağı, 2) görüntü analizlerinin ve veri işlemenin nasıl yapılacağı, 3) tahminlerin hassasiyetinin nasıl değerlendirileceği, 4) kas lifi tipleri arasında ayrım yapılacağı ve 5) metodolojik tuzakların ve sınırlamaların nasıl yapılacağına ilişkin hususlar yer almaktadır.

Giriş

Glikojen partikülleri, glikozun dallanmış polimerlerinden ve çeşitli ilişkili ^{proteinlerden1} oluşur ve yüksek metabolik talepler sırasında önemli bir yakıt ^oluşturur2. Yaygın olarak tanınmamasına rağmen, glikojen parçacıkları aynı zamanda bazı hücre altı proseslerin, plazma glikozu ve yağ asitleri gibi diğer ve daha uzun ömürlü yakıtların mevcudiyetine rağmen tercihen glikojen kullandığı yerel bir yakıt ^{oluşturur3,4}.

Glikojen depolamanın hücre altı spesifik lokalize bir yakıt olarak depolanmasının önemi, çeşitli derlemelerde ^{tartışılmıştır5,6} esas olarak glikojen iletimi elektron mikroskobu (TEM)^7,8 ile glikojen hücre altı dağılımının en eski belgelerinden bazılarına dayanmaktadır. İlk çalışmalarda histokimyasal boyama tekniklerinden negatif ve pozitif boyamalara kadar glikojen kontrastını arttırmak için farklı protokoller ^{kullanılmıştır9,10}. Önemli bir metodolojik gelişme, glikojen parçacıklarının kontrastını önemli ölçüde artıran potasyum ferrosiyanürle indirgenmiş ^{osmiyum11,12,13,14} ile rafine edilmiş fiksasyon sonrası protokoldü. Bu rafine protokol, egzersize bağlı glikojen tükenmesi konusundaki öncü çalışmaların bazılarında kullanılmamıştır15, ancak Graham ve meslektaşları tarafından yeniden ^{tanıtılmıştır16,17}.

2 boyutlu görüntülere dayanarak, glikojenin hücre altı dağılımı çoğunlukla üç havuzda bulunan glikojen parçacıkları olarak tanımlanır: subsarkolemmal (yüzey zarının hemen altında), intermiyofibriller (miyofibriller arasında) veya intramiyofibriller (miyofibriller içinde). Bununla birlikte, glikojen parçacıkları, örneğin sarkoplazmik retikulum7 veya ^{çekirdekler18} ile ilişkili olarak da tanımlanabilir. Hücre altı dağılıma ek olarak, TEM tarafından tahmin edilen glikojen içeriğinin avantajı, nicelemenin tek lif seviyesinde yapılabilmesidir. Bu, lif-lif değişkenliğinin araştırılmasına ve mitokondri ve lipit damlacıkları olarak lif tipleri ve hücresel bileşenlerle korelasyon analizlerine olanak tanır.

Burada, iskelet kası liflerindeki üç yaygın hücre altı glikojen havuzunun (subsarkolemmal, intermiyofibriller ve intramiyofibriller) TEM tarafından tahmin edilen fiber tipine özgü hacimsel içeriği için protokol açıklanmaktadır. Yöntem, insanlardan iskelet kaslarına ^{uygulanmıştır19}, sıçanlar20 ve ^fareler21; kuşların ve balıkların yanı ^sıra22; ve sıçanlardan ^{kardiyomiyositler23}.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

İnsan biyopsisi yapılan iskelet kası örneklerini kullanan mevcut protokol, Güney Danimarka için Sağlık Araştırma Etiği Bölge Komiteleri (S-20170198) tarafından onaylanmıştır. Kas biyopsileri, deri altından lokal anestezi verildikten sonra emme ile Bergström iğnesi kullanılarak vastus lateralis kasından derideki bir kesi yoluyla elde edildi (insizyon başına %2 1-3 mL Lidokain). İzole edilmiş bütün sıçan kasları kullanılmışsa, Danimarka'daki Odense Üniversitesi Hastanesi'ndeki hayvan etik komitesinin yönergelerine uygun olarak, kas biyopsileri alınmadan önce hayvanlar servikal çıkık tarafından kurban edildi.

1. Birincil sabitleme, sabitleme sonrası, gömme, bölümleme ve kontrast oluşturma

1. 2 mL'lik bir mikro santrifüjleme tüpünde 1.6 mL birincil fiksatif çözelti (0.1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7.3)% 2.5 glutaraldehit) hazırlayın. En fazla 14 gün boyunca 5 ° C'de saklayın.
2. Kas biyopsisinden veya tüm kastan, herhangi bir yönde maksimum 1 mm çapına sahip olan ve uzunlamasına lif yönünde kesitsel olarak (oryantasyon amaçlı) biraz daha uzun olan küçük bir örneği izole edin.
3. Numuneyi soğuk primer fiksasyon çözeltisini içeren tüpe yerleştirin. 24 saat boyunca 5 °C'de saklayın.
4. Numuneyi 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,3) dört kez (her yıkama arasında 15 dakika) yıkayın. Transfer pipetlerini kullanarak, numuneye dokunulmadan kalan kullanılmış tamponu tüpten çıkarın ve ardından taze tamponu ekleyin.
   NOT: Son yıkamanın ardından, numune 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda 5 °C'de birkaç ay boyunca ^{saklanabilir11}. Protokol burada duraklatılabilir.
5. ₄ °C'de 120 dakika boyunca 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,3) %1 ozmiyum tetroksit (_OsO4) ve %1,5 potasyum ferrosiyanür (K4Fe(CN)₆) içeren sonek.
   NOT: %1,5 potasyum ferrosiyanür (_K4Fe(CN)₆) kullanımı, glikojen parçacıklarının optimal kontrastı için gereklidir11,12,13.
6. Oda sıcaklığında (RT) çift damıtılmış suda iki kez durulayın.
7. Aşağıdaki konsantrasyonları kullanarak RT'de derecelendirilmiş bir alkol (etanol) serisine batırılarak kurutun: % 70 (10 dakika),% 70 (10 dakika),% 95 (10 dakika),% 100 (10 dakika) ve% 100 (10 dakika).
   NOT: Her adımda, numune etanol içine batırılır ve daha sonra numunenin kurumasını önlemek için sadece kısmen çıkarılır. Son olarak, kalan etanol atılır.
8. Aşağıdaki hacim oranlarını (propilen oksit / epossidik reçine) kullanarak RT'de derecelendirilmiş propilen oksit ve epossidik reçine karışımları ile sızın: 1/0 (10 dakika), 1/0 (10 dakika), 3/1 (45 dakika), 1/1 (45 dakika), 1/3 (45 dakika), 0/1 (geceleme). Ertesi gün, numuneleri kalıplara %100 taze possidik reçineye gömün ve 48 saat boyunca 60 °C'de polimerize edin.
   NOT: Bu derecelendirilmiş yöntem, önceki ^{protokollere11,12 uygundur}. Protokol burada duraklatılabilir.
9. Uzunlamasına yönlendirilmiş liflerin ultra ince (60-70 nm) kesitlerini kesin ve bunları aşağıdaki gibi tek delikli bakır ızgaralarda toplayın.
   1. Bir numunenin bloğunu ultramikrotom tutucuya monte edin.
   2. Doku seviyesine ulaşmak için yüzeydeki bloğu bir tıraş bıçağı ile kesin.
   3. Numunenin önüne bir elmas bıçak (ultracut 45) takın ve numune yüzeyini bıçağa paralel olarak hizalayın.
   4. Numunenin yönünü kontrol etmek için elmas bıçakla yarı ince (1 μm) bir bölüm oluşturun. Işık mikroskobu ile gözlem için yarı ince kesiti toluidin mavisi ile lekeleyin.
   5. Uygun ultra ince bölümler elde etmek için ilgi alanını azaltmak için bloğu daha da kesin.
   6. Ultra ince (60-70 nm) bölümleri ikinci bir elmas bıçakla (ultracut 45) kesin.
   7. Mükemmel Döngü kullanarak tek delikli bakır ızgaralarda 1-2 bölüm toplayın.
      NOT: Tek delikli bakır ızgaranın ortasında Formvar destek membranlı tek bir delik vardır.
10. Yukarıdaki ızgaraları 20 dakika boyunca uranil asetat çözeltisine (çift damıtılmış suda% 0.5) ve daha sonra 15 dakika boyunca kurşun sitrat çözeltisine (çift damıtılmış suda% 1) batırarak uranil asetat ve kurşun sitrat ile kontrast kesitler. Izgaraları iki leke arasında ve sonrasında çift damıtılmış suda yıkayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

2. Görüntüleme

1. İletim elektron mikroskobunu (80 kV'luk hızlandırıcı voltajda çalıştırılır), bilgisayarı ve görüntü kayıt yazılımını açın. Dijital yavaş tarama 2 k x 2 k CCD kamera ve ilgili görüntüleme yazılımı ile dijital görüntüler kaydedin.
2. Mikroskop aşamasında birden fazla bölümlü ızgarayı yerleştirin.
3. Bölümlerin kalitesini (yani, destek membranındaki delikler, döküntüler vb.) belirlemek için ızgarayı başlangıçta düşük büyütmede (örneğin, x100) tarayın ve en kaliteli bölümleri seçin. Düşük büyütmede, kas liflerinin yönünü belirleyin.
4. Daha sonra, bölümdeki çevresel bir fiber üzerinde ortalanmış ışın ile büyütmeyi artırın. Görüntüde yeterli ince ayrıntı sağlamak için görüntüyü 30 k'nın üzerindeki büyütmeye odaklayın ve varsa Gerçek Zamanlı Hızlı Fourier Dönüşümü ile yönlendirilin. Son olarak, istenen büyütmede 1 s pozlama süresine sahip görüntüler kaydedin.
5. Rastgele seçilmiş bir lifin toplam 24 görüntüsünü, yani miyofibriller boşluğun 12 görüntüsünü ve subsarkolemmal alanın 12 görüntüsünü, 10 k ile 40 k arasında bir büyütmede elde edin. Tarafsız sonuçlar elde etmek için görüntülerin fiberin uzunluğu ve genişliği boyunca rastgele ancak sistematik bir sırayla dağıtıldığından emin olun (Şekil 1A).
   NOT: En uygun büyütme, mevcut kamera çözünürlüğüne ve mikrografların boyutuna bağlıdır. Amaç, glikojen parçacık çaplarının 1 nm adımlarla ölçülebildiği nihai bir çözünürlüğe ulaşmak ve miyofibriller bölgenin toplam alanını en az 70 μm2 ve lifin toplam uzunluğunu en az 25 μm'lik bir miyofibriller boşluğun 12 görüntüsüne ve lif başına subsarkolemmal boşluğun ¹² görüntüsüne dağıtmak, sırasıyla. Lif başına 24 görüntü, büyük olasılıkla, insan, sıçan ve fare iskelet kaslarından gelen bireysel liflerde 0.1 ila 0.2 arasındaki farklı glikojen havuzlarının hacimsel içeriğinin hassasiyetini (hata katsayısı) ^{verecektir20,21,24} (Şekil 2E).
6. Toplam 6-10 fiber görüntülenene kadar 2,4 ve 2,5 numaralı adımları yineleyin. Gerekirse, ek bölümleri kesin (önceden görüntülenen liflerin üst üste binmesini önlemek için en az 150 μm ile ayrılmış) ve 1.9-2.5 adımlarını tekrarlayın.

3. Görüntü analizleri

1. Dosya > Aç'a tıklayarak görüntüleri ImageJ'ye aktarın.
2. Analiz Et > Ölçeği Ayarla'ya tıklayarak genel ölçeği görüntünün orijinal boyutuyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
3. Image > Zoom > In'e tıklayarak %100 yakınlaştırın.
4. Araçlar menüsünden Düz Çizgi aracını kullanarak miyofibriller boşluğun görüntüsü başına bir Z-diskinin kalınlığını (fiber başına 12) ölçün (Şekil 1D). 6-10 fiberin her birinin ortalama Z-disk kalınlığını hesaplayın.
5. En kalın ortalama Z-diske sahip 2-3 fiberi tip 1 fiberler olarak ve en ince ortalama Z-disc'i tip 2 fiberler olarak tanımlayan 2-3 fiber. Daha ileri analizler için ara 2-4 lifleri göz ardı edin (Şekil 1E).
   NOT: Aşağıdaki adımlar, numunedeki 4-6 lifin her biri için tekrarlanır. Glikojen hacim fraksiyonları, başka bir yerde açıklandığı gibi nokta sayımı ile tahmin ^edilir25,26. Tahminlerin tatmin edici bir yüksek hassasiyetini elde etmek için ızgaraların boyutu seçilir. Bu genellikle 250 isabet elde ederek elde edilir, bu da daha sonra ihtiyaç duyulan toplam puan sayısını ve dolayısıyla puan başına alanı belirler.
6. Subsarkolemmal bölgenin hemen altında görülebilen en dıştaki miyofibrilin uzunluğunu ölçmek için Segmentli Çizgi aracını kullanın (Şekil 2A).
   NOT: Bu uzunluk, yüzey alanı başına subsarkolemmal glikojeni eksprese etmek için kullanılır (yani, en dıştaki miyofibrilin uzunluğu, bölümün kalınlığı ile çarpılır (60 nm); bkz. adım 4.5). Bu nedenle, sadece bu uzunlukla temsil edilen subsarkolemmal bölge analize dahil edilir.
7. Kılavuz > Araçlarını Analiz Et>e tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alan Sayısı'nı 32.400 ^nm2 olarak ayarlayın. Bir çaprazın subsarkolemmal glikojene çarptığı 12 subsarkolemmal görüntüde mevcut uzunluktaki isabet sayısını sayın (Şekil 2A). Bir vuruş, bir haç sağ üst köşesinde bulunan bir glikojen parçacık olarak tanımlanır.
8. Kılavuz > Araçlarını Analiz > 'a tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alan Sayısı'nı 160.000 ^nm2 olarak ayarlayın. Bir çaprazın intramiyofibriler boşluğa çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın (Şekil 2B).
9. Izgara > Araçlarını Analiz Et>e tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alan Sayısı'nı 3.600 ^nm2 olarak ayarlayın. Bir çaprazın intramiyofibriler glikojene çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın (Şekil 2C).
10. Izgara > Araçlarını Analiz Et>e tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alan Sayısı'nı 32.400 ^nm2 olarak ayarlayın. Bir çaprazın intermiyofibriller glikojene çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın (Şekil 2D).
11. Düz Çizgi aracını kullanarak, lif başına havuz başına ortalama 60 parçacık elde etmek için 12 görüntünün her biri için her havuzun rastgele seçilmiş beş glikojen parçacığının çapını ölçün.
    NOT: 60 parçacığın ortalaması büyük ölçüde elyaf içindeki varyasyonu kapsar (Şekil 2F).

4. Hesaplamalar

1. Miyofibriller boşluk başına intramiyofibriller boşluğun görünür alan fraksiyonunu (_AA), tüm isabetlerin toplamının, 12 görüntüdeki tüm noktaların toplamına bölünmesiyle (adım 3.8'den itibaren) hesaplayın.
2. Miyofibriler alan başına intramiyofibriller glikojenin, miyofibriller alan başına intermiyofibriller glikojen ve görüntü alanı başına subsarkolemmal glikojenin görünür alan fraksiyonunu, tüm isabetlerin toplamının 12 görüntüdeki tüm noktaların toplamına bölünmesiyle hesaplayın (adım 3.7, 3.9 ve 3.10'dan).
3. Sırasıyla intramiyofibriller, intermiyofibriller ve subsarkolemmal glikojenin hacim fraksiyonunu (_VV), görünür alan fraksiyonu (_AA) eksi kesit kalınlığına (t) sahip yüzey yoğunluğu (_SV) ürünü olarak hesaplayın, burada yüzey yoğunluğu, parçacıkların ortalama parçacık yüzeyi ile çarpılan sayısal yoğunluğudur:
   _Vv = _AA - (1 / 4) · Sv · t
   nerede
   Sv (^μm-1) = _AA / ( (π · (((1 / 2) · H)²)) · (t + H))
   t = 0,06 μm
   H = parçacıkların ortalama çapı (μm)
   NOT: Hacim fraksiyonu, merkezleri dilimin dışında olan parçacıklardan gelen kapakların katkısı nedeniyle görünür alan fraksiyonundan daha ^{küçüktür25}.
4. İntramiyofibriller boşluk başına intramiyofibriller glikojeni eksprese etmek için, intramiyofibriller glikojenin alan fraksiyonunu (adım 4.2) intramiyofibriller boşluğun alan fraksiyonuna (adım 4.1) bölün. İntermiyofibriller glikojen bir önceki adımda hesaplandığı gibi miyofibriller boşluk başına eksprese edilir (adım 4.3).
5. Elyafın (_VS) yüzey alanı başına subsarkolemmal glikojeni eksprese etmek için (en dıştaki miyofibril), glikojenin hacim fraksiyonunu, görüntünün hacmi (alan ve kesit kalınlığının ürünü) ile çarparak ve kesit kalınlığı (t) ile ortalama mevcut uzunluktaki (adım 3.6'dan) ürüne bölünerek mutlak bir miktara dönüştürün.
6. Adım 4.1, 4.4 ve 4.5'teki değerleri kullanarak toplam hacimsel glikojen içeriğini aşağıdaki gibi tahmin edin:
   Myofibrillar glikojen= İntramiyofibriller glikojen + (intramiyofibriler glikojen · intramiyofibriller boşluğun alan fraksiyonu)
   Ortalama lif yarıçapının 40 ^μm27 olduğunu varsayarsak, hacim-yüzey oranı 20: 1'dir, bu nedenle toplam glikojen şudur:
   Toplam glikojen (_VV) = Myofibrillar glikojen + (subsarkolemmal glikojen (_VS) / 20)
   NOT: 20:1'lik hacim-yüzey oranı, gerçek lif boyutuna ve subsarkolemmal bölgenin boyutuna bağlı olarak fiberden elyafa değişebilir. Bu, mevcut protokolle dikkate alınmamaktadır.
7. Bundan, her havuzdan gelen göreceli katkı, toplam glikojenin fraksiyonları olarak hesaplanır:
   İnmiyofibriller glikojen / Toplam glikojen = İnmiyofibriller glikojen / Toplam glikojen
   İntramiyofibriller glikojen / Toplam glikojen = (İntramiyofibriller glikojen · intramiyofibriller boşluğun alan fraksiyonu) / Toplam glikojen
   Subsarkolemmal glikojen / Toplam glikojen = Subsarkolemmal glikojen / 20 / Toplam glikojen
8. Her bir glikojen havuzu için, görüntü sayısına (n), her görüntüdeki toplam haç sayısına (x) ve her görüntüde (y) ilgili havuzda glikojen çarpan haç sayısına bağlı olarak bir fiber düzeyinde glikojen tahmininin belirsizliğini ifade eden hata katsayısını (CE) aşağıdaki gibi ^{hesaplayın28}:
   CE = ^n-1 · ∑^x2 · (∑x) ^-2 + ∑^y2 · (∑y) ^-2 - 2∑(xy) · ∑^x-1 · ∑^y-1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, glikojen parçacıkları siyah ve farklı görünür (Şekil 1 ve Şekil 2). Glikojen normal değerleri Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu veriler, önceki farklı çalışmalarda toplanan 41 sağlıklı genç erkekten toplam 362 liflere dayanmaktadır19,24,29,30,31.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Yöntemin kritik adımı, fiksasyon sonrası sırasında potasyum ferrosiyanür ile indirgenmiş osmiyum kullanılmasıdır. Glikojen tespiti için bu modifiye fiksatifin seçiciliği kimya ile tam olarak açıklanamaz, ancak aynı zamanda glikojen içermediği bilinen dokularda veya hücre dışı boşlukta bu tür parçacıkların tespit edilmediğini gösteren deneysel bulguları da ^içerir11.

Kritik parametreler, tahminlerin hassasiyeti ve elyaftan elyafa varyasyond...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propylene oxide	Merck	75-56-9
Embedding 812 resin medium kit	Taab	T031
Glutaraldehyde solution 25%	Merck	1.04239.0250
ITEM	Olympus		Imaging software
Leica EM AC20	Leica		Automatic contrasting system
OSIS Veleta digital camera	Olympus
Osmium tetroxide 4% solution	Polysciences	0972A
Philips CM 100 Transmission EM	Philips
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate	Sigma-Aldrich	455989-245G
Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
Ultra-microtome Leica UC7	Leica
Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution	Leica	16707235
Uranyl acetate dihydrate	Polysciences	6159-44-0