Quantificazione della distribuzione subcellulare del glicogeno nelle fibre muscolari scheletriche mediante microscopia elettronica a trasmissione

Riepilogo

Una procedura post-fissazione modificata aumenta il contrasto delle particelle di glicogeno nei tessuti. Questo documento fornisce un protocollo passo-passo che descrive come gestire il tessuto, condurre l'imaging e utilizzare metodi stereologici per ottenere dati imparziali e quantitativi sulla distribuzione del glicogeno subcellulare specifico della fibra nel muscolo scheletrico.

Abstract

Con l'uso della microscopia elettronica a trasmissione, è possibile ottenere immagini ad alta risoluzione di campioni fissi contenenti singole fibre muscolari. Ciò consente di quantificare aspetti ultrastrutturali come frazioni di volume, rapporti superficie/volume, morfometria e siti di contatto fisico di diverse strutture subcellulari. Nel 1970, un protocollo per la colorazione migliorata del glicogeno nelle cellule è stato sviluppato e ha aperto la strada a una serie di studi sulla localizzazione subcellulare della dimensione delle particelle di glicogeno e glicogeno utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione. Mentre la maggior parte delle analisi interpreta il glicogeno come se fosse distribuito in modo omogeneo all'interno delle fibre muscolari, fornendo solo un singolo valore (ad esempio, una concentrazione media), la microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato che il glicogeno è immagazzinato come particelle di glicogeno discrete situate in compartimenti subcellulari distinti. Qui, viene descritto il protocollo passo-passo dalla raccolta dei tessuti alla determinazione quantitativa della frazione di volume e del diametro delle particelle del glicogeno nei distinti compartimenti subcellulari delle singole fibre muscolari scheletriche. Considerazioni su come 1) raccogliere e macchiare campioni di tessuto, 2) eseguire analisi di immagini e gestione dei dati, 3) valutare la precisione delle stime, 4) discriminare tra i tipi di fibre muscolari e 5) sono incluse insidie e limitazioni metodologiche.

Introduzione

Le particelle di glicogeno sono composte da polimeri ramificati di glucosio e varie proteine ^associate1 e costituiscono un combustibile importante durante le elevate richieste ^metaboliche2. Sebbene non ampiamente riconosciute, le particelle di glicogeno costituiscono anche un combustibile locale, dove alcuni processi subcellulari utilizzano preferenzialmente il glicogeno nonostante la disponibilità di altri e più combustibili di lunga durata come il glucosio plasmatico e gli acidi ^grassi3,4.

L'importanza di immagazzinare il glicogeno come combustibile localizzato specifico subcellulare è stata discussa in diverse ^revisioni5,6 basate principalmente su alcune delle prime documentazioni sulla distribuzione subcellulare del glicogeno mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)^7,8. I primi studi hanno utilizzato protocolli diversi per aumentare il contrasto del glicogeno dalle tecniche di colorazione istochimica alle colorazioni negative e ^positive9,10. Un importante sviluppo metodologico è stato il raffinato protocollo post-fissazione con l'osmio a ridotto ferrocianuro di potassio11,12,13,14, che ha migliorato significativamente il contrasto delle particelle di glicogeno. Questo protocollo raffinato non è stato utilizzato in alcuni dei lavori pionieristici sulla deplezione del glicogeno indotta dall'esercizio15, ma è stato reintrodotto da Graham e ^{colleghi16,17}.

Sulla base delle immagini a 2 dimensioni, la distribuzione subcellulare del glicogeno è più spesso descritta come particelle di glicogeno situate in tre pool: subsarcolemmale (appena sotto la membrana superficiale), intermiofibrillare (tra le miofibrille) o intramiofibrillare (all'interno delle miofibrille). Tuttavia, le particelle di glicogeno potrebbero anche essere descritte come associate, ad esempio, al reticolo sarcoplasmatico7 o ai ^nuclei18. Oltre alla distribuzione subcellulare, il vantaggio del contenuto di glicogeno stimato da TEM è anche che la quantificazione può essere condotta a livello di singola fibra. Ciò consente lo studio della variabilità da fibra a fibra e analisi correlative con tipi di fibre e componenti cellulari come mitocondri e goccioline lipidiche.

Qui, viene descritto il protocollo per il contenuto volumetrico specifico del tipo di fibra stimato TEM dei tre pool subcellulari comuni di glicogeno (subsarcolemmale, intermiofibrillare e intramiofibrillare) nelle fibre muscolari scheletriche. Il metodo è stato applicato ai muscoli scheletrici degli esseri ^umani19, ^ratti20 e topi21; così come uccelli e ^pesci22; e cardiomiociti da ^ratti23.

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Protocollo

Il presente protocollo che utilizza campioni di muscolo scheletrico bioptico umano è stato approvato dai Comitati regionali per l'etica della ricerca sanitaria per la Danimarca meridionale (S-20170198). Le biopsie muscolari sono state ottenute attraverso un'incisione nella pelle dal muscolo vasto laterale utilizzando un ago bergström con aspirazione dopo che l'anestesia locale è stata somministrata per via sottocutanea (1-3 ml di lidocaina 2% per incisione). Se sono stati utilizzati muscoli interi di ratto isolati, gli animali sono stati sacrificati dalla lussazione cervicale prima che le biopsie muscolari fossero ottenute, in conformità con le linee guida del comitato etico animale dell'ospedale universitario di Odense, in Danimarca.

1. Fissazione primaria, post-fissazione, incorporamento, sezionamento e contrasto

1. Preparare 1,6 mL di soluzione fissativa primaria (glutaraldeide al 2,5% in tampone cacodilato di sodio da 0,1 M (pH 7,3)) in un tubo di microcentrazione da 2 mL. Conservare a 5 °C per un massimo di 14 giorni.
2. Dalla biopsia muscolare o dal muscolo intero, isolare un piccolo campione, che ha un diametro massimo di 1 mm in qualsiasi direzione ed è un po 'più lungo nella direzione longitudinale della fibra rispetto alla sezione trasversale (ai fini dell'orientamento).
3. Posizionare il campione nel tubo contenente la soluzione di fissazione primaria fredda. Conservare a 5 °C per 24 ore.
4. Lavare il campione quattro volte (15 minuti tra ogni lavaggio) in un tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,3). Utilizzando pipette di trasferimento, rimuovere il buffer utilizzato dal tubo lasciando intatto il campione e successivamente aggiungere il buffer fresco.
   NOTA: Dopo il lavaggio finale, il campione può essere conservato nel tampone di cacodilato di sodio 0,1 M a 5 °C per diversi ^mesi11. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
5. Postfix con tetrossido di osmio (OsO4) all'1% e ferrocianuro di potassio all'1,5% (_K4Fe(CN)₆) in tampone cacodilato di sodio da 0,1 M (pH 7,3) per 120 min a 4 °C.
   NOTA: L'uso dell'1,5% di ferrocianuro di potassio (_K4Fe(CN)₆) è essenziale per un contrasto ottimale delle particelle di glicogeno11,12,13.
6. Risciacquare due volte in acqua a doppia distillazione a temperatura ambiente (RT).
7. Disidratare immergendosi in una serie graduata di alcol (etanolo) a RT utilizzando le seguenti concentrazioni: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) e 100% (10 min).
   NOTA: In ogni fase, il campione viene immerso in etanolo, che viene successivamente rimosso solo parzialmente per evitare l'essiccazione del campione. Infine, l'etanolo rimanente viene scartato.
8. Infiltrare con miscele graduate di ossido di propilene e resina epossidica a RT utilizzando i seguenti rapporti di volume (ossido di propilene/resina epossidica): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (durante la notte). Il giorno seguente, incorporare campioni in resina epossidica fresca al 100% in stampi e polimerizzare a 60 °C per 48 ore.
   NOTA: questo metodo graduato è conforme ai protocolli ^{precedenti11,12}. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
9. Tagliare sezioni ultrasottili (60-70 nm) di fibre orientate longitudinalmente e raccoglierle su griglie di rame a un foro come segue.
   1. Montare il blocco di un campione sul supporto dell'ultramicrotoma.
   2. Tagliare il blocco sulla superficie con una lama di rasoio per raggiungere il livello del tessuto.
   3. Montare un coltello diamantato (ultracut 45) davanti al campione e allineare la superficie del campione parallelamente al coltello.
   4. Produrre una sezione semisottile (1 μm) con il coltello diamantato per controllare l'orientamento del campione. Macchiare la sezione semisottile con toluidina blu per l'osservazione con microscopia ottica.
   5. Tagliare ulteriormente il blocco per ridurre l'area di interesse al fine di ottenere sezioni ultrasottili adeguate.
   6. Tagliare sezioni ultrasottili (60-70 nm) con un secondo coltello a diamante (ultrataglio 45).
   7. Raccogli 1-2 sezioni su griglie di rame a un foro usando un Perfect Loop.
      NOTA: la griglia di rame a un foro ha un singolo foro nel mezzo con membrana di supporto Formvar.
10. Contrasta le sezioni con acetato di uranile e citrato di piombo immergendo le griglie di cui sopra in soluzione di acetato di uranile (0,5% in acqua a doppia distillazione) per 20 minuti, e poi in soluzione di citrato di piombo (1% in acqua a doppia distillazione) per 15 minuti. Lavare le griglie in acqua a doppio distillato tra e dopo le due macchie.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Imaging

1. Accendere il microscopio elettronico a trasmissione (azionato a una tensione di accelerazione di 80 kV), il computer e il software di registrazione delle immagini. Registra immagini digitali con una telecamera CCD digitale a scansione lenta 2 k x 2 k e il software di imaging associato.
2. Inserire la griglia con più sezioni nella fase del microscopio.
3. Schermare la griglia inizialmente a basso ingrandimento (ad esempio, x100) per determinare la qualità delle sezioni (ad esempio, fori nella membrana di supporto, detriti, ecc.) e scegliere le sezioni di migliore qualità. A basso ingrandimento, determinare la direzione delle fibre muscolari.
4. Quindi, aumentare l'ingrandimento con il raggio centrato su una fibra periferica nella sezione. Focalizza l'immagine con un ingrandimento superiore a 30 k per garantire dettagli precisi sufficienti nell'immagine, guidati da una trasformazione di Fourier veloce in tempo reale, se disponibile. Infine, registra immagini con un tempo di esposizione di 1 s all'ingrandimento desiderato.
5. Acquisire un totale di 24 immagini di una fibra selezionata casualmente, cioè 12 immagini dello spazio miofibrillare e 12 immagini dello spazio subsarcolemmale, con un ingrandimento compreso tra 10 k e 40 k. Assicurarsi che le immagini siano distribuite su tutta la lunghezza e la larghezza della fibra in un ordine randomizzato ma sistematico per ottenere risultati imparziali (Figura 1A).
   NOTA: l'ingrandimento ottimale dipende dalla risoluzione della fotocamera disponibile e dalle dimensioni delle micrografie. L'obiettivo è raggiungere una risoluzione finale, in cui i diametri delle particelle di glicogeno possono essere misurati entro passi di 1 nm, e includere un'area totale della regione miofibrillare di almeno 70 ^μm2 e una lunghezza totale della fibra di almeno 25 μm distribuita in 12 immagini dello spazio miofibrillare e 12 immagini dello spazio subsarcolemmale per fibra, rispettivamente. Le 24 immagini per fibra daranno molto probabilmente una precisione (coefficiente di errore) del contenuto volumetrico dei diversi pool di glicogeno tra 0,1 e 0,2 in singole fibre di muscoli scheletrici umani, ratti e topi20,21,24 (Figura 2E).
6. Ripetere i passaggi 2.4 e 2.5 fino a ottenere un'immagine totale di 6-10 fibre. Se necessario, tagliare sezioni aggiuntive (separate da almeno 150 μm per evitare sovrapposizioni di fibre già fotografate) e ripetere i passaggi 1,9-2,5.

3. Analisi delle immagini

1. Importa le immagini in ImageJ facendo clic su File > Apri.
2. Imposta la scala globale in modo che corrisponda alle dimensioni originali dell'immagine facendo clic su Analizza > Imposta scala.
3. Ingrandisci al 100% facendo clic su Immagine > Zoom > In.
4. Misurare lo spessore di un disco Z per immagine dello spazio miofibrillare (12 per fibra) utilizzando lo strumento Linea retta dal menu Strumenti (Figura 1D). Calcola lo spessore medio del disco Z di ciascuna delle 6-10 fibre.
5. Definisci 2-3 fibre con il disco Z medio più spesso come fibre di tipo 1 e 2-3 fibre con il disco Z medio più sottile come fibre di tipo 2. Ignorare le fibre intermedie 2-4 per ulteriori analisi (Figura 1E).
   NOTA: i seguenti passaggi vengono ripetuti per ciascuna delle 4-6 fibre del campione. Le frazioni volumetriche di glicogeno sono stimate per punto contando come descritto ^altrove25,26. La dimensione delle griglie viene scelta per ottenere una soddisfacente alta precisione delle stime. Questo è spesso ottenuto raggiungendo 250 colpi, che quindi dettano il numero totale di punti necessari e, a sua volta, l'area per punto.
6. Utilizzare lo strumento Linea segmentata per misurare la lunghezza della miofibrilla più esterna visibile appena sotto la regione subsarcolemmale (Figura 2A).
   NOTA: Questa lunghezza viene utilizzata per esprimere glicogeno subsarcolemmale per area superficiale (cioè la lunghezza della miofibrilla più esterna moltiplicata per lo spessore della sezione (60 nm); vedere punto 4.5). Pertanto, solo la regione subsarcolemmale, che è rappresentata da questa lunghezza, è inclusa nell'analisi.
7. Inserire una griglia facendo clic su Analizza strumenti > > griglia e impostare Area per punto su 32.400 ^nm2. Contare il numero di hit entro la lunghezza disponibile nelle 12 immagini subsarcolemmali, dove una croce colpisce il glicogeno subsarcolemmale (Figura 2A). Un colpo è definito come una particella di glicogeno presente nell'angolo in alto a destra di una croce.
8. Inserire una griglia facendo clic su Analizza > Strumenti > Griglia e impostare Area per punto su 160.000 ^nm2. Contare il numero di hit nelle 12 immagini miofibrillari, dove una croce colpisce lo spazio intramiofibrillare (Figura 2B).
9. Inserire una griglia facendo clic su Analizza strumenti > > griglia e impostare Area per punto su 3.600 ^nm2. Conta il numero di colpi nelle 12 immagini miofibrillari, dove una croce colpisce il glicogeno intramiofibrillare (Figura 2C).
10. Inserire una griglia facendo clic su Analizza > Strumenti > Griglia e impostare Area per punto a 32.400 ^nm2. Conta il numero di colpi nelle 12 immagini miofibrillari, dove una croce colpisce il glicogeno intermiofibrillare (Figura 2D).
11. Utilizzando lo strumento Linea retta , misurare il diametro di cinque particelle di glicogeno scelte casualmente di ciascun pool per ciascuna delle 12 immagini per ottenere una media di 60 particelle per pool per fibra.
    NOTA: La media di 60 particelle copre in gran parte la variazione all'interno della fibra (Figura 2F).

4. Calcoli

1. Calcola la frazione di area apparente (_AA) dello spazio intramiofibrillare per spazio miofibrillare come somma di tutti i colpi divisa per la somma di tutti i punti delle 12 immagini (dal passo 3.8).
2. Calcola la frazione dell'area apparente del glicogeno intramiofibrillare per area miofibrillare, glicogeno intermiofibrillare per area miofibrillare e glicogeno subsarcolemmale per area dell'immagine come somma di tutti i colpi divisa per la somma di tutti i punti delle 12 immagini (dai passaggi 3.7, 3.9 e 3.10).
3. Calcola la frazione volumetrica (_VV) del glicogeno intramiofibrillare, intermiofibrillare e subsarcolemmale, rispettivamente, come frazione di area apparente (_AA) meno il prodotto della densità superficiale (_SV) con spessore di sezione (t), dove la densità superficiale è la densità numerica delle particelle moltiplicata per la superficie media delle particelle:
   _Vv = _AA - (1 / 4) · _Sv · t
   dove
   _Sv (^μm-1) = _AA / ( (π · (((1 / 2) · H)²)) · (t + H))
   t = 0,06 μm
   H = diametro medio delle particelle (μm)
   NOTA: La frazione volumetrica è più piccola della frazione di area apparente a causa del contributo di tappi da particelle con il loro centro al di fuori della ^fetta25.
4. Per esprimere glicogeno intramiofibrillare per spazio intramiofibrillare, dividere la frazione di area del glicogeno intramiofibrillare (fase 4.2) per la frazione di area dello spazio intramiofibrillare (fase 4.1). Il glicogeno intermiofibrillare è espresso per spazio miofibrillare come calcolato nella fase precedente (fase 4.3).
5. Per esprimere glicogeno subsarcolemmale per superficie della fibra (_VS) (miofibrilla più esterna), convertire la frazione volumetrica del glicogeno in una quantità assoluta moltiplicando per il volume dell'immagine (prodotto di area e spessore della sezione) e dividendo per il prodotto di lunghezza media disponibile (dal punto 3.6) con lo spessore della sezione (t).
6. Stimare il contenuto volumetrico totale di glicogeno utilizzando i valori dei passaggi 4.1, 4.4 e 4.5, come segue:
   Glicogeno miofibrillare = Glicogeno intermiofibrillare + (glicogeno intramiofibrillare · frazione dell'area dello spazio intramiofibrillare)
   Assumendo un raggio medio della fibra di 40 ^μm27, il rapporto volume/superficie è 20:1, quindi il glicogeno totale è:
   Glicogeno totale (_VV) = Glicogeno miofibrillare + (glicogeno subsarcolemmale (_VS) / 20)
   NOTA: il rapporto volume/superficie di 20:1 può variare da fibra a fibra a seconda delle dimensioni effettive della fibra e delle dimensioni della regione subsarcolemmale. Questo non è preso in considerazione con il presente protocollo.
7. Da questo, il contributo relativo di ciascun pool è calcolato come frazioni di glicogeno totale:
   Glicogeno intermiofibrillare / Glicogeno totale = Glicogeno intermiofibrillare / Glicogeno totale
   Glicogeno intramiofibrillare / Glicogeno totale = (Glicogeno intramiofibrillare · frazione di area dello spazio intramiofibrillare) / Glicogeno totale
   Glicogeno subsarcolemmale / Glicogeno totale = Glicogeno subsarcolemmale / 20 / Glicogeno totale
8. Per ogni pool di glicogeno, calcolare il coefficiente di errore (CE), che esprime l'incertezza della stima del glicogeno a livello di fibra, in base al numero di immagini (n), al numero totale di incroci in ciascuna immagine (x) e al numero di incroci che colpiscono il glicogeno nel pool pertinente in ciascuna immagine (y) come ^segue28:
   CE = ^n-1 · ∑^x2 · (∑x) ^-2 + ∑^y2 · (∑y) ^-2 - 2∑(xy) · ∑^x-1 · ∑^-1

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Risultati

Utilizzando questo protocollo, le particelle di glicogeno appaiono nere e distinte (Figure 1 e Figura 2). I valori normali del glicogeno sono rappresentati nella Figura 3. Questi dati si basano su un totale di 362 fibre di 41 giovani uomini sani come raccolto in diversi studi precedenti19,24,29,30,31.^...

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Discussione

Il passaggio critico del metodo è l'uso di osmio ridotto da ferrocianuro di potassio durante la post-fissazione. La selettività di questo fissativo modificato per il rilevamento del glicogeno non può essere completamente spiegata dalla chimica, ma include anche risultati sperimentali che dimostrano che non è stata rilevata alcuna particella in tessuti noti per essere privi di glicogeno o nello spazio ^{extracellulare11}.

I parametri critici sono la precisione delle sti...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propylene oxide	Merck	75-56-9
Embedding 812 resin medium kit	Taab	T031
Glutaraldehyde solution 25%	Merck	1.04239.0250
ITEM	Olympus		Imaging software
Leica EM AC20	Leica		Automatic contrasting system
OSIS Veleta digital camera	Olympus
Osmium tetroxide 4% solution	Polysciences	0972A
Philips CM 100 Transmission EM	Philips
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate	Sigma-Aldrich	455989-245G
Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
Ultra-microtome Leica UC7	Leica
Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution	Leica	16707235
Uranyl acetate dihydrate	Polysciences	6159-44-0