İmmünkompetan Farelerin Beyinde Non-invaziv Transnazal Yolla İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Mikroglia Transplantasyonu

Özet

Burada sunulan protokol, immünkompetan farelerde transnazal bir yolla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikrogliasının (iPSMG) beyne transplantasyonuna izin verir. Hücrelerin hazırlanması ve transnazal transplantasyonu ve iPSMG'nin idamesi için sitokin karışımının uygulanması yöntemi gösterilmiştir.

Özet

Mikroglia, beynin makrofaj benzeri hücrelerinin uzmanlaşmış popülasyonudur. Hem fizyolojik hem de patolojik beyin fonksiyonlarında önemli roller oynarlar. Mevcut mikroglia anlayışımızın çoğu, farede yapılan deneylere dayanmaktadır. İnsan mikrogliası, fare mikrogliasından farklıdır ve bu nedenle fare mikrogliasının tepkisi ve özellikleri her zaman insan mikrogliasınınkini temsil etmeyebilir. Ayrıca, etik ve teknik zorluklar nedeniyle, insan mikrogliası üzerine yapılan araştırmalar, mikroglia'nın in vivo özelliklerini kapitüle etmeyen in vitro kültür sistemi ile sınırlıdır. Bu sorunların üstesinden gelmek için, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikrogliasını (iPSMG), koloni uyarıcı faktör 1 reseptörü (CSF1R) antagonisti kullanarak endojen mikroglia'nın farmakolojik tükenmesi ile kombinasyon halinde bir transnazal yolla immünkompetan farelerin beynine invaziv olmayan bir şekilde nakledilmesi için basitleştirilmiş bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokol, hücreleri invaziv olmayan bir şekilde fare beynine nakletmek için bir yol sağlar ve bu nedenle insan mikrogliasının fizyolojik ve patolojik beyin fonksiyonlarındaki in vivo rolünü değerlendirmek için değerli olabilir.

Giriş

Mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) makrofaj benzeri hücrelerin uzmanlaşmış bir popülasyonudur ve nöral devre gelişimi, nörotransmisyonun modüle edilmesi ve beyin homeostazının^{sürdürülmesi} gibi çeşitli beyin fonksiyonlarının kontrolünde önemli roller oynar ^1,2,3. Murin mikroglia, insanlardan gelenlerle birçok işlevi paylaşmasına rağmen, türe özgü farklılıklar gösterir. Bu nedenle, fare mikrogliasının çeşitli uyaranlara tepkisi her zaman insan mikroglia ^{4,5,6'nınkini} temsil etmeyebilir. Birçok çalışma insan mikrogliasını analiz etmiş olsa da, bu deneyler in vitro çalışmalarla sınırlıdır. İn vitro kültürlü insan mikrogliası, in vivo olanlardan çok farklı morfolojik özellikler ve gen ekspresyonu gösterir. Bu nedenle, in vitro deneyler her zaman insan mikrogliasının in vivo özelliklerini teslim etmeyebilir. Bu nedenle, insan mikrogliasını in vivo olarak incelemek için deneysel bir sisteme ihtiyaç vardır.

Son zamanlarda, insan mikrogliasının in vivo özelliklerini incelemek için, in vitro olarak üretilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) - veya embriyonik kök hücrelerden türetilmiş insan mikrogliaları cerrahi olarak farelerin beynine^nakledilir 7,8,9,10,11,12,13,14. Bu yaklaşımı kullanarak, insan mikrogliasının çeşitli in vivo özellikleri karakterize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin yaygın kullanımı iki nedenden dolayı sınırlıdır. Birincisi, bağışıklık eksikliği olan farelerin gerekliliğidir. Bu nedenle, insan mikrogliasının çeşitli nörodejeneratif hastalıklardaki rolünü incelemek için, hastalık mutasyonu taşıyan farelerin, önemli zaman ve çaba gerektiren bağışıklık eksikliği olan farelere geçmesi gerekir. Ayrıca, çeşitli nörolojik bozukluklarda, T hücreleri gibi periferik bağışıklık hücreleri, mikroglial fonksiyonları modüle edebilir^15,16,17. Bu nedenle, bağışıklık eksikliği olan farelerde yapılan deneyler, insan mikrogliasının in vivo olarak iyi niyetli özelliklerini temsil etmeyebilir. İkincisi, mikroglia nakli için invaziv ameliyatlar ek ekipman ve eğitim gerektirir. Ayrıca, invaziv transplantasyon sırasında beyin hasarı mikroglial fenotipleri değiştirebilir.

Bu protokolde, iPSMG'nin immünkompetan vahşi tip farelere non-invaziv transnazal transplantasyonu (Tsn) tanımlanmıştır¹⁸. Endojen fare mikroglia¹⁹ ve Tsn'yi tüketen bir CSF1R antagonisti PLX5622'nin farmakolojik AÇIK / KAPALI kombinasyonunu birleştiren iPSMG, fare beynine invaziv olmayan bir şekilde nakledilebilir. Ayrıca, eksojen insan sitokinin uygulanmasıyla, nakledilen iPSMG, herhangi bir immünosüpresan olmadan bölgeye özgü bir şekilde 60 gün boyunca canlı kalır.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar, Japonya Fizyoloji Derneği²⁰ tarafından yayınlanan "Fizyolojik Bilimler Alanında Hayvanların Bakımı ve Kullanımında Yol Gösterici İlkeler" e uygun olarak ve Yamanashi Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi'nin daha önce onayı ile elde edilmiş, barındırılmış, bakımı yapılmış ve kullanılmıştır (Yamanashi, Japonya).

1. Hücre ortamı, transplantasyon ortamı ve anestezi karışımının hazırlanması

1. DMEM'e %10 fetal sığır serumu ve %0.1 penisilin/streptomisin ekleyerek hücre ortamını hazırlayın.
2. Hücre ortamına hCSF1 (250 ng/mL) ve hTGF-β1 (100 ng/mL) ekleyerek transplantasyon ortamını hazırlayın.
3. Anestezi karışımını intraperitoneal enjeksiyon için 0.45 mL medetomidin hidroklorür, 1.2 mL midazolam ve 1.5 mL butorphanol tartarat 11.8 mL normal salin içinde karıştırarak hazırlayın.

2. iPSMG'nin hazırlanması

NOT: Dondurulmuş iPSMG (Malzeme Tablosu) kullanıma kadar -80 °C'de tutulmuştur.

1. Donmuş hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözün. Tüm görünür buzlar eriyene kadar örnekleri döndürün.
2. Çözülmüş iPSMG'yi 37 °C'ye ısıtılmış kültür ortamına ekleyin. Kültür ortamının 10 mL'sine ortam içeren 1 mL çözülmüş hücre (1 × 10⁶ hücre) ekleyin.
3. Bir hücre peleti elde etmek için hücreleri 300 x g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
4. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini rahatsız etmeden tüm süpernatantları çıkarın. Transplantasyon ortamındaki sitokin konsantrasyonunun seyreltilmesini azaltmak için süpernatantın tamamen çıkarılması arzu edilir.
5. 1 x 10⁵ hücre/μL'lik bir hücre konsantrasyonu elde etmek için transplantasyon ortamını ekleyin.
6. İPSMG'yi buzun üzerine yerleştirin ve hemen transplantasyona devam edin.
   NOT: Transplantasyon için iPSMG hazırlanması, kontaminasyonu önlemek için temiz bir tezgahta gerçekleştirilir.

3. Transnazal transplantasyon için farenin hazırlanması (Tsn)

1. Vahşi tip erkek fareleri (C57BL / 6J, 8 haftalık) 7 gün boyunca PLX5622 içeren diyetle besleyin.
2. 7. günün sonunda, PLX diyetini durdurun ve fareleri çalışmanın sonuna kadar normal bir diyetle besleyin^.
   NOT: PLX5622 içeren diyet, 1 kg AIN-93G'ye (Malzeme Tablosu) 1.2 g PLX5622 eklenerek hazırlanır.

4. Transnazal hücre nakli

1. PLX beslemesinin kesilmesinden 24 saat sonra, fareleri tartın ve anestezi karışımının intraperitoneal enjeksiyonunu (0.2 mL / 20 g) kullanarak anestezi yapın.
2. Fareler, pedal çekme refleksine (sert ayak parmağı sıkışması) yanıt vermeme ile değerlendirildiği gibi tamamen uyuşturulduktan sonra, burun mukozasının geçirgenliğini arttırmak için 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak her burun deliğine iPSMG'nin Tsn'sinden önce 1 saatte PBS'de (100 U / mL) 2.5 μL hyaluronidaz uygulayın.
3. Hyaluronidaz uygulamasından sonra, fareleri sırtüstü pozisyona getirin.
4. iPSMG'nin transnazal transplantasyonundan 10 dakika önce adım 4.2'yi tekrarlayın.
5. 10 μL'lik pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2,5 μL hücre süspansiyonu uygulayın.
6. Diğer burun deliğine hücre süspansiyonu uygulanmadan önce fareyi 5 dakika boyunca sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
7. 4,5 ve 4,6 numaralı adımları dört kez tekrarlayın ve hayvan başına toplam 20 μL hacim uygulayın.
8. Anesteziden kurtulana kadar fareyi 37 °C'lik bir ısı yastığına sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
9. PLX beslemesinin kesilmesinden 48 saat sonra, aynı farelerde 4.1-4.7 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
   NOT: Transplantasyon sırasında iPSMG'nin buz üzerine yerleştirildiğine dikkat edilmelidir.

5. Sitokinlerin uygulanması

1. Fareleri intraperitoneal anestezi karışımı enjeksiyonu (0.2 mL / 20 g) ile anestezi altına alın.
2. 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak nakil ortamının 2,5 μL'sini farenin bir burun deliğine uygulayın.
3. Transplantasyon ortamını diğer burun deliğine uygulamadan önce fareyi 5 dakika boyunca sırtüstü pozisyonda tutun.
4. 5,2 ve 5,3 numaralı adımları dört kez yineleyin ve hayvan başına toplam 20 μL hacim uygulayın.
   NOT: Transplantasyon ortamının (insan sitokinleri) transnazal uygulamasının, transplante edilen iPSMG'nin çalışmanın sonuna kadar yaşayabilirliği için her 12 saatte bir gerekli olduğu unutulmamalıdır.

Sonuçlar

Bu teknik, araştırmacının iPSMG'yi hipokampus ve beyinciğe, ancak fare beyninin korteksine invaziv olmayan bir şekilde nakletmesini sağlar. Çalışmayı tamamladıktan sonra, anestezi uygulanan fareler buz gibi soğuk PBS'nin (-) transkardiyal perfüzyonuna maruz bırakıldı, bunu PBS'de buz soğuk% 4 (w / v) paraformaldehit izledi. Beyinler izole edildi,% 4 (w / v) paraformaldehit içinde gece boyunca sabitlendi ve% 30 (w / v) sakkaroz içeren bir PBS'de kriyo-korunaklı hale getirildi. Ayrıca, beyinler gömme bileşiğinde donduruldu ve bir kriyostat üzerinde kesitlendi (20 μm kalınlığında koronal bölümler). Kesitler PBS(-) (her biri 10 dakika) içinde üç kez yıkandı ve geçirgenleştirildi ve 1 saat boyunca %10 normal keçi serumunda %0.5 (v/v) Triton X-100 ile bloke edildi. Kesitler daha sonra 5 gün boyunca anti-insana özgü sitoplazma belirteci, STEM121 (1:100) ve anti Iba1 (1:1000) ile inkübe edildi. Daha sonra, bölümler her biri 10 dakika boyunca PBS (-) ile üç kez yıkandı ve ikincil antikorlarla inkübe edildi: Alexa Fluor 488- veya 546 konjuge fare veya tavşan IgGs (1:1000) oda sıcaklığında 2 saat boyunca. PBS(-) ile üç kez yıkandıktan sonra kesitler antifade montaj ortamı kullanılarak kızaklara monte edilmiştir. Floresan görüntüleri elde etmek için 40x objektif lens ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanıldı. Transplantasyondan 2 ay sonra hipokampus ve kortekste iPSMG'nin yaşayabilirliği Şekil 1'de gösterilmiştir. Nakledilen hücrelerin sayısı, hem insana özgü antikorlar hem de pan-mikroglial / monosit belirteçleri için pozitif olan hücrelerin sayılmasıyla belirlenebilirken, endojen fare mikrogliası pan-mikroglial / monosit belirteci için pozitiftir sadece daha önce tarif edildiği gibi¹⁸. Nakledilen iPSMG'ler fare mikrogliasının yerini alır, hipokampusta ramifiye morfolojiler gösterir ve kortekste tespit edilmez¹⁸.

Şekil 1: Tsn'den 2 ay sonra korteks ve hipokampusta iPSMG'nin yaşayabilirliği. Sol panelde pan-mikroglial/monosit belirteci Iba1 (yeşil) ile immün boyama görülmektedir. Orta panel, insana özgü sitoplazma belirteci STEM121 (kırmızı) ile immün boyama gösterir. Sağ panel, Iba1 ve STEM121 immün boyamasının birleştirilmiş bir görüntüsünü gösterir. (A) Kontrol farelerinde hem kortekste hem de hipokampusta sadece fare mikrogliası (Iba1+/STEM121-) tespit edildi. (B) iPSMG nakledilen farelerde, kortekste sadece fare mikrogliası (Iba1 + / STEM121^-) tespit edilirken, hipokampusta iPSMG (Iba1 + / STEM121 ⁺) tespit edildi. Görüntüdeki oklar fare mikroglia'sını gösterirken, ok uçları iPSMG'yi göstermektedir. Floresan görüntü elde etmek için 40x objektif lens ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanıldı. Maksimum resim boyutu: 1024 x 1024 piksel. Yakınlaştırma faktörü: 2. Ölçek çubukları = 50 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Buradaki protokol, iPSMG'nin fare beynine non-invaziv transplantasyonunu açıklamaktadır. Mevcut protokolün benzersizliği, farmakolojik PLX ON / OFF yöntemlerini ve intranazal transplantasyonu birleştirerek, iPSMG'nin immünkompetan fare beynine invaziv olmayan bir şekilde nakledilebilmesidir. Nakledilen iPSMG, hipokampus ve beyincikteki mikroglia'nın çoğunluğunu, boş nişi 60 güne kadar işgal ederek oluşturdu, ancak kortekste değil.

iPSMG'nin verimli Tsn'si için kritik noktalar (i) endojen fare mikrogliasının tükenme verimliliği (ii) her 12 saatte bir insan sitokinlerinin uygulanmasıdır. Mikroglia beyinde kendi bölgelerini korur. Transplante edilen iPSMG'nin engraftasyonu için bir niş sağlamak için fare mikrogliasının verimli bir şekilde tükenmesi gerekir. Endojen fare mikrogliasının tükenmesi yetersiz olduğunda, fare hipokampusunun ve beyinciğin iPSMG tarafından kolonizasyonu gözlenmez. Mikroglia'nın yaşayabilirliği CSF1R ve TGFBR sinyallerinin^19,21,22'ye bağlıdır. hCSF1'in insan mikrogliasının canlılığını seçici olarak arttırdığı bildirilmiştir ve hTGF-β1, mikroglia'nın yaşayabilirliği için gereklidir ve her 12 saatte bir^21,23,24 uygulandığında iltihabı azaltır. Eksojen insan sitokinlerinin yokluğunda, iPSMG fare beyninde gözlenmez. Ayrıca, iPSMG'yi aşırı pipetleme veya Tsn'den önce başka herhangi bir yolla mekanik olarak aktive etmemeye özen gösterilmelidir, çünkü iPSMG özelliklerini ve transplantasyon verimliliğini geri dönülmez bir şekilde değiştirir. İPSMG'nin tatmin edici Tsn'si görülmezse, transplantasyondan önce iPSMG'nin yaşayabilirliği ve endojen mikroglianın tükenmesi belirlenmelidir. Endojen fare mikrogliasının tükenmesi% 90'dan fazla değilse, PLX5622 besleme süresi tükenmeyi arttırmak için değiştirilebilir.

İnvaziv olan ve ek ekipman ve eğitim gerektiren geleneksel bir cerrahi transplantasyon yöntemiyle karşılaştırıldığında, Tsn invaziv olmayan, basit, stabil ve kolay bir şekilde transplantasyona izin verir. Ek olarak, bu yöntem iPSMG'nin immünokompetan farelerin beyinlerine transplantasyonuna izin verir; Böylece, immünkompetan hastalık modeli fareler iPSMG'nin yanıtını incelemek için kullanılabilir.

Mevcut yöntemin en büyük dezavantajı, iPSMG'nin engraftasyonundaki bölgesel heterojenliktir. Beyin bölgesine özgü iPSMG transplantasyonu gerekiyorsa, nakledilen iPSMG 60 gün boyunca sadece hipokampus ve beyincikte aşılanmış kaldığı, ancak kortekste olmadığı için mevcut protokol uygun değildir. Ayrıca, eksojen insan sitokinlerinin her 12 saatte bir intranazal olarak uygulanması ihtiyacı, yoğun emek gerektirdiği ve pahalı olduğu için mevcut protokolün bir sınırlamasıdır.

Sonuç olarak, iPSMG'nin Tsn'si için immünokompetan farelerin beyinlerine ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. PLX5622 tarafından fare mikrogliasının farmakolojik AÇIK / KAPALI ile birleştirildiğinde, bu protokol iPSMG'nin başarılı bir şekilde aşılanmasını sağlar. Ekzojen sitokinler uygulandığında nakledilen hücreler hipokampus ve beyincikte sürekli bir süre gözlemlenebildiğinden, mevcut yöntem insan mikrogliasının bu bölgelerdeki hem fizyolojik hem de patolojik durumlardaki rolünü değerlendirmek için değerli olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
Anti-Iba1 antibody	FUJIFILM	019–19741
Anti-STEM121 antibody	Takara Bioscience	Y40410
Butorphanol tartrate	Kyoritsu Seiyaku	8019
Confocal microscope	Olympus	FV1200
Fetal bovine serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
Frozen iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Laboratory for Drug Discovery and Disease Research
Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506
Medetomidine hydrochloride	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldehyde	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipette	Eppendorf	3120000011
Pipette tip	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Transforming growth factor-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10	antifade mounting medium