Dinamik Hücre Kültürü için Çıkış Fraksiyonasyonu ile Entegre Çok Akışlı Perfüzyon Biyoreaktörü

Özet

Bu yazıda, hücresel proseslerde çözünenlerin sekresyon dinamiklerini ve absorpsiyon oranlarını ölçmek için düşük maliyetli, çok kanallı bir perfüzyon hücre kültürü sistemi kurmak ve çalıştırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Sistem ayrıca hücreleri dinamik uyaran profillerine maruz bırakabilir.

Özet

Bazı hücre ve doku fonksiyonları, geleneksel kültür sistemleri tarafından zayıf bir şekilde çözülen dakikalar ila saatler arasındaki dinamik zaman ölçeği içinde çalışır. Bu çalışma, kültür ortamının sürekli olarak bir hücre kültürü modülüne perfüze edilmesini ve bu ölçekteki dinamikleri ölçmek için bir aşağı akış modülünde fraksiyone edilmesini sağlayan düşük maliyetli bir perfüzyon biyoreaktör sistemi geliştirmiştir. Sistem neredeyse tamamen ticari olarak temin edilebilen parçalardan inşa edilmiştir ve aynı anda geleneksel çok kuyulu hücre kültürü plakalarında bağımsız deneyler yapmak için paralelleştirilebilir. Bu video makalesinde, yalnızca tek bir çok kanallı şırınga pompası ve paralel olarak altı kültüre kadar perfüze etmek için modifiye edilmiş bir fraksiyon kolektörü gerektiren taban kurulumunun nasıl monte edileceği gösterilmektedir. Modüler tasarımdaki yararlı varyantlar, çözünen darbeler veya farmakokinetik benzeri profiller gibi kontrollü stimülasyon dinamiklerine izin veren de sunulmaktadır. Daha da önemlisi, çözünen sinyaller sistemden geçerken, çözünmüş dağılım nedeniyle bozulurlar. Ayrıca, perfüzyon kurulumunun bileşenlerinin ikamet süresi dağılımlarını (RTD'ler) MATLAB kullanarak bir izleyici ile ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. RTD'ler, çözünen sinyallerin çok bölmeli sistemdeki akış tarafından nasıl bozulduğunu hesaplamak için kullanışlıdır. Bu sistem son derece sağlam ve tekrarlanabilir, bu nedenle temel araştırmacılar özel üretim tesislerine ihtiyaç duymadan kolayca benimseyebilirler.

Giriş

Birçok önemli biyolojik süreç, hücre ve doku kültürlerinde dakikalar ila saatler^{arasında 1,2,3} zaman ölçeğinde gerçekleşir. Bu fenomenlerin bazıları hızlandırılmış mikroskopi⁴, biyolüminesans¹ veya diğer yöntemler kullanılarak otomatik bir şekilde gözlemlenebilir ve kaydedilebilirken, kimyasal analiz için kültür süpernatant örneklerinin toplanmasını içeren deneyler genellikle statik hücre kültürlerinde manuel olarak gerçekleştirilir. Manuel örnekleme, sık veya mesai saatleri dışında örnekleme zaman noktalarının rahatsızlığı nedeniyle belirli çalışmaların fizibilitesini sınırlar. Statik kültür yöntemlerinin diğer eksiklikleri, kimyasal uyaranlara kontrollü, geçici maruziyetleri içeren deneyleri içerir. Statik kültürlerde, uyaranlar manuel olarak eklenmeli ve çıkarılmalıdır ve uyaran profilleri zaman içindeki adım değişiklikleriyle sınırlıdır, orta değişiklikler de hücreleri kontrolsüz bir şekilde etkileyebilecek diğer ortam bileşenlerini ekler ve kaldırır⁵. Akışkan sistemler bu zorlukların üstesinden gelebilir, ancak mevcut cihazlar başka zorluklar da doğurur. Mikroakışkan cihazlar, özel ekipmanın ve üretim ve kullanım eğitiminin engelleyici maliyetleri ile birlikte gelir, numuneleri işlemek için mikroanalitik yöntemler gerektirir ve perfüzyon^6'dan sonra hücrelerin cihazlardan kurtarılması zordur. Burada açıklanan^deney türleri için birkaç makroakışkan sistem oluşturulmuştur ^7,8,9,10 ve bunlar şirket içinde yapılan birden fazla özel parçadan yapılmıştır ve birden fazla pompa veya fraksiyon toplayıcı gerektirir. Ayrıca, yazarlar, biyoüretim için yararlı olan, ancak fizyolojiyi modellemek ve incelemek için tasarlanmamış, süspansiyon kültürü için karıştırılmış tank biyoreaktörleri dışında, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir makroakışkan perfüzyon hücre kültürü sisteminin farkında değildir.

Yazarlar daha önce neredeyse tamamen ticari olarak temin edilebilen parçalardan oluşan düşük maliyetli bir perfüzyon biyoreaktör sisteminin tasarımı hakkında rapor vermişlerdi¹¹. Sistemin baz versiyonu, bir kuyu plakasındaki birden fazla kültürün bir CO₂ inkübatöründe tutulmasını ve bir şırınga pompasından gelen ortamla sürekli olarak perfüze edilmesini sağlarken, kültürlerden gelen atık su ortam akışları, özel bir modifikasyona sahip bir fraksiyon toplayıcı kullanılarak zaman içinde otomatik olarak numunelere bölünür. Böylece, bu sistem kültür ortamı süpernatantının otomatik örneklemesini ve zaman içinde kültürlere sürekli çözünen girdiyi mümkün kılar. Sistem makroakışkan ve modülerdir ve yeni deney tasarımlarının ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca değiştirilebilir.

Burada sunulan yöntemin genel amacı, maddelerin zaman içinde hücreler tarafından salgılanma veya emilim oranlarının ölçüldüğü ve / veya hücrelerin hassas, geçici çözünen sinyallere maruz kaldığı deneylere olanak tanıyan bir perfüzyon hücre kültürü sistemi oluşturmak, karakterize etmek ve kullanmaktır. Bu video makalesinde, tek bir şırınga pompası ve modifiye fraksiyon toplayıcı kullanarak aynı anda altı adede kadar hücre kültürünü perfüze edebilen baz kurulumunun nasıl monte edileceği açıklanmaktadır. Baz sistemde, hücreleri kısa darbeler ve farmakokinetik benzeri profiller¹² dahil olmak üzere geçici çözünen konsantrasyon sinyallerine maruz bırakan deneylere izin vermek için ek pompalar ve parçalardan yararlanan iki yararlı varyant da Şekil 1'de gösterilmiştir.

Resim 1: Perfüzyon sistemi tasarımı üzerinde üç varyasyon . (Top) Temel perfüzyon sistemi. (Orta) Birden fazla orta kaynak için bir stopcock ile perfüzyon sistemi. (Altta) İyi karıştırılmış bir dağılım hacmini taklit etmek için karıştırılmış bir tanka sahip perfüzyon sistemi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Akış içindeki dağılım ve difüzyon nedeniyle, çözünen sinyaller akış sisteminden geçerken bozulur veya "bulaşır". Bu bozulma, ikamet süresi dağılımları (RTD'ler) kullanılarak ^{ölçülebilir13}. Bu makalede, perfüzyon sisteminin bileşenleri üzerinde izleyici deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır (Şekil 2) ve ölçülen verilerden RTD'ler oluşturmak için MATLAB komut dosyaları sağlanmaktadır. Bu analizin ayrıntılı bir açıklaması, yazarların önceki makalesi^11'de bulunabilir. Ek MATLAB komut dosyaları, RTD'lere uygun işlevler sığdırır ve fiziksel parametreleri çıkarır ve kullanıcı tarafından çözünen sinyal girişinin perfüzyon sistemi¹⁴ aracılığıyla nasıl yayılacağını ve bozulacağını tahmin etmek için RTD'leri kullanarak sinyal evrişimi gerçekleştirir.

Şekil 2: İkamet süresi dağılımları. Bu boru uzunluğu gibi akış sistemi bileşenlerinin RTD'leri, sisteme bir izleyici darbesi girerek ve toplanan fraksiyonlara çıktığı zamana kadar nasıl "bulaştığını" ölçerek ölçülür. Bu rakam Erickson ve ^ark.11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Kuyu plakası perfüzyonu için parçalar hazırlayın

1. Boru hazırlama
   1. Perfüze edilecek her hücre kültürü için iki uzunlukta silikon boru (1,6 mm iç çap) kesin. Yukarı akış borusu olarak kullanılan parçanın, şırınga pompasından inkübatörün içindeki hücre kültürüne ulaşacak kadar uzun olduğundan ve aşağı akış parçasının hücre kültüründen fraksiyon toplayıcının en uzatılmış konumuna ulaşabildiğinden emin olun.
   2. Her boru parçasına, etiketli bant ile her iki ucunda benzersiz bir etiket verin.
2. Kuyu plakası için tıpalar hazırlayın
   1. Perfüze edilecek kuyu plakasının her bir kuyucuğu için, hava geçirmez bir conta ile kuyucuklara sıkıca oturması için uygun bir çapa sahip bir silikon tıpa elde edin.
   2. Tıpanın diplerinden fazla malzemeyi kesin, böylece kuyucuklara sığacak şekilde içeride amaçlanan sıvı seviyesinin üzerinde hava için yer bırakın.
   3. İki künt 18 G iğneyi her bir durdurucudan, kuyudan geçen akış için giriş ve çıkış görevi görecek şekilde üstten ve alttan dışarı doğru itin, kuyu içindeki uçları arasındaki mesafeyi en üst düzeye çıkarmak için birbirine taban tabana zıttır.
   4. Tıkanmış kuyu içindeki iğnelerin yüksekliklerini ayarlayın, çünkü çıkış iğnesinin yüksekliği, perfüzyon sırasında kuyudaki sıvı seviyesinin sabit yüksekliğini belirleyecektir.
      NOT: Perfüzyon, çıkış iğnesi sıvı seviyesinin üzerinde olacak şekilde başlatılırsa, seviye iğneye ulaşana kadar sıvı kuyuda birikecektir. Perfüzyon, sıvı seviyesinin altındaki çıkış iğnesi ile başlatılırsa, hava kabarcıkları kuyuya akmadığı sürece sıvı seviyesi sabit kalır, bu da sıvı yüksekliğinin çıkış iğnesiyle aynı yüksekliğe gelene kadar düşmesine neden olur.
3. Ek parçalar toplayın
   1. Perfüzyona tabi tutulacak her hücre kültürü için, tüm perfüzyon için yeterli ortam içerecek kadar büyük, ayrıca başlangıçta boruyu doldurmak için ek miktarda ortam içeren bir steril şırınga elde edin.
   2. Perfüze edilecek her kültür için, bir dişi-diken-ve iki erkek-diken-Luer konektörünün yanı sıra iki dişi ve iki erkek Luer başlığı elde edin.
4. Parçaları temizleyin ve sterilize edin
   1. Parçalar daha önce kullanılmışsa, 0.1 N NaOH ile perfüze ederek temizleyin, ardından deiyonize su ile durulayın.
   2. Otoklavlama veya başka bir şekilde, yukarıda listelenen tüm parçaların sterilitesini sağlayın.

2. Çok kafalı dağıtıcıyı lazerle kesin ve bir fraksiyon toplayıcıya takın

1. Bilgisayar destekli bir tasarım programında Şekil 3'teki çok kafalı dağıtıcı modelini yeniden oluşturun veya sağlanan model DXF dosyasını indirin (Ek Dosya 1).
2. Tasarımı 1/8 akrilik levhadan kesmek için bir lazer kesici kullanın.
3. Dağıtım kafasını fraksiyon toplayıcının hareketli tabanına bağlayan üç vidayı çıkarın.
4. Çok kafalı dağıtıcıdaki en küçük üç deliği hareketli tabandaki vida delikleriyle hizalayın ve vidaları takılacak deliklerden tekrar vidalayın.
5. Üç vidanın sızdırmazlığını, çok kafalı dağıtıcıyı, dağıtım delikleri sırası altındaki toplama borularıyla aynı hizaya gelene kadar yukarı ve aşağı açılandıracak şekilde ayarlayın.
6. 300 μL pipet uçlarını, dağıtım uçları olarak kullanılmak üzere istenen deliklerden dikkatlice yerleştirin.
   NOT: Fraksiyon toplayıcı, tek bir hücre kültürünü perfüze etmek için çok kafalı dağıtıcı olmadan kullanılabilir.

3. Bileşen RTD'lerini ölçün ve sinyal evrişimi gerçekleştirin

1. İzleyici darbesi için pompaları ve şırıngaları Şekil 2'de gösterildiği gibi ayarlayın.
   1. İki adet tek kanallı veya çok kanallı şırınga pompası edinin.
   2. Hücre kültürü deneyleri sırasında akış sisteminde kullanılacak ortamı temsil etmek için bir arka plan çözümü seçin. Arka plan çözümünün ortama benzer kütle transfer özelliklerine sahip olduğundan emin olun. Çoğu durumda, deiyonize su uygun bir seçimdir.
   3. Hücre kültürü deneyleri sırasında ilgi çekici olacak çözünürlüğü temsil etmek için bir izleyici madde seçin. İzleyicinin, ilgilenilen çözünene benzer kütle transfer özelliklerine sahip olduğundan ve konsantrasyonunun ölçülebildiğinden emin olun. Çoğu durumda, gıda boyası uygun bir seçimdir.
   4. İzleyici çözeltisini yapmak için izleyici maddesini arka plan çözeltisinde çözün.
   5. Bir şırıngayı bir arka plan çözeltisiyle doldurun ve bir şırınga pompasına yükleyin. Başka bir şırıngayı izleyici çözeltisiyle doldurun ve ikinci şırınga pompasına yükleyin.
   6. Luer konektörlerini kullanarak her iki şırıngayı da dört yönlü bir stopcock'un üç bağlantı noktasından ikisine bağlayın.
   7. Stopcock'u arka plan çözeltisine kapatın ve izleyici çözeltisini açık porttan damlamaya başlayana kadar stopcock'a pompalayın. Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın.
      NOT: Şırınga pompasının hareketli çubuğunun, deneyin zamanlanmış kısımları başlamadan önce şırınga pistonlarına doğru itilmesi önemlidir. Bu, pompa başlatıldığında akışın hemen başlamasını sağlayacaktır. Aksi takdirde, pompa başlatılabilir, ancak hareketli çubuk piston konumuna gelene kadar akış aslında başlamaz.
   8. Durdurucuyu izleyici çözeltisine kapatın ve tüm artık izleyici çözeltisi açık bağlantı noktasından temizlenene kadar arka plan solüsyonunu stopcock'a pompalayın. Pompayı durdurun ve şırıngayı daha fazla ayarlamayın.
2. İlgilenilen akış sistemi bileşenini ve kesir toplayıcıyı ayarlayın
   1. RTD analizi için istenen akış sistemi bileşenini ayarlayın. Ölçülecek bileşenin, çalışma sırasında fraksiyon toplayıcıya ulaşmak için uygun uzunlukta ve esneklikte bir parça aşağı akış borusu ile uçtuğundan emin olun.
   2. Çıkış yönündeki borunun ucunu, çok kafalı dağıtıcıdaki pipet ucu dağıtıcısına, sıkıca bağlanacak şekilde yerleştirin.
   3. Dört yönlü durdurmanın açık portunu, ölçülecek bileşenin girişine takın. Bir hücre kültürü deneyi sırasında olduğu gibi tamamen dolana kadar bileşenden arka plan çözeltisini pompalayın ve fraksiyon toplayıcı dağıtım ucundan damlamaya başlar. Pompayı durdurun.
3. İzleyici darbesini enjekte edin, fraksiyonları toplayın ve izleyiciyi ölçün
   1. İzleyici çözeltisi için pompayı istenen akış hızına ayarlayın. Stopcock'u arka plan çözümüne kapatın ve izleyici çözümünün akışını başlatın. Aynı zamanda, kesir toplayıcıyı başlatın.
   2. İzleyicinin impuls girişine yaklaşmak için izleyici çözeltisinin akışına kısa bir süre devam edin. 10 dakikalık bir darbe süresinin, RTD'ler için 1 mL / s akış hızında iyi çalıştığı bulunmuştur.
      NOT: İzleyici darbesi çok kısaysa, ölçülebilir olması için akışa yeterli izleyici girmeyecektir. Nabız çok uzunsa, artık bir dürtüye yaklaşmayacak ve RTD'nin şeklini değiştirecektir.
   3. İzleyici çözeltisi darbe periyodunun sonunda, izleyici çözeltisi pompasını durdurun. Durdurmayı hızlı bir şekilde izleyici çözeltisine kapatın ve arka plan çözeltisinin akışını aynı akış hızında başlatın.
   4. Arka plan çözeltisinin akmasına ve fraksiyonların toplanmasına, izleyicinin tamamı sistemden ve toplanan fraksiyonlara geçene kadar izin verin.
   5. Sistemi durdurun ve fraksiyonlardaki izleyici konsantrasyonunu ölçün. Sadece tamamen dağıtılan kesirleri içerir. Koleksiyon, bir kesirin toplanması yoluyla yarı yolda durdurulursa, bu kesri dahil etmeyin.
4. MATLAB'da ölçülen verilerden ikamet süresi dağılımını (RTD) hesaplayın
   NOT: Bu MATLAB senaryosu tarafından gerçekleştirilen analizin yazılı bir açıklaması, yazarların önceki yayını^11'de bulunabilir ve teorinin tartışmaları literatür^13'te yaygın olarak mevcuttur.
   1. Ek Dosya 2'de sağlanan .xlsx elektronik tablosu biçiminde konsantrasyon verilerini içeren bir example_tracer_data.xlsx dosyası oluşturun. İzleyicinin kesirlerdeki (herhangi bir birim) konsantrasyon değerlerini, satır 2'de soldan sağa kronolojik sırayla girin. Nabzın başlangıcından A5 hücresindeki son fraksiyonun sonuna kadar geçen süreyi girin ve izleyici darbesinin uzunluğunu A8 hücresine dakika cinsinden girin.
   2. .xlsx dosyasını MATLAB dizinine kaydedin.
   3. Ek Dosya 3'teki RTD_From_Data.m komut dosyasını MATLAB düzenleyicisinde açın.
   4. Komut dosyasının Veri Yükle bölümünün ilk satırındaki parantez içindeki .xlsx dosyasının adını, komut dosyasında yazılan yönergeleri izleyerek yeni .xlsx veri dosyasının adıyla değiştirin. Komut dosyasını çalıştırın.
   5. Komut dosyasının RTD analizi^13'ü başarıyla gerçekleştirdiğinden, RTD'nin bir grafiğini oluşturduğundan ve sayısal integralin değerini RTD'ye eşit 1 üzerinden döndürdüğünden emin olun. Komut dosyası tarafından MATLAB dizinine kaydedilen zaman vektörünü (t) ve ilişkili RTD değerleri vektörünü (Et) bulun.
5. MATLAB'da RTD'ye model işlevi sığdırma
   1. Ek Dosya 4'ten MATLAB düzenleyicisinde Fit_RTD_Function.m komut dosyasını açın.
   2. RTD'ye uyacak şekilde yorumlanmış üç model fonksiyonundan birini seçin: silindirik tüplerde laminer akış için RTD'lere uyan eksenel dağılım modeli¹³; iyi karıştırılmış tanklara uyan CSTR model¹³; ve yaklaşık olarak daha büyük kuyu plakalarına uyan n-CSTR model¹⁵. Burada bulunmayan başka bir modele sığdırmak için, aynı biçimde komut dosyasına ekleyin.
   3. Komut dosyasının sığdırmak için seçilen modeli içeren bölümündeki yorumları kaldırın.
   4. Parametreler için ilk tahminlerin değerlerini RTD için uygun olanlarla değiştirin.
   5. RTD verilerinin üzerine bindirilmiş fit işlevinin grafiğini oluşturmak ve işlevin fit parametre değerlerini yazdırmak için komut dosyasını çalıştırın. Sığdırma çok zayıfsa veya hatalar oluşursa, parametrenin ilk tahminlerini değiştirin ve komut dosyasını yeniden çalıştırın.
6. MATLAB'da sinyal evrişimi gerçekleştirme
   1. Birleştirmek için bir sinyal ve bir RTD veya iki RTD seçin.
   2. Ek Dosya 5'teki Signal_Convolution.m komut dosyasını MATLAB düzenleyicisinde açın.
   3. Bükülecek iki sinyalin her biri için (yani, bir sinyal ve bir RTD veya iki RTD), istenen birimlerde eşit aralıklı zaman noktalarının bir vektörünü ve bu zamanlarda karşılık gelen bir sinyal değerleri vektörünü tanımlayın.
      NOT: İki sinyalin vektörleri aynı sayıda elemana ve aynı boyutta zaman adımlarına sahip olmalıdır. Bu nedenle, RTD'nin herhangi bir zaman aralığında rasgele sayıda nokta için örneklenebilen sürekli bir işlev olarak kullanılması yararlıdır.
   4. İki sinyali MATLAB'a girin ve çıkış sinyalinin zaman ve sinyal vektörlerini elde etmek için komut dosyasını çalıştırın.

4. Temel perfüzyon sistemini bir kuyu plakasındaki hücrelerle kurun

1. Kuyu plakasını hazırlayın
   1. Kuyu plakası kültürünün perfüzyon deneyi için uygun orta derinliğe sahip olduğundan emin olun. Perfüzyona başlamadan önce son ortam değişikliklerini, stimülasyonları veya diğer adımları istediğiniz gibi gerçekleştirin. Süspansiyon hücreleri perfüze ediliyorsa, altta olduklarından emin olmak için plakayı santrifüj edin.
   2. Steril koşullar altında, iğneli tıpaları, iğneler yukarı çekilmiş olarak kuyu plakası kültürlerine yerleştirin. Durdurucu yerleştirildikten sonra, çıkış iğnesinin yüksekliği kararlı sıvı seviyesini belirlediğinden, iğneleri perfüzyon için istenen yüksekliğe indirin.
   3. İğneleri erkek Luer kapaklarıyla kapatın ve tüm kuyu plakasını kullanıma kadar bir inkübatörde tutun.
2. Şırıngaları ve yukarı akış borularını hazırlayın
   1. Steril koşullar altında, perfüzyonun istenen süresi boyunca yeterli ortam ve ayrıca yukarı akış borusunu doldurmak için yeterli ek ortam ile perfüze edilecek her kültür için bir şırınga doldurun.
   2. Dişi-dikenli Luer konektörü kullanarak yukarı akış borusunu şırıngaya takın. Tüpün diğer ucunda, erkekten dikenlere Luer konektörü takın.
   3. Yukarı akış tüpü tamamen ortamla dolana kadar şırıngadan ortam dağıtın.
   4. Tüpün açık ucunu dişi bir Luer başlığı ile kapatın.
      NOT: Tüm çoğaltılan şırıngalar bu noktada tam olarak aynı hacme sahip olmalıdır. Hacimleri eşit değilse, pistonları farklı pozisyonlarda olacak ve hepsi tek bir çok kanallı şırınga pompasına iyi sığmayacaktır.
3. Steril koşullar altında, aşağı akış borusunun bir ucuna erkekten dikenlere bir Luer konektörü takın ve dişi bir Luer kapağı ile kapatın.
4. Hazırlanan tüm boruları, şırıngaları ve kuyu plakasını perfüzyon için kullanılacak inkübatöre dikkatlice getirin.
5. Şırınga pompasını ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yakınında istenen yerlere yerleştirin. Şırınga pompasını inkübatörün üstüne veya yanına yerleştirin ve fraksiyon toplayıcıyı inkübatörün yanına, portun yanına yerleştirin.
6. Tüm yukarı ve aşağı akış tüplerinin kapaklı uçlarını bir araya getirin ve bunları inkübatörün dışından liman üzerinden içeriye doğru itin.
7. Şırıngaları şırınga pompasına yükleyin ve çıkış yönündeki tüplerin açık uçlarını, fraksiyon toplayıcının çok kafalı dağıtıcısının dağıtım pipet uçlarına yerleştirin.
8. İnkübatörün içinde, akan ortamın inkübatör havasından ısı ve CO2 alabileceği boru uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak için inkübatöre mümkün olduğunca fazla yukarı akış borusu gevşetin. Bunları yerinde tutarken, aşağı akış tüplerini inkübatörden dışarı çekin, böylece fraksiyon toplayıcı üzerindeki en uzak uzatılmış noktaya ulaşabilmeleri için kapaklı uçları inkübatörün içinde tutmaya devam edin.
9. Tıkanan her kuyu için, iğneleri ve bu kuyu için yukarı ve aşağı akış tüplerini hızlı bir şekilde açın ve bunları Luer konektörleriyle birbirine takın.
10. Tüm parçalar bağlandıktan sonra, tüm akışların düzgün bir şekilde aktığından emin olmak için şırınga pompasını nispeten yüksek bir hızda kısaca çalıştırın.
11. Bu noktada, deneye ortamla dolu çıkış yönündeki tüplerle başlamak istenirse, hepsi dolana kadar pompayı çalıştırmaya devam edin. Aksi takdirde, pompayı durdurun.
12. Şırınga pompası akış hızını ve fraksiyon toplama sıklığını ayarlayın ve deneye başlamak için her iki makineyi aynı anda başlatın. İstenilen deneme süresi boyunca kesirleri toplayın.

5. Perfüzyon sistemini, birden fazla ortam kaynağı için bir stopcock ile kurun

1. Yukarıdaki adım 4.1'in tüm alt adımlarını gerçekleştirin.
2. Perfüzyonda kullanılacak iki ortamı hazırlayın, ilk önce dağıtılacak ortamı 1, diğerini orta 2 olarak etiketleyin.
3. Perfüze edilecek her kültür için, bir şırıngayı dispenzasyon süresi boyunca yeterli ortam 1 ile doldurun, ayrıca başlangıçta perfüzyon sistemini doldurmak için yeterli hacim. İkinci bir şırıngayı, veriliş süresi boyunca yeterli orta 2 ile doldurun.
4. Her iki şırıngayı da dört yönlü bir stopcock'un üç portundan ikisine bağlayın.
   NOT: Şırıngaları tıkayıcılara bağlamak için bir boru uzunluğu gerekebilir.
5. Stopcock'u ve şırıngaları, yukarıdaki 3.1.7-3.1.8 adımlarına benzer şekilde, stopcock'u orta 1'e kapatarak ve orta 2'yi açık porttan damlamaya başlayana kadar stopcock'a dağıtarak hazırlayın.
6. Stopcock'u orta 2'ye kapatın ve kalan tüm orta 2 açık porttan atılana kadar orta 1'i stopcock'a dağıtın.
7. Dişi-dikenli Luer konektörü kullanarak yukarı akış borusunu açık stopcock portuna takın. Tüpün diğer ucunda, erkekten dikenlere Luer konektörü takın.
8. Yukarı akış tüpü tamamen ortamla dolana kadar şırıngadan orta 1'i dağıtın.
9. Yukarıdaki 4.3-4.11 adımlarıyla devam edin, her iki şırıngayı ayrı şırınga pompalarına ve sadece dağıtım ortamı 1'e yükleyin.
10. Şırınga pompası akış hızını orta 1 ve fraksiyon toplama sıklığı için ayarlayın ve deneye başlamak için her iki makineyi aynı anda başlatın.
11. Orta kaynak değiştirilecekse, şırınga pompasını orta 1 için hızlı bir şekilde durdurun, durdurma musluğunu orta 1'e kapatın ve şırınga pompasını orta 2 için başlatın. Daha sonra isterseniz, kaynağı benzer şekilde orta 1'e geri döndürün.
12. İstenilen deneme süresi boyunca kesirleri toplayın.

6. Farmakokinetiği taklit etmek için perfüzyon sistemini karıştırılmış bir tankla kurun

1. İlgilenilen ilaç için farmakokinetik veriler elde edin ve bunun bir konsantrasyon zirvesinden ve ardından üstel bir çürümeden oluştuğundan emin olun.
2. Zirveyi 0 zamanına ayarladıktan ve tepe noktasından önceki veri noktalarını kaldırdıktan sonra, karıştırılan tank RTD denklemini verilere sığdırmak için Stirred_Tank_Fit.m komut dosyasını (Ek Dosya 6) kullanın. Giriş v (istenen perfüzyon akış hızı) ve bir çift vektör olarak doğrudan komut dosyasına sığdırılacak veriler, sırasıyla zaman değerleri ve konsantrasyon değerleri için t ve C ile birlikte. Gerekli karıştırılmış tank hacmi olan V parametresini yazdırmak için komut dosyasını çalıştırın.
3. Perfüzyon sistemi için iki şırınga pompası ve inkübatörün yukarı yönünde bir plaka çalkalayıcı içerecek şekilde bir düzen planlayın.
4. Perfüzyon sistemi bileşenlerinin RTD'lerini stopcock'un ötesinde ölçün ve uygun bir farmakokinetik profil bulmak için çeşitli ilaç nabız süreleri ve konsantrasyonları ile RTD'lerin sinyal evrişimini gerçekleştirin. Bu hesaplamada uygun karıştırılmış tank RTD denklemini kullanın.
5. Yukarıdaki 5.1-5.8 arası adımlarla devam edin.
6. Kurulum için karıştırılmış tank olarak uygun boyutta ek bir kuyu plakası kullanın. Her kuyu, perfüze edilmiş bir kültür için karıştırılmış bir tank görevi görebilir. Kuyuyu gerekli miktarda orta, V ile doldurun ve kuyuyu başlangıçta yukarı çekilen iğnelerle takın, daha sonra kuyunun dibine itin ve iğneleri kapatın.
7. Şırıngaları şırınga pompalarına yükleyin ve boruyu şırıngalardan karıştırılmış tankların kapaklı giriş iğnelerine hızlı bir şekilde bağlayın. Daha sonra hücre kültürü yukarı akış tüp girişlerini karıştırılmış tankların çıkış iğnelerine bağlayın.
8. 5.9-5.10 arasındaki adımlarla devam edin.
9. İstenilen zamanda, adım 5.11'de açıklandığı gibi, ilacı içeren dağıtım ortamı 2'ye geçin. İlaç infüzyonu tamamlandığında orta 1'e geri dönün.
10. Adım 5.12 ile devam edin.

Resim 3: Çok kafalı dağıtıcı. Lazer kesimli çok kafalı dağıtıcı için tasarım. Bu rakam Erickson ve ^ark.11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Protokolün 5. bölümünden çoklu ortam kaynaklarına sahip perfüzyon sistemi, tümör nekroz faktörü alfasının (TNF-α) 1.5 saatlik nabzına yanıt olarak, insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücrelerinde aktive edilmiş B hücrelerinin (NF-κB) transkripsiyon faktörünün nükleer faktör kappa-hafif zincir-arttırıcısı tarafından yönlendirilen bir muhabir genin ekspresyon dinamiklerini ölçmek için kullanıldı. HEK293 hücreleri, dönüştürülmüş hücreleri izole etmek için floresan ile aktive ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışma, TNF-α geçici bir darbesine yanıt olarak NF-κB güdümlü gen ekspresyonunun dinamiklerinin ölçüldüğü spesifik bir örnekle gösterilen çoklu ortam kaynaklarına sahip bir perfüzyon hücre kültürü sisteminin montajını ve çalışmasını açıklamaktadır. Perfüzyon sistemi bileşenlerinin RTD'leri ölçüldü ve modellendi ve hem hücrelerin TNF-α darbesine maruz kalmasını hem de toplanan atık su orta fraksiyonlarındaki TNF-α dağılımını tahmin etmek için sinyal evrişimi kulla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines	Grainger	5FVK2
293T Cells	ATCC	CRL-3216	HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-Well Clear Bottom Plates, Corning	VWR	89091-010	Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
BioFrac Fraction Collector	Bio-Rad	7410002	Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8"	McMaster-Carr	4615T93	This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells	Millipore Sigma	CLS3548	Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells	Fisher Scientific	720081	Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Laser	Cutting Edge Systems	Epilog Zing 24	Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129	Microcentrifuge tubes for collecting fractions.
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End	Fisher Scientific	14-961-26	Glass tubes for collecting fractions.
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered	Fisher Scientific	2707410	300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	21600010	Phosphate buffered saline.
Labline 4625 Titer Shaker	Marshall Scientific	Labline 4625 Titer Shaker	Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16"	Cole-Parmer	EW-45508-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-1600
Rack Set F1	Bio-Rad	7410010	Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF	Bio-Techne	10291-TA-020	Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm	Saint Gobain	DX263015-50	Fits 48-well plates.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm	Saint Gobain	DX263027-10	Fits 12-well plates.
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems	SolidWorks	CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Plate reader.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue	Michaels	10404779	Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.