Kardiyotorasik Cerrahi için Preadolesan Fare Yavrularının Anestezisi ve Entübasyonu

Özet

>7 günlük farelerde kardiyotorasik cerrahi modeller entübasyon gerektirir, ancak bu preadolesan (8-14 günlük) fare yavruları için zordur ve entübasyon için anestezik rejimler hakkında çok az bilgi vardır. Burada, 10 günlük C57BL/6J fare yavrularında endotrakeal entübasyona izin verirken hayvan ölümlerini en aza indiren ketamin/ksilazin/atropin dozaj rejimleri sunulmuştur.

Özet

Murin cerrahi modelleri preklinik araştırmalarda önemli bir rol oynamaktadır. Kardiyak yaralanma sonrası miyokard rejenerasyonuna ilişkin mekanik anlayışlar, kardiyomiyositleri yetişkinlerinkinden farklı olarak proliferatif kapasiteyi koruyan 0-14 günlük farelerde kardiyotorasik cerrahi modellerinden elde edilebilir. 7 güne kadar olan fare yavruları hipotermi ile etkili bir şekilde hareketsiz hale getirilir ve kardiyotorasik cerrahi için entübasyon gerektirmez. Bununla birlikte, ergenlik öncesi (8-14 günlük) fare yavruları entübasyon gerektirir, ancak bu zordur ve entübasyonu kolaylaştırmak için anestezi ile ilgili çok az bilgi vardır. Burada, 10 günlük C57BL/6J fare yavrularında endotrakeal entübasyona izin verirken hayvan ölümlerini en aza indiren ketamin/ksilazin/atropin dozaj rejimleri sunulmuştur. Ketamin / ksilazin / atropin dozaj rejimlerinin vücut ağırlığına ampirik titrasyonunun farklı ağırlıklardaki fare yavrularının anestezisine verilen yanıtın doğrusal olmadığını, bu nedenle 20/4/0.12 mg / kg, 30/4/0.12 mg / kg ve 50/6/0.18 mg / kg'lık dozların, 3.15-4.49 g (n = 22), 4.50-5.49 g (n = 20) ve 5.50-8.10 g (n = 20) arasındaki yavruların entübasyonunu kolaylaştırdığını göstermiştir. sırasıyla. Düşük vücut ağırlığındaki yavrular, daha ağır yavrulardan daha fazla entübasyon girişimi gerektiriyordu (p < 0.001). Entübasyon sonrası sağkalım vücut ağırlığı ile korelasyon gösterdi (düşük, orta ve yüksek ağırlıklı gruplar için sırasıyla% 59,% 70 ve% 80, R² = 0.995). Entübasyon sonrası miyokard enfarktüsü cerrahisinde %100 oksijende %4.5 izofluran ile cerrahi anestezi düzlemi indüklendi ve %100 oksijende %2 izofluran ile korundu. Ameliyat sonrası sağkalım üç ağırlık grubu için %92, %86 ve %88 olarak benzerdi (p = 0.91). Entübasyon ve cerrahi için hayvan taşıma uygulamalarındaki iyileştirmeler ve ameliyat sonrası baraj tarafından yamyamlaşmanın en aza indirilmesi ile birlikte, tüm prosedür için genel sağkalım (entübasyon artı cerrahi) vücut ağırlığı ile korelasyon gösterdi (düşük, orta ve yüksek ağırlıklı gruplar için sırasıyla% 55,% 60 ve% 70, R² = 0.978). 10 günlük yavruların entübasyonunda karşılaşılan zorluk ve buna bağlı yüksek mortalite göz önüne alındığında, 10 günlük yavrularda kardiyotorasik cerrahinin en az 5.5 g ağırlığındaki yavrularla sınırlandırılmasını öneriyoruz.

Giriş

Murin modelleri, özellikle genetik olarak tasarlanmış fare çizgilerinin oluşturulabilmesinin kolaylığı ve ayrıca farelerin, örneğin kalp hasarından sonra miyokard rejenerasyonunun incelenmesine izin vermek için patolojik hastalık modelleri sağlamak için cerrahi olarak manipüle edilebilme kolaylığı nedeniyle, klinik öncesi kardiyotorasik araştırmalarda paha biçilmez araçlardır¹ . Bu bağlamda, kardiyomiyositlerin hücre döngüsünden çekildiği yetişkin farelerin aksine, 0-2 günlük yenidoğan fare kalplerinin, apikal rezeksiyon veya miyokard enfarktüsü indüksiyonu ^2,3,4 sonrası minimum skarlaşma ile onarılması ilgi çekicidir. Buna karşılık, 7 günlük yenidoğan kalpleri eksik rejenere olur ve ^2,3 skar insidansı daha yüksektir. Sol ventrikülün tepesindeki kardiyomiyositler doğumdan sonraki 2 haftaya kadar proliferatif kapasiteyi koruduğundan, 0-14 günlük farelerde kalp hasarı sonrası rejenerasyonun mekanik çalışmaları, yaralı yetişkin kalbin rejenerasyonu için terapötik hedeflerin belirlenmesinde bilgilendirici olabilir⁵.

Kardiyak hasarın fare modellerinin geliştirilmesi, anestezi altında cerrahi manipülasyonu içerir. Bu, toraksın kalbe erişmek için açılmasını gerektirir, bu da genellikle entübasyon ve mekanik ventilasyonu zorunlu kılar. Fare gerginliği, vücut ağırlığı ve yaş, anesteziklere duyarlılığı etkiler⁶. Yetişkin fareler çok çeşitli ajanlarla uyuşturulabilir, entübasyon için yaygın bir rejim 100/13/0.5 mg / kg ^6,7'de ketamin / ksilazin / atropindir. Yenidoğan fareleri (0-7 günlük) merkezi bir ağrı refleksinden yoksundur ve buz üzerinde etkili bir şekilde hareketsiz hale getirilebilir ve entübasyon olmadan ameliyata tabi tutulabilir ^6,8,9. Preadolesan (8-14 günlük) fare yavruları hipotermi ile uyuşturulamaz ^9,10; kardiyotorasik cerrahi için entübasyon gerektirirler. 14 günden küçük preadolesan farelerde kardiyotorasik cerrahi ile ilgili daha önce yapılmış bir çalışma yoktur. Deneyimlerimize göre, 14 günlük yaşın altındaki izofluran-anestezi uygulanmış preadolesan farelerin entübasyonu zordur. 7 günden büyük fareler için bildirilen önerilen enjekte edilebilir anestezik rejim 50-150 mg / kg ketamin ve 5-10 mg / kg ksilazin^10'dur. Preadolesan fareler hala nörolojik olarak gelişmektedir ve ilaçlara ve ilaç metabolizmasına verdikleri yanıtlar yetişkin hayvanlardan çok farklıdır⁶. Bu, sıvı, elektrolit ve asit-baz dengesizliğinin yanı sıra, yalnızca sınırlı enerji depolarını hızla tüketen yüksek metabolik hızları nedeniyle değil, aynı zamanda termoregülasyon olgunlaşmamışlıkları nedeniyle hipoglisemi ve hipotermi riskini de artırır 6,11,12. Bu nedenle, hem entübasyonu kolaylaştıran hem de ergenlik öncesi farelerin sağkalımını en üst düzeye çıkaran anestezik rejimler hakkında çok az bilgi vardır.

Burada, 10 günlük C57BL/6J fare yavrularında ağırlığı 3-8 g arasında değişen ketamin/ksilazin/atropin dozaj rejimlerini ampirik olarak titre ederek, hayvan ölümlerini en aza indirirken sonraki kardiyotorasik cerrahi için endotrakeal entübasyona izin verecek kadar anestezi düzlemi elde ettik. Ayrıca entübasyon, cerrahi ve ameliyat sonrası maternal yamyamlıktan kaynaklanan mortaliteyi azaltmak için hayvan taşıma uygulamalarını da geliştirdik.

Protokol

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Garvan / St Vincent's Hastanesi Hayvan Etiği Komitesi tarafından, Avustralya Bilimsel Amaçlar İçin Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Uygulama Kuralları ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak onaylanmıştır ve tüm deneyler, bir pediatrik anestezistin (JJS) rehberliğinde deneyimli bir küçük hayvan cerrahı (JW) tarafından gerçekleştirilmiştir.

1. Aletlerin hazırlanması

1. Ameliyat gününde, 10 günlük yavruların entübasyonu için özel ekipman kurun (Şekil 1A, B). Buna bir ısıtma lambası, entübasyon platformu, fiber optik ışık, küçük forsepsler, 0.02 mm çapında bakır tel parçasından yapılmış bir laringoskop (telin ucu 175 ° 'lik bir açıyla 3 mm çapında bir daireye biçimlendirilmiş 60 mm uzunluğunda; Şekil 1B) ve endotrakeal tüp olarak kullanılan 24 gauge plastik intravenöz (i.v.) kanül.
2. Kanülün, 21 mm plastik dişi luer kilit adaptörüne bağlı 19 mm uzunluğunda bir plastik borudan (0,7 mm OD) oluştuğundan emin olun (Şekil 1B). Luer kilit adaptörü aracılığıyla bir parça bakır tel yerleştirerek kanülün borusunu sertleştirin. Gelgit hacmi ~8 μL/g ^13,14 olan bir fare için toplam hacmi¹³⁰ μL olan bir kanül kullanın.

2. 10 günlük farelerin anestezisi

1. Ameliyat gününde, barajı 10 günlük C57BL / 6J yavrularının kafesinden çıkarın ve kafesi bir ısıtma yastığına (37 ° C) yerleştirin.
2. Farklı ağırlık gruplamaları için Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklanan oranlarda 0.5 mL insülin şırıngası ve ketamin / ksilazin / atropin içeren 29 G iğne kullanarak yavruları g vücut ağırlığı başına 10 μL intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi yapın.
3. Enjeksiyondan hemen sonra, yavruyu% 100 oksijen ile önceden oksijenlendirilmiş ısıtılmış (37 ° C) bir pleksiglas odaya yerleştirin.

3. 10 günlük farelerin entübasyonu

1. 3-4 dakikalık oksijenasyondan sonra, yavruyu esas olarak yetişkin farelerde olduğu gibi entübasyon için bir platforma aktarın. Bunu, yavru ile sırtüstü pozisyonda (Şekil 1C) veya 45° açı^15'te asılı olarak gerçekleştirin. Bir ısıtma lambası ile sıcaklığı koruyun.
   1. Entübasyondan önce, pençe sıkışma refleksi ile anestezi derinliğini değerlendirin. Optimal entübasyon için, pençe sıkışma refleksi hala mevcut olmalı, ancak bilinçli bir hayvanınkinden belirgin şekilde azaltılmalıdır.
2. Anestezi uygulanan yavru köpeği bir entübasyon platformuna sabitledikten sonra (Şekil 1C), dili küçük forsepslerle tutun ve glottis ve ses tellerini açığa çıkarmak için bir bakır tel parçasından (Şekil 1B) yapılmış bir laringoskop kullanın. Ses tellerinin esnek bir fiber optik ışıkla trans-aydınlatma ile görselleştirilmesine yardımcı olur (Şekil 1D).
3. Sertleştirilmiş bir kanül kullanarak, kanülü luer kilit ucu uçtan biraz daha düşük (~ 10 °) olacak şekilde eğin ve ses telleri ayrılır ayrılmaz, kanülü takın ve luer kilit adaptörü ağzın hemen dışına çıkana kadar ilerletin. Entübasyondan hemen sonra teli çıkarın.
   NOT: Kanül çok ileri gitmedikçe ve karinadan direnç hissedilmedikçe, bu yaştaki farelerde entübasyon sırasında direnç beklenmez.
   1. Entübasyondan sonra anestezi derinliğini, hayvanın kendiliğinden nefes alma kabiliyeti ile değerlendirin. Göğüs hareketini önleyip önlemediğini kontrol etmek için entübasyon kateterini kısaca bloke ederek kendiliğinden nefes alan yavruların başarılı trakeal entübasyonunu onaylayın.
4. Entübe edilmiş yavruyu derhal bir ısıtma pedine (37 ° C) aktarın ve endotrakeal kanülü, sırasıyla 30 μL / inme, 40 μL / inme veya 3.15-4.59 g, 4.50-5.49 g veya 5.50-8.10 g yavrular ve 150 vuruş / dak için 50 μL / strok ile 1 L / dak akış hızında% 100 oksijen sağlayan bir ventilatöre bağlayın.
5. Yeniden nefes almayı en aza indirmek için bu prosedürleri <15 sn içinde hızlı bir şekilde gerçekleştirin.

4. 10 günlük farelerin miyokard enfarktüsü cerrahisi

1. Ameliyat için cerrahi bir anestezi düzlemini indüklemek için, ventilatöre akan gazı% 100 oksijenden% 4.5 izoflurana (izofluran konsantrasyonu bir buharlaştırıcı tarafından belirlenir) 4-5 dakika boyunca değiştirin.
   1. İzoflurana geçtikten sonra, göğüs duvarı hareketinin sıklığının ventilatörünkine eşit olduğunu kontrol ederek trakea entübasyonunu tekrar onaylayın. Spontan solunum kaybı ve ardından kuyruk veya pençe sıkışma refleksinin olmaması, cerrahi anestezi düzlemine ulaşıldığını gösterir (4-5 dakika sonra).
2. Anesteziyi oksijende% 2 izofluran ile koruyun.
3. Miyokard enfarktüsü ameliyatını^16'da tarif edildiği gibi cerrahi mikroskop altında (10x ve 16x objektif) gerçekleştirin.
   1. Cildi dairesel bir hareketle, iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovma ve% 70 alkolün alternatif turlarıyla birkaç kez dezenfekte edin. İnce makas kullanarak, göğsün sol lateral duvarındaki üçüncü ve dördüncü kaburga (dördüncü interkostal boşluk) arasında yatay bir cilt kesisi yapın. İnce forseps kullanarak, interkostal boşluğun künt diseksiyonu ile toraksı açın ve alanı açık tutmak için bir retraktör kullanın.
   2. Sol koroner arterin sol atriyal apendikte sadece distal olarak 9-0 polipropilen monofilament sütür ile bağlanması ile miyokard enfarktüsü indüklenir. ~ 10 dakikalık enfarktüs ameliyatından sonra, cildi 7-0 prolen ile kapatın ve insizyonu betadin ile dezenfekte edin. Kan yavrusunu% 70 etanol veya salin ile temizleyin.
      NOT: Preadolesan yavrularda sol koroner arterin bağlanması, yetişkin ligasyonlarında olduğu gibi esasen kansızdır.
   3. 0.5 mL insülin şırıngası ve 29 G iğne ile birbiri ardına uygulayın: sedasyon, analjezi (buprenorfin, 0.075 mg / kg, 10 μL, subkutanöz) ve salin (50 μL, intraperitoneal) hızlı iyileşme için atipamezol (1-5 mg / kg, 10 μL, intraperitoneal).
4. İzofluranı keserek hayvanların iyileşmesine izin verin. Bundan sonra birkaç dakika içinde spontan solunumun devam ettiğinden emin olun.
   1. Yavruyu ısıtılmış ön oksijenli odaya geri döndürün ve sağ refleks yeniden kazanılana kadar iyileşme sırasında sürekli izleyin, bu noktada yavru ekstübasyon yapın.
   2. Yavruyu ev kafesi yataklarıyla hafifçe ovalayın, yavruyu sıcak tutun, solunumun düzenli olduğunu ve yavrunun kendiliğinden hareket edebildiğini kontrol edin. Bu, baraj tarafından ameliyat sonrası yamyamlığı azaltacaktır.
5. Tüm yavrular anesteziden tamamen kurtulduğunda barajı kafese geri koyun.
   NOT: Bir yavrunun hazırlanması, anestezisi, entübasyonu, ameliyatı ve iyileşmesi için geçen toplam süre 40-60 dakika arasında değişebilir.
6. Ev barajı ve yavrular gece boyunca bir kafeste 37 ° C'lik bir ısıtma yastığının yarısına / yarısına yerleştirilir.

5. Enfarktüs boyutunun ameliyat sonrası değerlendirilmesi

1. Ameliyat sonrası 3. günde, yavruları 1 mL / dak akış hızında oksijende% 4.5 izofluran ile önceden dengelenmiş bir pleksiglas odaya yerleştirerek anestezi yapın^.
2. Cerrahi bir anestezi düzlemine ulaşıldıktan sonra (4-5 dakika sonra), pençe sıkışma refleksi ile değerlendirildiğinde, yavruyu odadan çıkarın ve kuyruğu bantlayarak bir ısıtma pedi üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
3. Kesici dişlerin üzerine bir iplik yerleştirin ve kafayı uzatılmış tutmak için bandı yerine yerleştirin ve kafayı, 200 μL / strok, 150 vuruş / dak'da oksijende% 4.5 izofluran sağlayan bir vantilatöre bağlı bir burun konisine yerleştirin. Oksijende% 2 izofluran ile cerrahi bir anestezi düzlemi koruyun.
4. Cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin. İnce makas kullanarak, trakea boyunca sağ ortak karotis arter üzerinde deride 1 cm'lik bir kesi yapın ve kanın pıhtılaşmasını önlemek için 1 dakika boyunca 0.2 mL heparinize salin (200 U) uygulamak için tek bir lümen polietilen tüp (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) kullanarak maruz kalan damarı kanüle edin.
5. Diyastolde kalbi tutuklamak için 2 s içinde 0.2 mL'lik 3.3 M KCl'yi hızla uygulamadan önce izofluranı 1 dakika boyunca oksijende% 4.5'e yükseltin.
6. Sağ juguler veni aynı kesiden diseke edin ve transekte edin. Kalbi 0.2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfüze edin ve daha sonra enfarktüssüz uzak miyokardı boyamak için 0.1mL% 0.2 Alcian Blue ile perfüze edin. Kanın, PBS'nin ve daha sonra juguler ven yoluyla Alcian Blue'nun yıkanmasıyla kanıtlanan başarılı perfüzyonu kontrol edin.
7. Toraksı açın ve kalbi serbest bırakmak için çevredeki bağ dokusunu ve damarları diseke ederek kalbi eksize edin. Kalbi PBS'de durulayın, istenirse atriyumu çıkarın ve 10x objektif kullanarak cerrahi mikroskop üzerine monte edilmiş bir kamera ile kalbi fotoğraflayın.

Sonuçlar

10 günlük farelerin anestezisi. 10 günlük yavrular 4-5 dakika içinde% 4.5 izofluran ile uyuşturulabilir; Bununla birlikte, entübasyona hazırlık sürecinde anesteziden kurtulurlar. Küçük boyutları nedeniyle, standart bir burun konisi tarafından verilen izofluran anestezisi altında entübasyon mümkün değildir. Daha önce 15 ve 21 günlük yavrularda ve ^4,7 günlük yetişkinlerde kardiyotorasik cerrahi için sırasıyla 100/13/0.5...

Tartışmalar

Şu anda, kardiyotorasik cerrahi için 10 günlük farelerin anestezisi ve entübasyonu için iyi belgelenmiş bir yöntem yoktur. Bu amaçla, ketamin / ksilazin / atropin dozaj rejimlerini vücut ağırlığına göre titre ettik, böylece sırasıyla 20/4/0.12 mg / kg, 30/4/0.12 mg / kg ve 50/6/0.18 mg / kg'lık dozlar, düşük (3.15-4.49 g), orta (4.50-5.49 g) ve yüksek (5.50-8.10 g) vücut ağırlığına sahip yavruların entübasyonunu kolaylaştırdı. Entübasyon sonrası sağkalım vücut ağırlığı ile kor...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole (Antisedan)	Provet (NSW) Pty Ltd	ATIP I
Atropine 600 mcg/mL	Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd	1957699 PFIZER-0143386
Betadine	Livingstone International	BU0520
Buprenorphine (Temgesic)	Provet (NSW) Pty Ltd	TEMG I
Fiber-optic light	Leica	3011350	CLS 150X
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 9.1.2
Intubation platform	-	-	Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H)
Isoflurane	Provet (NSW) Pty Ltd	ISOF 07
Ketamine 100 mg/mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1
Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety	BD Insyte	CE0086	19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL
Single lumen polyethylene tube	Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW		Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm
Small forceps	F.S.T.	NO 11051-10
Surgical microscope (camera optional)	Leica	M651 (Leica IC80 HD camera)	10x and 16x objective
Suture 7-0 prolene	Ethicon	8708H
Suture 9-0 polypropylene monofilament	Ethicon	2813
V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm	VetEquip	901820
Vented 2-Liter plexiglass induction chamber	VetQuip Pty Ltd	942102	25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H)
Warming lamp	Brilant Lighting	99223
Xylazine	Provet (NSW) Pty Ltd	XYLA Z 2