用于心胸外科的青春期前小鼠幼崽的麻醉和插管

摘要

>7 日龄小鼠的心胸外科模型需要插管，但这对青春期前（8-14 天大）小鼠幼崽具有挑战性，并且关于插管麻醉方案的信息很少。在这里，我们提出了氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品在 10 天大的 C57BL/6J 小鼠幼崽中的剂量方案，允许气管插管，同时最大限度地减少动物死亡率。

摘要

小鼠手术模型在临床前研究中起着重要作用。可以从0-14日龄小鼠的心胸外科模型中获得心脏损伤后心肌再生的机制见解，其心肌细胞与成人不同，保留增殖能力。7天大的小鼠幼崽通过体温过低有效地固定，心胸外科手术不需要插管。然而，青春期前（8-14 天大）小鼠幼崽确实需要插管，但这具有挑战性，并且几乎没有关于麻醉以促进插管的信息。在这里，我们提出了氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品在 10 天大的 C57BL/6J 小鼠幼崽中的剂量方案，允许气管插管，同时最大限度地减少动物死亡率。氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品剂量方案对体重的经验滴定表明，不同体重的小鼠幼崽对麻醉的反应是非线性的，其中20/4/0.12mg/kg、30/4/0.12mg/kg和50/6/0.18mg/kg的剂量促进了体重在3.15-4.49g（n = 22）、4.50-5.49g（n = 20）和5.50-8.10g（n = 20）之间的幼崽插管， 分别。体重较轻的幼崽比较重的幼崽需要更多的插管尝试（p < 0.001）。插管后生存率与体重相关（低体重、中体重和高体重组分别为 59%、70% 和 80%，R² = 0.995）。对于插管后的心肌梗死手术，用4.5%异氟烷在100%氧气中诱导麻醉手术平面，并在100%氧气中用2%异氟醚维持。三个体重组的术后生存率相似，分别为92%、86%和88%（p=0.91）。再加上插管和手术动物处理实践的改进，以及手术后母亲的自相残杀，整个手术（插管加手术）的总生存期与体重相关（低、中、高体重组分别为 55%、60% 和 70%，R² = 0.978）。鉴于 10 日龄幼犬插管遇到的困难以及相关的高死亡率，我们建议 10 日龄幼犬的心胸外科手术仅限于体重至少为 5.5 g 的幼犬。

引言

小鼠模型是临床前心胸研究中的宝贵工具，特别是因为可以轻松生成基因工程小鼠系，并且易于通过手术操作小鼠以提供病理疾病模型，例如，研究心脏损伤后的心肌再生¹.在这方面，有趣的是，与心肌细胞已退出细胞周期的成年小鼠不同，0-2天大的新生小鼠心脏在心尖切除或诱导心肌梗死后以最小的疤痕修复2，^3，4。相比之下，7 天大的新生儿心脏再生不完全，瘢痕形成发生率更高^2，3。由于左心室顶端的心肌细胞在出生后长达2周内保持增殖能力，因此0-14日龄小鼠心脏损伤后再生的机制研究可能有助于确定受损成人心脏再生的治疗靶点⁵。

心脏损伤小鼠模型的开发涉及麻醉下的手术操作。这需要打开胸部以进入心脏，这通常需要插管和机械通气。小鼠品系、体重和年龄影响对麻醉剂的敏感性⁶.成年小鼠可以用多种药物麻醉，一种常见的插管方案是氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品，浓度为100/13/0.5mg/kg^6，7。新生小鼠（0-7日龄）缺乏集中性疼痛反射，可以有效地固定在冰上，无需插管即可进行手术⁶，^8，9。青春期前（8-14天大）小鼠幼崽不能用低温^麻醉9^，10;他们需要插管进行心胸外科手术。以前没有关于14天以下青春期前小鼠心胸外科手术的研究。根据我们的经验，14日龄以下异氟烷麻醉的青春期前小鼠的插管是困难的。为7天以上的小鼠报告的推荐注射麻醉方案为50-150mg / kg氯胺酮和5-10mg / kg甲苯噻嗪¹⁰。青春期前的小鼠仍在神经发育，它们对药物和药物代谢的反应与^{成年动物有很大}不同6。这增加了液体、电解质和酸碱失衡的风险，以及低血糖和体温过低的风险，这不仅是因为它们的高代谢率会迅速耗尽它们有限的能量储存，而且还因为它们的体温调节不成熟6，^11，12。因此，关于既能促进插管又能最大限度地提高青春期前小鼠存活率的麻醉方案的信息很少。

在这里，我们经验滴定了10天大的C57BL / 6J小鼠幼崽中氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品的剂量方案，重量范围为3-8g，以达到足够的麻醉平面，允许气管插管进行后续心胸手术，同时最大限度地减少动物死亡率。我们还改进了动物处理方法，以降低插管、手术和手术后母体同类相食的死亡率。

研究方案

所描述的所有动物实验均由Garvan/St Vincent医院动物伦理委员会根据《澳大利亚科学用途动物护理和使用实践守则》和ARRIVE指南批准，所有实验均由经验丰富的小动物外科医生（JW）在儿科麻醉师（JJS）的指导下进行。

1. 仪器的准备

1. 在手术当天，设置专门设备对10日龄幼崽进行插管（图1A，B）。这包括一个加热灯、插管平台、光纤灯、小镊子、一个由一段直径为 0.02 毫米的铜线制成的喉镜（长度为 60 毫米，线的末端以 175° 角塑造成直径为 3 毫米的圆; 图1B）和一个24号塑料静脉（IV）插管，用作气管插管。
2. 确保套管由连接到 21 mm 塑料母鲁尔锁适配器的 19 mm 长塑料管 （0.7 mm OD） 组成（图 1B）。通过鲁尔锁适配器 插入 一根铜线来加固套管的管子。对于潮气体积为 ~8 μL/g 的小鼠，使用总体积为 130 μL 的套管^13，14。

2.10日龄小鼠的麻醉

1. 在手术当天，从10天大的C57BL / 6J幼崽的笼子中取出大坝，并将笼子放在加热垫（37°C）上。
2. 使用0.5mL胰岛素注射器和29G针头与氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品腹膜内注射10μL麻醉幼崽，比例详见 表1 ，用于不同体重分组。
3. 注射后立即将幼犬放入已用100%氧气预氧合的加热（37°C）有机玻璃室中。

3.10日龄小鼠插管

1. 氧合3-4分钟后，将幼崽转移到基本上与成年小鼠相同的插管平台上进行插管。将小狗置于仰卧位（图 1C）或以 45° 角悬挂¹⁵ 执行此操作。用加热灯保持温度。
   1. 插管前，通过爪捏反射评估麻醉深度。为了获得最佳插管效果，爪子捏反射必须仍然存在，但与有意识的动物相比明显减少。
2. 将麻醉的小狗仰卧固定在插管平台上（图1C）后，用小镊子握住舌头，并使用由一块铜线制成的喉镜（图1B）暴露声门和声带。通过使用柔性光纤光的透射照明来帮助声带可视化（图 1D）。
3. 使用加固的套管，倾斜套管，使鲁尔锁端略低于尖端（~10°），一旦声带分离，插入套管并向前推进，直到鲁尔锁适配器刚好在嘴外。插管后立即取下导线。
   注意:除非套管推进得太远，并且从隆突感觉到阻力，否则预计这个年龄的小鼠在插管期间不会产生阻力。
   1. 通过动物自主呼吸的能力评估插管后的麻醉深度。通过短暂阻塞插管导管来确认自主呼吸幼崽气管插管成功，以检查这是否阻止了胸部运动。
4. 立即将插管幼崽转移到加热垫 （37 °C） 上，并将气管插管连接到呼吸机，呼吸机以 1 L/min 的流速提供 100% 氧气，分别为 30 μL/冲程、40 μL /冲程或 50 μL/冲程，分别为 3.15-4.59 g、4.50-5.49 g 或 5.50-8.10 g 幼崽和 150 次/分钟。
5. 在 <15 秒内快速执行这些程序，以尽量减少重新呼吸。

4.10日龄小鼠心肌梗死手术

1. 为了诱导手术麻醉的手术平面，将流入呼吸机的气体从100%氧气切换到4.5%异氟醚氧气（异氟烷浓度由蒸发器测定）4-5分钟。
   1. 改用异氟醚后，通过检查胸壁运动频率是否等于呼吸机的频率来再次确认气管插管。自主呼吸丧失后没有尾巴或爪子捏反射表明已达到麻醉的手术平面（4-5 分钟后）。
2. 用2%异氟醚在氧气中维持麻醉。
3. 如16中所述，在手术显微镜（10倍和¹⁶倍物镜）下进行心肌梗死手术。
   1. 以圆周运动对皮肤进行数次消毒，交替使用碘基或氯己定基磨砂膏和 70% 酒精。使用细剪刀，在胸部左侧壁的第三和第四肋骨（第四肋间隙）之间做一个水平的皮肤切口。使用细镊子，通过钝性解剖肋间隙打开胸部，并使用牵开器保持空间开放。
   2. 通过用 9-0 聚丙烯单丝缝合线结扎左心耳远端的左冠状动脉来诱发心肌梗死。在~10分钟的梗死手术后，用7-0脲炔关闭皮肤，并用βdine消毒切口。用70%乙醇或盐水清洁血液幼崽。
      注意:青春期前幼崽的左冠状动脉结扎基本上是无血的，就像成人结扎一样。
   3. 用0.5 mL胰岛素注射器和29 G针头一个接一个地给药:阿替美唑（1-5mg / kg，10μL，腹膜内），以从镇静，镇痛（丁丙诺啡，0.075mg / kg，10μL，皮下）和生理盐水（50μL，腹膜内）中快速恢复。
4. 通过停用异氟醚让动物恢复。确保此后几分钟内恢复自主呼吸。
   1. 将幼犬送回加热的预充氧室，并在恢复期间持续监测，直到恢复矫正反射，此时拔管幼犬。
   2. 用家用笼子床上用品轻轻擦拭幼犬，保持幼犬温暖，检查呼吸是否规律，以及幼犬是否能够自发运动。这将减少大坝手术后的同类相食。
5. 当所有幼崽从麻醉中完全恢复时，将大坝放回笼子里。
   注意:一只幼犬的准备、麻醉、插管、手术和恢复所需的总时间可能在 40-60 分钟之间。
6. 家坝和幼崽在笼子里过夜，一半打开/一半离开37°C的加热垫。

5.梗死大小的术后评估

1. 在手术后第^{3 天，} 通过将幼崽置于以 4.5 mL/min 流速预平衡的有机玻璃室中以 1 mL/min 的流速麻醉幼崽。
2. 一旦达到麻醉的手术平面（4-5分钟后），通过爪子捏反射进行评估，将幼犬从腔室中取出，并通过胶带将尾巴固定在加热垫上仰卧位。
3. 将线放在门牙上并用胶带固定到位以保持头部伸展，并将头部放入连接到呼吸机的鼻锥中，以 200 μL/冲程、150 次/分钟的速度提供 4.5% 异氟醚的氧气溶液。用2%异氟醚在氧气中维持手术平面麻醉。
4. 用70%乙醇消毒皮肤。使用细剪刀，沿气管在右颈总动脉的皮肤上切开 1 cm 的切口，并使用单腔聚乙烯管（OD 0.61 mm，ID 0.28 mm）插管暴露的血管，施用 0.2 mL 肝素化盐水 （200 U） 1 分钟以防止血液凝固。
5. 将异氟醚在氧气中增加至4.5%1分钟，然后在2秒内快速施用0.2mL的3.3M KCl以阻塞舒张期的心脏。
6. 通过相同的切口 解剖 右颈静脉并横断。用 0.2 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 灌注心脏，然后用 0.1 mL 0.2% 阿尔新蓝灌注，以染色非梗死的远端心肌。检查灌注是否成功，通过颈静脉 冲洗 血液、PBS 和阿尔新蓝。
7. 打开胸部，通过解剖周围的结缔组织和血管来切除心脏以释放心脏。用PBS冲洗心脏，如果需要，可以去除心房，并使用安装在手术显微镜上的相机使用10倍物镜拍摄心脏。

结果

10日龄小鼠的麻醉。 10天大的幼崽可以在4-5分钟内用4.5%异氟醚麻醉;然而，他们在准备插管的过程中从麻醉中恢复过来。由于它们的体积小，在标准鼻锥提供的异氟醚麻醉下插管是不可行的。我们之前曾使用氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品麻醉方案分别为100/13/0.5mg/kg，用于15日龄和21日龄幼犬^{和成人4，7}的心胸外科手术。在包括氧气补充在内的初步实...

讨论

目前，没有充分记录的麻醉和插管10日龄小鼠用于心胸外科手术的方法。为此，我们根据体重滴定氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品剂量方案，其中20/4/0.12mg/kg、30/4/0.12mg/kg和50/6/0.18mg/kg的剂量分别有助于低体重（3.15-4.49g）、中重（4.50-5.49g）和高（5.50-8.10g）的幼崽插管。插管后生存率与体重相关（低、中、高体重组分别为 59%、70% 和 80%）。鉴于 10 日龄幼犬插管遇到的困难以及相关的高死亡率，我们建议 10 ?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole (Antisedan)	Provet (NSW) Pty Ltd	ATIP I
Atropine 600 mcg/mL	Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd	1957699 PFIZER-0143386
Betadine	Livingstone International	BU0520
Buprenorphine (Temgesic)	Provet (NSW) Pty Ltd	TEMG I
Fiber-optic light	Leica	3011350	CLS 150X
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 9.1.2
Intubation platform	-	-	Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H)
Isoflurane	Provet (NSW) Pty Ltd	ISOF 07
Ketamine 100 mg/mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1
Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety	BD Insyte	CE0086	19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL
Single lumen polyethylene tube	Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW		Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm
Small forceps	F.S.T.	NO 11051-10
Surgical microscope (camera optional)	Leica	M651 (Leica IC80 HD camera)	10x and 16x objective
Suture 7-0 prolene	Ethicon	8708H
Suture 9-0 polypropylene monofilament	Ethicon	2813
V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm	VetEquip	901820
Vented 2-Liter plexiglass induction chamber	VetQuip Pty Ltd	942102	25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H)
Warming lamp	Brilant Lighting	99223
Xylazine	Provet (NSW) Pty Ltd	XYLA Z 2