At İskelet Kasının Yüksek Çözünürlüklü Floro-Respirometrisi

Özet

Atlar olağanüstü bir aerobik egzersiz kapasitesine sahiptir, bu da at iskelet kasını hem at egzersiz fizyolojisi hem de memeli mitokondriyal fizyolojisi çalışmaları için önemli bir doku haline getirir. Bu makalede, at iskelet kasında mitokondriyal fonksiyonun kapsamlı değerlendirilmesi için teknikler açıklanmaktadır.

Özet

Mitokondriyal fonksiyon - oksidatif fosforilasyon ve reaktif oksijen türlerinin oluşumu - hem sağlık hem de hastalıkta kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonun ölçülmesi biyomedikal araştırmalarda esastır. İskelet kası, özellikle atlar gibi çok yüksek aerobik kapasiteye sahip hayvanlarda sağlam bir mitokondri kaynağıdır ve bu da onları mitokondriyal fizyolojiyi incelemek için ideal konular haline getirir. Bu makale, farklı mitokondriyal durumlar altında substratları oksitleme kapasitesini ölçmek ve mitokondriyal solunumun farklı elementlerinin göreceli kapasitelerini belirlemek için eşzamanlı florometri ile yüksek çözünürlüklü respirometrinin kullanımını göstermektedir. Tetrametilrhodamine metilester, eşzamanlı oksijen akışı birimi başına üretilen nispi membran potansiyelini hesaplayarak mitokondrinin nispi verimliliğinin hesaplanması da dahil olmak üzere, substrat oksidasyonundan kaynaklanan mitokondriyal membran potansiyelinin üretimini göstermek için kullanılır. ADP'nin ATP'ye dönüşümü, magnezyum için adenilatların farklı afiniteleri nedeniyle reaksiyon odasındaki magnezyum konsantrasyonunda bir değişikliğe neden olur. Bu nedenle, magnezyum yeşili, ATP sentez hızını ölçmek için kullanılabilir ve oksidatif fosforilasyon verimliliğinin daha fazla hesaplanmasına izin verir (fosforilasyonun oksidasyona oranı [P / O]). Son olarak, hidrojen peroksit ile kombine edildiğinde bir floresan ürün (resorufin) üreten Amplex UltraRed'in kullanımı, mitokondriyal solunum sırasında reaktif oksijen türlerinin üretiminin nicelleştirilmesine ve ROS üretimi ile eşzamanlı solunum arasındaki ilişkiye izin verir. Bu teknikler, mitokondriyal fizyolojinin çeşitli simüle edilmiş koşullar altında sağlam bir şekilde nicelleştirilmesine izin verir, böylece bu kritik hücresel bileşenin hem sağlığa hem de hastalığa katkısına ışık tutar.

Giriş

Ökaryotik hücrelerin mitokondrileri, hücreler tarafından iş ve bakım için kullanılan ATP'nin çoğunu üretir¹. ATP'nin mitokondriyal üretiminde önemli bir adım, oksijenin suya dönüştürülmesidir ve bu nedenle mitokondri ve ilişkili hücrelerin metabolik kapasitesi, oksijen tüketiminin ölçülmesiyle sıklıkla ölçülür². Bununla birlikte, mitokondriyal fizyoloji, basit oksijen tüketimi sürecinden daha karmaşıktır ve bu son noktaya güvenmek, mitokondriyal fonksiyonun ve işlev bozukluğunun hücresel sağlık üzerindeki etkisinin eksik bir değerlendirmesini sağlar. Mitokondriyal fonksiyonun tam karakterizasyonu, sadece oksijen tüketiminin değil, aynı zamanda ATP ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin de değerlendirilmesini gerektirir.

Anahtar mitokondriyal fonksiyonların ek ölçümleri, spesifik floroforların kullanımı yoluyla solunum ölçümü ile eşzamanlı olarak gerçekleştirilebilir. Tetrametilrhodamine methylester (TMRM), mitokondriyal matriste mitokondriyal transmembran voltaj potansiyeli ile orantılı olarak biriken ve bu birikim nedeniyle floresan yoğunluğunda bir azalmaya neden olan^katyonik bir florofordur 3. TMRM, mitokondriyal membran potansiyelindeki göreceli değişikliklerin bir göstergesi olarak kullanılabilir veya floresan sinyalinin mV'ye dönüştürülmesine izin veren sabitleri belirlemek için ek deneylerle transmembran voltajındaki hassas değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Magnezyum yeşili (MgG), Mg^{2 +} ile bağlandığında floresan olan bir florofordur ve magnezyum iki değerli katyon⁴ için ADP ve ATP'nin diferansiyel afinitesine dayanan ATP sentezinin ölçümleri için kullanılır. Araştırmacılar, MgG floresanındaki değişiklikleri ATP konsantrasyonundaki bir değişikliğe dönüştürmek için spesifik analitik koşullar altında hem ADP hem de ATP için spesifik afinite / ayrışma sabitlerini (Kd) belirlemelidir. Amplex UltraRed (AmR), mitokondriyal solunum sırasında hidrojen peroksit ve diğer ROS üretimini ölçmek için kullanılan florofordur⁵. H2_O2ve AmR (yaban turpu peroksidaz tarafından katalize edilen) arasındaki reaksiyon, 530 nM'de floresan yoluyla tespit edilebilen resorufin üretir. Bu testlerin her biri, mitokondriyal fizyolojinin ilgili yönlerinin eşzamanlı ölçümlerini sağlamak için gerçek zamanlı mitokondriyal solunum tahlillerine ayrı ayrı eklenebilir, böylece solunum ve mitokondriyal çıktı arasında doğrudan bir bağlantı sağlanır.

Atlar, kısmen at iskelet kasının çok yüksek mitokondriyal içeriğinden dolayı çok yüksek oranda kütleye özgü oksijen tüketimi yeteneğine sahiptir ve bu dokuyu mitokondriyal fizyolojiyi incelemek için oldukça alakalı hale getirir. Yüksek çözünürlüklü respirometrinin gelişmesiyle birlikte, bu yeni teknolojiyi kullanan çalışmalar, at iskelet kası mitokondrisinin hem atların olağanüstü egzersiz kapasitesine hem de iskelet kası hastalıklarının patofizyolojisine katkılarını tanımlamaya yardımcı olmuştur 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . At iskelet kası mitokondriyal fonksiyonu üzerine yapılan çalışmalar özellikle avantajlıdır, çünkü bu dokunun büyük miktarlarının elde edilmesi terminal değildir. Bu nedenle, at denekleri sadece mitokondriyal fonksiyonun tam karakterizasyonu için yeterli doku sağlamakla kalmaz, aynı zamanda mitokondriyal fizyolojiye yüksek kaliteli, mekanik çalışmalar için uzunlamasına kontroller olarak da hizmet eder. Bu nedenle, at iskelet kasında mitokondriyal fizyolojinin daha sağlam bir karakterizasyonunu sağlamak için mitokondriyal membran potansiyelini, ATP sentezini ve bu dokudaki oksijen tüketiminin ölçümünü tamamlayan ROS üretimini ölçmek için ek testler geliştirilmiştir.

Protokol

Bu çalışma Oklahoma Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada temsili sonuçları üretmek için dört safkan jel (17.5 ± 1.3 yıl, 593 ± 45 kg) kullanılmıştır.

1. İskelet kası biyopsi örneğinin alınması

1. Hafif sedasyon altındayken 12 G University College Hospital (UCH) biyopsi iğnesi (bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak ve daha önce yayınlanmış bir raporu takiben lokal anestezi kullanarak, semitendinosus kasının (veya diğer ilgili kasların) merkezinden iskelet kası biyopsileri (steril tekniği izleyin) elde edin¹¹.
2. Biyopsi örneklerini derhal buz gibi soğuk biyopsi taşıma ortamı çözeltisi (2.77 mM CaK 2-EGTA, 7.23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazol, 20 mM taurin, 50 mM K-MES, 0.5 mM ditiyotreitol, 6.56 mM MgCl₂, 5.77 mM ATP ve 15 mM fosfokreatin, pH 7.1'e ayarlanmış; bkz. Analiz için laboratuvara nakliye.
   NOT: Biyopsi nakil ortamının hazırlanmasıyla ilgili özel talimatlar için Doerrier ve ^ark.15'e bakınız.
3. Mitokondrileri, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit kullanarak biyopsi örneklerinden izole edin (bkz. Son depolama tamponu, respirometri testinin bir parçası olan ADP, ATP ve süksinat gibi substratlar içermemelidir.
4. Mitokondri izolasyonu için kullanılan 100 mg kas başına 80 μL süspansiyon ortamı (225 mM mannitol, 75 mM sakkaroz ve 1 mM EGTA; bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak izole mitokondrinin son peletini yeniden askıya alın.
5. Biyopsi prosedüründen mitokondri izolasyonuna kadar olan süreyi en aza indirin ve numuneleri yüksek çözünürlüklü respirometrelere eklenene kadar işleme adımları boyunca 0-4 ° C'de tutun.
   NOT: Ön çalışmalar, izole mitokondri süspansiyonlarının 0-4 ° C'de tutulduğunda yaklaşık 2 saat sonra fonksiyonel kapasitesini kaybetmeye başladığını bulmuştur.

2. Yüksek çözünürlüklü respirometrenin kurulumu

1. Yüksek çözünürlüklü respirometreler, mitokondriyal solunum ve ilişkili süreçleri ölçmek için kullanılır. Respirometreyi kontrol etmek, sensörleri kalibre etmek ve ham verileri toplamak için üretici tarafından sağlanan yazılım kontrol programını kullanın (bkz. Her test koşulu için örnekleri yinelenen olarak analiz edin.
   NOT: Her durumda, bu protokolde açıklanan önerilen titrasyonlar ve nihai reaktif konsantrasyonları 2 mL'lik bir sspirometri odasına dayanmaktadır.
2. Üreticinin talimatlarını izleyerek ditionitin seri titrasyonuyla her 2-4 haftada bir_O2 sensörünün arka planını_O2 akısını ve sıfır noktasını belirleyin. Kalibrasyon tekrarlanana kadar sonraki tahliller için bu kalibrasyon sabitlerini koruyun.
   NOT: O2'nin mitokondriye difüzyon sınırlamasını önlemek için hiperoksinin (250-500 μM) gerekli olduğu geçirgen kas lifleri^11,12,13,16 kullanılarak daha önce yayınlanmış prosedürlerin aksine^, izole mitokondri 50-200 μM _O2 aralığı kullanılarak değerlendirilebilir. Bu, mitokondriyal süspansiyonu eklemeden önce (yani, günlük tek noktalı kalibrasyonu takiben) solunum ortamının oda havasıyla dengelenmesine izin vererek elde edilebilir. Benzer şekilde, solunum odasının yeniden oksijenlenmesi, oksijen konsantrasyonunu istenen seviyeye yükseltmek için yeterli ortam oksijeni respirometri ortamına çözünene kadar odayı açarak gerçekleştirilebilir.
3. Respirometre odalarını magnezyumsuz ortamlarla doldurun (0,5 mM EGTA, 60 mM K-laktobiyonat, 20 mM taurin, 10 mM KH₂PO₄, 20 mM HEPES, 110 mM sakkaroz ve 1 g/L sığır serum albümini [BSA] esas olarak yağ asidi içermez, pH 7,1'e ayarlanır; bkz.
   NOT: Solunum ortamının hazırlanmasıyla ilgili özel talimatlar için Komlodi ve ^ark.17'ye bakınız.
   1. At iskelet kasının bazal sıcaklığını temsil etmek için alet inkübasyon sıcaklığını 38 ° C'ye ayarlayın ve respirometre odasının dibinde dönen manyetik bir karıştırıcı kullanarak solunum ortamının karıştırılmasını 800 rpm'ye ayarlayın.
   2. Floresan sensörlerle etkileşimi önlemek için oda aydınlatmasını kapatın.
   3. Oksijen elektroduna 800 mV polarizasyon voltajı ile enerji verin ve elde edilen sinyali 1 kazanç ayarıyla yükseltin.
   4. Oksijen konsantrasyonunu her 2 saniyede bir kaydedin, oksijen akışını önceki 40 s (20 veri noktası) boyunca oksijen ölçümünün negatif eğimi olarak hesaplayın ve pmol x ^s-1 x mL inkübasyon çözeltisi olarak raporlayın.
4. Ortamın oda havasıyla dengelenmesini sağlayarak oksijen sensörünü kalibre edin. Yüksek çözünürlüklü respirometre ve standart atmosferik oksijen konsantrasyonu ile ölçülen barometrik basınca dayanarak referans oksijen kısmi basıncını hesaplayın.

3. TMRM kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ölçülmesi

1. Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için "Yeşil" floresan sensörleri (530 nm baskın dalga boyu) kullanın. Sensörlere 400-500 mV'de enerji verin; Ortaya çıkan sinyal 1:1.000'lik bir kazançla güçlendirilir.
   NOT: Sensörün lineer aralığında beklenen sinyali yakalamak için her bir cihaz için belirli ayarlar optimize edilmelidir.
2. Mitokondri ilavesinden önce TMRM (2 μM'lik nihai konsantrasyon için 4 μL 1 mM çözelti; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
3. Mitokondri ilavesinden önce, eklenen florofor miktarına (mM) karşı floresan sinyalinin (voltaj) basit iki noktalı kalibrasyonunu kullanarak floresan sinyalini kalibre edin.
   NOT: Bu sinyali kalibre etmek için makine kontrol yazılımındaki floresan sinyal kalibrasyon işlevini kullanın. Floresan probundan gelen ham sinyalin, kalibrasyonun ikinci noktasını kaydetmek için stabilize edilmesi 30 dakika veya daha fazla sürebilir.
4. Respirometri titrasyon protokolünün tamamlanmasından sonra, mitokondriyal membran potansiyelinin tamamen çöktüğünü gösteren TMRM floresan sinyalinde daha fazla artış gözlenmeyene kadar birkaç ayırma maddesi titrasyonu (karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon; titrasyonda 2 μL) vererek TMRM sinyalinin son kalibrasyonunu gerçekleştirin (Şekil 1).
   NOT: Bu floresan sinyal değeri, 0 mV transmembran potansiyeline eşit kabul edilir ve respirometri titrasyon protokolü sırasında kaydedilen bağıl membran potansiyel değerleri için referans noktası olarak kullanılır.

4. Magnezyum yeşili (MgG) kullanarak ATP üretiminin ölçülmesi

1. Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için "Mavi" floresan sensörleri (465 nm baskın dalga boyu) kullanın. Bu sensörlere, sensörün doğrusal aralığında beklenen sinyali yakalamak için ayrı ayrı cihazlar için enerji verin.
2. Mitokondri ilavesinden sonra, ancak herhangi bir substrat eklenmeden önce MgG floresan sinyalinin kimyasal kurulumunu ve kalibrasyonunu gerçekleştirin. MgG'ye bağlanmak için Mg 2+ ile rekabet edebilecek katyonları (özellikle Ca²⁺) şelatlamak için respirometri odasına 8 μL 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin, ardından solunum odasına 4 μL 1 mM MgG (1.1 μM) ekleyin.
3. Ham floresan sinyalini 100 mM MgCl 2'lik 10 x 2 μL sıralı titrasyonlarla kalibre ederek floresan sinyalinin stabilizasyonu için titrasyonlar arasında 1 dakika bekleyin (Şekil 2).
   NOT: Tahlilin tamamlanmasının ardından ve makinenin üreticisi ve ilgili yazılım tarafından sağlanan şablonlar kullanılarak çevrimdışı olarak tamamlanan bu işlem, floresan sinyaline (beklenen r² > 0.98) ikinci dereceden bir magnezyum konsantrasyonu eğrisi üretir ve bu eğri, respirometri odasına eklenen bilinen miktarda ADP ve karşılık gelen ATP¹¹ konsantrasyonunu belirlemek için daha önce belirlenen K_d değerleri ile kullanılacaktır.
4. Protokol boyunca ATP konsantrasyonunun zaman içindeki eğimi olan ATP sentezinin hızını belirleyin (Şekil 3).

5. Amplex UltraRed (AmR) kullanarak ROS'un mitokondriyal üretiminin ölçülmesi

1. Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için "Yeşil" floresan sensörleri (530 nm baskın dalga boyu) kullanın. Sensörlere 300-400 mV'da enerji verin; Ortaya çıkan sinyal 1:1.000'lik bir kazançla güçlendirilir. Sensörün lineer aralığında beklenen sinyali yakalamak için her bir cihaz için özel ayarları optimize edin.
   NOT: MgCl 2 olmadan solunum ortamı kullanılıyorsa, AmR testi için reaktifler eklenmeden önce bu eklenmelidir (1-3 μM MgCl₂ üretmek için 100 mM MgCl_2'nin 20-60 μL'si).
2. Mitokondri ilavesinden önce AmR testinin kimyasal kurulumunu ve ilk kalibrasyonunu gerçekleştirin. Reaksiyona müdahale edebilecek katyonları şelatlamak için 30 μmol DTPA (6 μL 5 mM çözeltisi) ekleyin, ardından süperoksit dismutaz (süperoksit anyonları reaktif oksijen üretiminin daha kapsamlı bir tespiti_{için H2O2'ye}dönüştürmek için 5.000 U / mL'lik bir stok çözeltisinin 2 μL'si), yaban turpu peroksidazı (500 U / mL stok çözeltisinin 5 μL'si), ve respirometri odasında sırasıyla 5 U/mL, 1 U/mL ve 10 μM üretmek için Amplex UltraRed (10 mM stok çözeltisinin 2 μL'si) (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Floresan sinyalinin stabilize olmasına izin verin, ardından yaklaşık 5 dakika arayla iki kez 0,2 μmol hidrojen peroksit (günde taze yapılan 40 μM çözeltinin 5 μL'si) ekleyin.
   NOT: H2_O2'nin iki titrasyonundan önceki ve sonraki floresan sinyali, sistemin üç noktalı doğrusal kalibrasyon eğrisini (beklenen r² > 0,95) sağlar ve eğimi, floresan sinyali ile H2_O2'ninüretimi (veya eklenmesi) arasındaki ilişkiyi raporlamada sistemin genel tepkisini yansıtır. Bu sinyali kalibre etmek için makine kontrol yazılımındaki floresan sinyal kalibrasyon işlevini kullanın.
4. Tahlil boyunca ek iki noktalı kalibrasyonlar (günlük olarak taze yapılan 40 μM'lik bir çözeltinin 5 μL'si) gerçekleştirin, böylece respirometrinin kimyası tahlil boyunca değiştikçe tahlilin tepkisinin ayarlanmasına izin verin, bu kalibrasyon noktalarının spesifik zamanlaması araştırmacının takdirine bağlı olarak (Şekil 4).

6. Mitokondriyal solunum ölçümü

1. Her 2 mL inkübasyon odasına 15 μL izole mitokondri süspansiyonu (adım 1.4) ekleyin, böylece sonuçlar 18.75 mg kasın mitokondriyal verimini temsil eder. Kuluçka odasını kapatın. Numunenin homojen bir süspansiyonunu korumak için numuneyi her titrasyonun arasında vorteks yapın.
2. Herhangi bir substrat eklenmeden önce artık oksijen tüketimini (ROX) ölçün. Bu değeri (tipik olarak 0,2 pmol O₂ x s-1 x ^mL-1'den az), protokolün tamamlanmasından sonra substrat/uncoupler/inhibitör titrasyon (SUIT) protokolü^11'deki her adımın oksijen tüketim değerlerinden çıkarın.
   NOT: Hem oksijen sensöründen hem de floresan sensöründen gelen sinyallerin en az 1 dakika boyunca stabilize olmasına izin verilmesi çok önemlidir (birincil sensör sinyallerinin kararlı hesaplanan eğimi ile değerlendirildiği gibi), çünkü genel solunum durumu titrasyonlar tarafından güvenilir sonuçlar elde etmek için değiştirilir. Bu, tüm titrasyon adımları için geçerlidir.
3. At iskelet kası mitokondriyal fonksiyonunun ilk karakterizasyonuna izin veren genel amaçlı bir SUIT kullanın. Nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) üretmek ve Kompleks I (L_N) yoluyla oksitlenen NADH tarafından desteklenen fosforilasyon olmayan (sızıntı) solunumu uyarmak için her odaya sırasıyla piruvat (5 μL 2 M sulu çözelti), glutamat (10 μL 2 M sulu çözelti) ve malat (10 μL 0,4 M sulu çözelti) (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4).
4. Kompleks I (P_N) yoluyla fosforilasyon solunumunu uyarmak için ADP (20 μL 500 mM sulu çözelti; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
5. Kompleks I ve Kompleks II (P_{N + S}) kombinasyonu yoluyla fosforilasyon solunumu üretmek için süksinat (20 μL 1 M sulu çözelti; bakınız Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
   NOT: Hem Kompleks I hem de Kompleks II yoluyla solunumun kombinasyonu ile, oksijen tüketimi, inkübasyon ortamında çözünen oksijenin çoğunu tüketecek kadar yüksek olabilir. O2 konsantrasyonu 50 μM'nin altına düşerse, ölçülen_O2 konsantrasyonu 150 μM'nin üzerine çıkana kadar inkübasyon odasının kapağını açarak inkübasyon ortamını yeniden oksijenlendirin. mitokondriyal solunum için yeterli_O2'yi korumak için bu adımı gerektiği gibi tekrarlayın.
6. Kompleks I'i bloke etmek için rotenon (2 μL 0.1 mM etanol çözeltisi; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. Ortaya çıkan oksijen akısı, Kompleks II'nin tek başına süksinatın oksidasyonu yoluyla mitokondriyal oksijen tüketimini destekleme kapasitesini temsil eder (P_S).
   DİKKAT: Rotenon zehirli bir maddedir. Standart laboratuvar güvenliğini kullanın ve yutulmasından veya solunmasından kaçının.
7. Tek bir biyopsinin alikotlarını içeren bireysel respirometri odaları arasında belirli bir deneysel durum için ortalama değeri hesaplayın.
   NOT: Akı kontrol oranları (FCR'ler) gibi türetilmiş hesaplamalar, farklı yollardaki göreli değişiklikleri tanımlamada değerlidir ve FCR_{Sızıntısı} (L N / P N), FCR N (P _N / P N + S) ve FCR_S (P S / P _{N + S}) içerir. Hesaplanan oksidatif fosforilasyon verimliliği (1-L_N / P_{N + S}), toplam solunum kapasitesine göre ayarlanmış kaçak solunumun genel etkisinin bir tahminini sağlar.

Sonuçlar

Önerilen referans durumu, sağlıklı bir sedanter safkan (zorunlu egzersiz nedeniyle artan zindelik yok) ve postüral kasın merkezinden toplanan, mitokondri bakımından zengin tip I iskelet kası liflerinin yüksek bir yüzdesini içeren ve dinlenme metabolizmasına yaklaşan koşullar altında inkübe edilen taze bir kas örneğidir (yani, 38 ° C ve pH 7.0). Bu koşullar altında, araştırmacı L N değerleri 2.71 ± 0.90, P_N değerleri 62.40 ± 26.22, P_N+S değerleri 93.67 ± 34.7...

Tartışmalar

Yüksek çözünürlüklü respirometrenin standart çıkışına floresan sinyallerin eklenmesi, mitokondriyal fizyoloji hakkında değerli bilgiler sağlar, ancak floresan sinyalinin titiz kalibrasyonu kalite verileri için kritik öneme sahiptir. MgG kullanımı için orijinal protokoller, magnezyum-adenilat ayrışma sabitleri hesaplanırken üretilen kalibrasyon eğrilerinin sonraki tahlillere uygulanabileceğini düşündürmektedir⁴; Bununla birlikte, MgG'den gelen floresan sinyali, bu yakl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A5285
Amplex UltraRed	Life Technologies	A36006
ATP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A2383
BSA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A6003
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	C4830
CCCP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	C2759
DatLab 7.0	Oroboros Inc		Software to operate O2K fluororespirometer
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	D0632
DTPA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	D1133
EGTA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	E4378
Glutamate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	G1626
HEPES	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	H7523
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P8250
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	516813	Must be made fresh daily prior to assay
Imidazole	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	I2399
K-MES	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M8250
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M9272
Magnesium Green	Thermo Fisher Scientific	M3733
Malate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M1000
Mannitol	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M9647
Mitochondrial isolation kit	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	MITOISO1
O2K fluororespirometer	Oroboros Inc		Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.
Phosphocreatine	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P7936
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P1767
Potassium lactobionate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	L2398
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P0662
Pyruvate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P2256	Must be made fresh daily prior to assay
Rotenone	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	R8875
Succinate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	S2378
Sucrose	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	84097
Superoxide dismutase	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	S8160
Taurine	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	T0625
Titration pump	Oroboros Inc
Titration syringes	Oroboros Inc
TMRM	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	T5428
UCH biopsy needle	Millenium Surgical Corp	72-238067	Available in a range of sizes