Alkali Yanığı ile Kornea Neovaskülarizasyonu için Bir Fare Modeli

Özet

Bu protokol, farelerde alkali yanığın neden olduğu kornea neovaskülarizasyonuna odaklanır. Yöntem, patolojik anjiyogenezi ve ilişkili moleküler mekanizmaları incelemek ve kornea neovaskülarizasyonunu önlemek için yeni farmakolojik ajanları test etmek için tekrarlanabilir ve kontrol edilebilir bir kornea hastalığı modeli oluşturur.

Özet

Anjiyogenezin patolojik bir formu olan kornea neovaskülarizasyonu (CoNV), limbüsten avasküler korneaya kan ve lenf damarlarının büyümesini içerir ve şeffaflığı ve görmeyi olumsuz etkiler. Alkali yanığı, CoNV'ye yol açan en yaygın oküler travma formlarından biridir. Bu protokolde, tekrarlanabilirliği sağlamak için CoNV, kontrollü bir şekilde sodyum hidroksit çözeltisi kullanılarak deneysel olarak indüklenir. Alkali yanık modeli, CoNV'nin patolojisini anlamak için yararlıdır ve korneanın avaskülaritesi, şeffaflığı ve erişilebilirliği nedeniyle genel olarak anjiyogenezi incelemek için genişletilebilir. Bu çalışmada, CoNV, diseksiyon mikroskobu altında doğrudan inceleme ve anti-CD31 mAb kullanılarak düz montajlı korneaların immün boyanması ile analiz edildi. Lenfanjiyogenez, anti-LYVE-1 mAb kullanılarak immün boyama ile düz mount kornealarda tespit edildi. Kornea ödemi optik koherens tomografi (OKT) kullanılarak görüntülendi ve ölçüldü. Özetle, bu model mevcut neovaskülarizasyon testlerinin ilerlemesine ve patolojik oküler ve ekstraoküler anjiyogenez için yeni tedavi stratejilerinin keşfedilmesine yardımcı olacaktır.

Giriş

Kornea, anjiyojenik bir ayrıcalık oluşturarak şeffaflığını koruyan avasküler bir dokudur ^1,2. Korneanın hasar görmesi, iltihaplanmaya ve kan ve lenf damarlarının gelişmesine ve ayrıca fibrozise^{neden olabilir 3}. Kornea neovaskülarizasyonu (CoNV) görme bozukluğuna yol açar ve dünya çapında körlüğün ikinci önde gelen nedenidir⁴. CoNV, Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda yaklaşık 1,4 milyon kişiyi etkilemektedir⁵. CoNV, kimyasal yanıklar, enfeksiyonlar, iltihaplanma ve hipoksi ^3,6 dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından indüklenebilir. Kimyasal yanıklar en sık görülen oküler acillerden biridir ve oküler travmanın yaklaşık %13,2'sini oluşturur ve acil değerlendirme ve tedavi gerektirir⁷. Kimyasal yanıklar alkali veya asit yanıkları olabilir, ancak alkali yanıklar daha ciddi yaralanmalara neden olur, çünkü alkali dokuya daha derine nüfuz eder⁸.

Alkali yanığının fare modelleri, CoNV ve yara iyileşmesini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kornea cep anjiyogenezi modeli ^9,10 ile karşılaştırıldığında, alkali yanık modellerinin oluşturulması nispeten basittir ve ayrıca kornea iltihabı, fibroz ve epitel proliferasyonunu incelemek için de kullanılabilir. Bu modeller ayrıca anjiyogenez^11'in korneal sütür modellerinden daha klinik kimyasal yanıklarla daha yakından ilişkilidir. Alkali yanığı ile, aksi takdirde avasküler kornea, iltihaplanma ve anti-anjiyojenik ve pro-anjiyojenik faktörlerdeki dengesizlik nedeniyle kan damarları geliştirir ^1,2. Korneal alkali yanık modellerinin dezavantajları, alkali yanığın alanını ve şiddetini kontrol etmedeki zorluklar, kornea neovaskülarizasyonundaki varyasyon ve aşırı alkali çözeltisi nedeniyle komşu dokuların istemsiz yanmasıdır. Bu çalışmanın amacı, önceden sodyum hidroksit çözeltisine batırılmış filtre kağıdı kullanılarak farelerde kontrollü bir kornea alkali yanık modelini tanımlamaktır. Bu model, anjiyojenik faktörleri, anti-anjiyojenik terapötik reaktifleri ve inflamasyonu ve fibrozu modüle edebilen diğer faktörleri ve reaktifleri incelemek için kullanılabilir.

Protokol

Deneysel prosedürler ve ötenazi de dahil olmak üzere tüm hayvan çalışmaları, Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından AN-8790 Protokol Numarası ile onaylandı.

1. 1 N NaOH hazırlanması

1. 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 4 mL steril deiyonize su ekleyin. 400 mg sodyum hidroksit (NaOH) tartın ve tüpe dikkatlice ekleyin.
2. Çözeltiyi bir cam çubuk kullanarak yavaşça karıştırarak NaOH'yi çözün. Tüpe steril deiyonize su ekleyerek hacmi 10 mL'ye çıkarın ve tüpü hafifçe yukarı ve aşağı çevirerek tekrar karıştırın. Kapağı sıkıca kapatın ve çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın.
3. Taze çözeltiyi her ay hazırlayın, çünkü NaOH çözeltisinin konsantrasyonu, havadaki karbondioksiti emen çözelti tarafından azaltılabilir.
4. Kullanmadan önce daima NaOH çözeltisini hafifçe karıştırın.
   DİKKAT: Çözeltiyi kimyasal bir başlık içinde hazırlayın ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın.

2.% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisinin hazırlanması

1. Bir cam behere 30 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. 4 g paraformaldehit (PFA) tartın ve behere ekleyin.
2. Beheri karıştırarak 60 °C'de sıcak bir tabakta tutun. Çözelti temizlenene kadar pH'ı yükseltmek için 1 N NaOH çözeltisini damla damla ekleyin.
3. 1 N hidroklorik asit (HCl) kullanarak pH'ı kontrol edin ve 7,4'e ayarlayın. Son hacmi 1x PBS ile 50 mL'ye ayarlayın.
4. Çözeltiyi soğutun ve süzün. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
   DİKKAT: Uygun KKD giyerken çözeltiyi çeker ocakta hazırlayın.

3. Ketamin / ksilazin kokteylinin hazırlanması

1. 9.4 mL saline 0.8 mL ketamin (stok konsantrasyonu: 100 mg/mL) ve 0.16 mL ksilazin (stok konsantrasyonu: 100 mg/mL) ekleyerek ketamin/ksilazin kokteylini hazırlayın.
2. Kokteyli steril enjeksiyon şişelerinde oda sıcaklığında (RT) saklayın.

4. Fare korneasında alkali yanığı

1. Ağrının giderilmesi için işlemden 30 dakika önce deri altına meloksikam (4-6 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin. Fareleri (C57BL / 6J, 6-8 haftalık, erkek) ketamin / ksilazin kokteylinin (Ketamin 80 mg / kg ve Xylazine 16 mg / kg vücut ağırlığı) bir ip enjeksiyonu kullanarak uyuşturun.
2. Farenin ayak parmaklarını sıkıştırarak refleks tepkisini (pedal çekme) kontrol edin ve refleksin olmadığını onaylayın. Bir gözün kornea yüzeyine bir damla topikal anestezik,% 0.5 proparakain ve diğer göze bir damla suni gözyaşı uygulayın.
3. 2 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanarak Whatman filtre kağıdı disklerini delin.
4. Temiz bir Petri kabına 2 μL 1N NaOH ekleyin. 2 mm'lik filtre kağıdı diskini 1 N NaOH damlasının üzerine koyun ve 15 saniye bekletin.
5. Filtre kağıdını forseps ile alın ve filtre kağıdını korneanın ortasındaki proparakain ile tedavi edilmiş göze 30 saniye boyunca uygulayın.
   NOT: Filtre kağıdı sadece korneanın ortasına temas etmelidir ve filtre kağıdının hareket ettirilmesi bitişik dokularda yanıklara neden olabileceğinden, yerleştirildikten sonra filtre kağıdının hareket etmemesine özen gösterilmelidir.
6. Steril bir şırıngada 20 mL steril salin solüsyonu ile yıkayarak gözü yıkayın.
   NOT: Korneaya veya çevresindeki dokuya daha fazla zarar vermemek için korneanın konjonktival kese ile birlikte iyice yıkanmasına özen gösterilmelidir. Konjonktival kesenin yıkanması semblefaronu daha da önleyecektir.
7. Tek kullanımlık yumuşak mendiller kullanarak fazla tuzlu suyu gözlerden ve çevresinden nazikçe silin. Daha sonra, fareleri ambulatuvar olana kadar ılık bir ısıtma yastığı üzerinde bir kurtarma kafesinde tutun.
   NOT: Fareler, alkali yanığından sonra 3 gün boyunca günlük olarak izlenir. Ağrı veya stres belirtileri görülürse, meloksikam (4-6 mg / kg vücut ağırlığı) deri altına uygulanır.

5. Neovaskülarizasyon ve opaklığın incelenmesi ve değerlendirilmesi

1. Anestezi uygulanmış farelerde, yanıktan sonraki 10. günde gözleri diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve opaklığı ve neovaskülarizasyonu puanlamak için diseksiyon kapsamına bağlı bir kamera kullanarak görüntüler elde edin.
   NOT: Kamera takılıyken normal bir diseksiyon kapsamı yeterlidir.
2. Korneayı diseksiyon mikroskobu ile gözlemlerken, yanıktan sonraki opaklığı aşağıdaki ölçek^12'ye göre puanlayın:
   0 = Opaklık yok; korneayı temizle
   1 = Hafif opaklık; iris ve öğrenci bölgelerinde hafif bulanıklık; iris ve göz bebeği kolayca görülebilir
   2 = Orta derecede opaklık; iris ve göz bebeği zar zor görülebilir
   3 = Şiddetli opaklık; iris veya göz bebeği görünmüyor
   4 = Opak kornea; iris ve göz bebeği görünmüyor
3. Korneayı diseksiyon mikroskobu ile gözlemlerken, CoNV'yi aşağıdaki ölçek^12'ye göre puanlayın:
   0 = Neovaskülarizasyon yok; Limbus'tan yeni damar yok
   1 = Hafif neovaskülarizasyon; Limbustan kaynaklanan yeni damarlar
   2 = Orta derecede neovaskülarizasyon; Kan damarları limbustan kaynaklanır ve korneanın merkezine doğru büyür
   3 = Şiddetli neovaskülarizasyon; Limbustan kaynaklanan ve korneanın merkezine ulaşan ve/veya geçen kan damarları
4. Alkali yanığı ve sağlıklı göz grupları arasındaki opaklık ve neovaskülarizasyon skorlarını istatistiksel olarak karşılaştırmak için bir Öğrenci t-testi kullanın.
5. Fareleri 10. günde, solunum durduktan 1 dakika sonrasına kadar% 5'te izofluran maruziyeti ile ötenazi yapın, ardından servikal çıkık yapın ve düz montajlı görüntüleme için korneaları toplayın.

6. Optik koherens tomografi (OCT) görüntüleme

1. Yanıktan sonraki 10. günde anestezi uygulanmış farelerde gözlerin ön segmentinin OCT görüntülerini alın. 30° görüş alanı ve %100 IR yoğunluğu ile IR + OCT modunu kullanarak OCT görüntü alımını hacim taraması olarak gerçekleştirin.
2. ImageJ yazılımını kullanarak korneaların kalınlığını ölçün.
3. Kalınlığı ölçmek için, merkezi korneadaki ön ve arka yüzeyler arasında düz bir çizgi oluşturmak için ImageJ yazılımındaki Çizgi Seçimi aracını kullanın.
4. Değerleri veri penceresine aktarmak için yazılım araçlarında Analiz Et > Ölç'e tıklayın.
5. Değerleri bir elektronik tablo dosyasına kopyalayın ve bir Öğrenci t-testi kullanarak alkali yanığı ve sağlıklı göz grupları arasındaki kornea kalınlığını istatistiksel olarak karşılaştırın.
   NOT: Korneanın kalınlığı, kornea ön yüzeyindeki bir noktadan kornea merkezindeki arka kornea yüzeyine en yakın noktaya olan mesafedir.

7. Düz monteli kornealarda CoNV için immün boyama

1. Alkali yanığından sonraki 10. günde farelere ötenazi yapın ve künt diseksiyonla gözleri enüklee edin.
2. Başparmak ve işaret parmaklarını kullanarak göz kapaklarını ayırın ve forsepsleri göz küresinin altına yerleştirin. Forsepsleri kapatın ve göz küresini yavaşça yörüngeden çekin.
3. Gözbebeklerini 1x PBS'ye yerleştirin. Her göz küresi için, önce limbus bölgesinin altında 30 G'lık bir iğne kullanarak bir kesi yaparak korneayı göz küresinden çıkarın.
4. Kesi başlangıç noktası olacak şekilde kornea mikro makası kullanarak limbus bölgesini kesin ve kornea ile limbusu küreden yavaşça ayırın.
5. İrisi çıkarmak için ince bir boya fırçası kullanarak korneaları nazikçe temizleyin. Korneaları 1 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
6. Korneaları oda sıcaklığında (RT) 1x PBS'de her biri 20 dakika boyunca üç kez yıkayın.
7. RT'de 1 saat boyunca bir bloke edici tamponda (% 0.1 Triton-X 100 ve% 5 sığır serum albümini [BSA] ile desteklenmiş 1x PBS) inkübe edin.
8. Korneaları primer antikorlar içeren bir antikor çözeltisine aktarın. Antikor solüsyonunu %1 BSA, %0.1 Triton-X 100, Dylight550-konjuge anti-CD31 mAb (1:100) ve Alexa Fluor488-konjuge anti-LYVE-1 mAb (1:100) ile takviye edilmiş 1x PBS'de hazırlayın.
9. 4 °C'de 3 gün inkübe edin. Korneaları 1x PBS'de her biri 20 dakika boyunca üç kez yıkayın.
10. Karanlıkta 5 dakika boyunca Hoechst boyama solüsyonu (1:1.000) kullanarak çekirdekleri boyayın.
11. Korneaları radyal kesimlerle düzleştirin ve montaj ortamı ve lameller kullanarak önceden temizlenmiş bir cam kızak üzerine monte edin. Lamelleri şeffaf oje ile kapatın ve konfokal mikroskopi ile analiz edilmeden önce slaytları gece boyunca karanlıkta kurutun.
12. Düz monte edilmiş korneaları, tek tek Z-yığını görüntülerini dikerek konfokal mikroskopi kullanarak görüntüleyin; Rezonanssız galvano tarayıcılarda 10x objektif, 488 nm ve 561 nm lazerler ve dilim başına 512 piksel x 512 piksel çözünürlük kullanın.
13. ImageJ yazılımını kullanarak CD31+ kan ve LYVE-1⁺ lenf damarlarının yoğunluğunu ölçün.
14. Vasküler yoğunluğu belirlemek için konfokal görüntüleri 8 bitlik bir görüntüye dönüştürün.
15. Eklentilerden Vasküler Yoğunluk'u seçin.
16. Görüntüde ilgilendiğiniz bölgeyi seçin ve Tamam'a tıklayın. Ölçümler yeni bir veri penceresinde açılacaktır.
17. Değerleri bir elektronik tablo dosyasına kopyalayın ve bir Öğrenci t-testi kullanarak alkali yanığı ile sağlıklı göz grupları arasındaki vasküler yoğunluğu istatistiksel olarak karşılaştırın.
    NOT: Trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM-1) olarak da adlandırılan CD31, anjiyogenezde yer alan bir hücre adezyon molekülüdür ve erken ve olgun kan damarlarının endotel hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilir¹³. LYVE-1 (lenfatik damar endotelyal hyaluronan reseptörü-1), lenfatik endotel hücreleri üzerinde bir hücre yüzeyi belirtecidir ve bir lenfanjiyogenez belirteci^{olarak kullanılabilir 14}.

Tartışmalar

Kornea, anjiyogenez ve inflamasyonu incelemek için mükemmel bir dokudur, çünkü erişilebilir ve avaskülerdir, bu da neovaskülarizasyonun kolayca tespit edilebileceği ve belgelenebileceği anlamına gelir. Tavşanlarda, sıçanlarda ve farelerde kornea yanığı, kornea anjiyogenezini, inflamasyonu ve opaklığı, ülserasyonu, korneanın delinmesini ve fibrozu incelemek için kullanılmıştır^15,16,17. Ayrıca, kornea yanığının fare modeli, anjiyogenez ve iltihaplanma için çeşitli terapötik stratejileri test etmek için değerlidir, çünkü fareler insanlarınkiyle yakından ilişkili bir bağışıklık sistemine sahiptir¹⁸. Fare genomunu genetik olarak manipüle etmek için tekniklerin mevcudiyeti de türü bu tür bir çalışma için mükemmel bir seçim haline getirmektedir¹⁹. Bu araştırmadaki zorluk, tutarlı, tekrarlanabilir patofizyoloji sağlayan bir kornea yanığı yöntemi geliştirmek olmuştur.

Alkali yanık modeli, anjiyogenez, inflamasyon ve fibrozu modüle eden ilaçların farmakolojik taraması için özellikle yararlıdır. Reaktifler ve kaynaklar için minimum gereksinimler, alkali yakma işleminin gerçekleştirilmesinin basitliği ve protokolün kısa süresinin faydaları ve sonuçların doğrudan gözlemlenmesi, fare korneasında alkali yanığını farmakolojik ilaç taraması için birincil seçenek haline getirir. Bununla birlikte, tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği sağlamak için bu prosedürü gerçekleştirirken birkaç önlem dikkate alınmalıdır. İlk olarak, gözün diğer bölgelerini, özellikle limbus, göz kapaklarını ve konjonktivayı yakmamak için filtre kağıdı korneanın ortasına yerleştirilmelidir; ikinci olarak, NaOH'nin hacmi ve konsantrasyonu, korneadaki alkali yanığından tutarlı sonuçlar elde etmek için uygun olmalıdır. Filtre ıslak damlamamalı, NaOH çözeltisine batırılmış olmalıdır. Filtre boyutu ve filtre tipi ile bu yöntemde kullanılan çözeltinin normalliği ve hacmi, NaOH taşmasını önlemek için optimize edilmiştir. Farklı boyutta bir filtre kağıdı veya daha yüksek veya daha düşük hacimde NaOH kullanılması neovaskülarizasyonda tutarsızlıklara neden olur. Üçüncü olarak, kullanımdan sonra çözeltinin tüp kapağını hemen sıkarak ve hava/çözelti oranını düşürerek NaOH çözeltisinin oda havasındaki_CO2'yi emmesini önlemek önemlidir. Neovaskülarizasyonda tutarsızlıkları önlemek ve kornea ülserasyonunu önlemek için taze alkali solüsyonların kullanılmasına özen gösterilmelidir. Son olarak, kornea ve gözün çevresindeki dokulara daha fazla zarar gelmesini önlemek için tüm NaOH solüsyonunun gözden ve konjonktivadan salinle kapsamlı bir şekilde yıkanması gerekir. Korneanın ve komşu dokuların iyice yıkanması da semblefaronu önleyecektir.

Burada tarif edilen protokol, kornea anjiyogenezinin patofizyolojisini incelemek için etkili ve güvenilir bir yöntemdir. Bu protokol ayrıca kornea iltihabı, fibroz ve yara iyileşmesini incelemek için de kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira	KL-7302
30 G Needle	McKesson	16-N3005
A1R Confocal	Nikon Instruments
Anti-CD31	Novus Biologicals	NB100-1642R
Anti-LYVE-1	Life technologies	53-0443-82
ASM Module	Heidelberg Engineering		Anterior segment objective
Biopsy Punch	McKesson	16-1309
BSA	Thermoscientific	9048-46-8
Coverslip	VWR International	22X22-1-601640G
Dissection Microscope	AmScope	SM-4TZ-30WY-10M3
Fluoromount-G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Forceps	Fine Science Tools	15000-02
Forceps	Fine Science Tools	11049-10
Forceps	Fisherbrand	12-000-157
Forceps	Roboz	RS-4905
Gonak Hypromellose	Akorn	17478006412
GraphPad Prism 9	GraphPad Sotware, Inc
Heating pad	K&H Pet Products	100213018
Hoescht	Life Technologies	62249
HRA + OCT Spectralis	Heidelberg Engineering
Insulin Syringe	Mckesson	102-SN310C31516P
Kimwipe	Kimberly Clark Professional	34155
Micro Cover Glass	VWR	48366-067
Microscissors	Roboz	RS-5110
Microscopic Slide	Fisherbrand	12-550-15
NaOH	Sigma Aldrich	55881-500G
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone	Bausch & Lomb	24208-0795-35
Normal Serum	Jackson Immuno	008-000-121
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127-500G
PBS	Gibco	20012-027
Proparacaine HCl	Bausch & Lomb	24208073006
Saline	Henry Schein	1531042
SMZ125	Nikon Instruments
Syringe 10 mL	McKesson	16-S10C
Triton X-100	Sigma Aldrich	TX1568-1
Whatmann Filter Paper	Cytiva	WHA1003323