Murin İntrapulmoner Trakeal Transplantasyon: Akciğer Transplantasyonu Sonrası Obliteratif Hava Yolu Hastalığının Araştırılmasında Bir Model

Özet

Murin intrapulmoner trakeal transplantasyon (IPTT) modeli, akciğer transplantasyonu sonrası obliteratif hava yolu hastalığını (OAD) incelemek için değerlidir. Allotransplantasyon sonrası hava yolu obliterasyonunda akciğere özgü immünolojik ve anjiyojenik davranış hakkında yüksek tekrarlanabilirlik ile bilgi sunar. Burada, IPTT prosedürünü ve beklenen sonuçlarını açıklıyoruz.

Özet

Murin intrapulmoner trakeal transplantasyon (IPTT), akciğer transplantasyonunu takiben obliteratif hava yolu hastalığının (OAD) bir modeli olarak kullanılmaktadır. İlk olarak ekibimiz tarafından bildirilen bu model, yüksek teknik tekrarlanabilirliği ve immünolojik davranışların ve terapötik müdahalelerin araştırılmasına uygunluğu nedeniyle OAD çalışmasında kullanım kazanmıştır.

IPTT modelinde, bir kemirgen trakeal grefti, plevra yoluyla doğrudan alıcının akciğerine yerleştirilir. Bu model, greftlerin deri altı veya omental bölgelere nakledildiği heterotopik trakeal transplantasyon (HTT) modelinden ve donör trakeanın alıcının trakeasının yerini aldığı ortotopik trakeal transplantasyon (OTT) modelinden farklıdır.

IPTT modelinin başarılı bir şekilde uygulanması, ileri anestezi ve cerrahi beceriler gerektirir. Anestezik beceriler, alıcının endotrakeal entübasyonunu, uygun ventilasyon parametrelerinin ayarlanmasını ve anesteziden sonra uygun zamanlanmış ekstübasyonu içerir. Cerrahi beceriler, akciğere hassas greft yerleştirilmesi ve hava sızıntısı ve kanamayı önlemek için viseral plevranın etkili bir şekilde kapatılmasını sağlamak için gereklidir. Genel olarak öğrenme süreci yaklaşık 2 ay sürmektedir.

HTT ve OTT modellerinden farklı olarak, IPTT modelinde, allogreft hava yolu, ilgili akciğer mikroçevresinde hava yolu obliterasyonu geliştirir. Bu, araştırmacıların akciğer transplantasyonundan sonra hava yolu obliterasyonunda rol oynayan akciğere özgü immünolojik ve anjiyojenik süreçleri incelemelerine olanak tanır. Ayrıca, bu model, insan akciğer allogreftlerinde de görülen üçüncül lenfoid organları (TLO'lar) sergilemesi bakımından da benzersizdir. TLO'lar, T ve B hücre popülasyonlarından oluşur ve immün hücre alımını yönlendiren yüksek endotelyal venüllerin varlığı ile karakterize edilir; Bu nedenle, greft kabulü ve reddinde çok önemli bir rol oynamaları muhtemeldir. IPTT modelinin, akciğer nakli allogreftinde hava yolu obliterasyonunun gelişiminde rol oynayan intrapulmoner immün ve profibrotik yolakları incelemek için yararlı bir araç olduğu sonucuna vardık.

Giriş

Akciğer nakli, son dönem solunum yolu hastalıkları olan hastalar için etkili bir tedavi olarak kurulmuştur. Bununla birlikte, insan akciğer nakli alıcıları için medyan sağkalım oranı sadece yaklaşık 6 yıldır ve bir tür obstrüktif hava yolu hastalığı (OAD) olan obliteratif bronşiyolit (OB) gelişimi, transplantasyondan sonraki ilk yıldan sonra önemli bir ölüm nedenidir¹.

OAD'nin altında yatan mekanizmayı araştırmak için çeşitli hayvan modelleri kullanılmıştır. Böyle bir model, heterotopik trakeal transplantasyon (HTT) model^2'dir. Bu modelde, trakeal greftler alıcının deri altı dokusuna veya omentumuna implante edilir. İskemiye bağlı trakeal greft epitel hücrelerinin kaybı meydana gelir, bunu alloreaktif lenfosit infiltrasyonu ve donör epitel hücrelerinin apoptozu izler. Fibroblastlar ve miyofibroblastlar trakea etrafında göç ederek hücre dışı bir matris oluşturur. Son olarak, hava yolu lümeninin tamamen fibröz obliterasyonu meydana gelir. HTT modeli teknik olarak basittir, in vivo bir ortam sağlar ve yüksek tekrarlanabilirlik sunar.

OAD'yi incelemek için başka bir model, fizyolojik ventilasyonu sürdürmek için trakeal greftlerin alıcının trakeasına yerleştirildiği sıçan ortotopik trakeal transplantasyon (OTT) modelidir³. Bu modelde, donör epitel hücrelerinin iskemiye bağlı tükenmesi, bunların trakea içindeki alıcı epitel hücreleri ile yer değiştirmesine neden olur ve orta derecede fibrozun eşlik ettiği tıkanmamış bir hava yolu oluşturur. Bu modeller akciğer transplantasyonu sonrası hava yolu obliterasyonunun anlaşılmasına katkıda bulunmuş olsa da, akciğer parankimal mikroçevresinin rekapitülasyonu açısından sınırlılıkları vardır.

Araştırma grubumuz, trakeal greftlerin alıcı akciğere^implante edildiği sıçan intrapulmoner trakeal transplantasyon (IPTT) modelini tanıttı 4 (Şekil 1). IPTT modeli, akciğer mikroçevresinde meydana gelen hava yolu lümeninin fibröz obliterasyonunu sergiler. Ayrıca, sıçan IPTT ^{5,6,7,8,9,10'dan} teknik olarak daha zorlu olan farelere başarıyla uygulanmıştır. Murin IPTT modelinin bu adaptasyonu, transgenik fareler kullanılarak akciğer nakli sonrası OAD'nin akciğer immünolojik ortamının karmaşık ayrıntılarını daha derinlemesine incelememizi sağladı.

IPTT modeli bazı benzersiz özelliklere sahiptir. Bunlardan biri, pulmoner dolaşım ile kolaylaştırılan ve hava yolu obliterasyonunda çok önemli bir rol oynayan neoanjiyogenezdir ^4,10. Ek olarak, IPTT modeli, bazıları periferik düğüm adresini eksprese eden yüksek endotelyal venüllere sahip olan lenfoid agregatlar sergiler ve bunların üçüncül lenfoid organlar (TLO'lar) olduğunu ^gösterir7,8. TLO'lar lenf nodlarına benzer ve T hücreleri, B hücreleri ve sıklıkla foliküler dendritik hücrelerin eşlik ettiği bir germinal merkezden oluşur ^11,12. Hava yolu obliterasyonu da dahil olmak üzere çeşitli kronik inflamatuar hastalıklarda TLO'lar bildirilmiştir, bu da IPTT modelini TLO'ların hava yolu obliterasyonundaki rolünü araştırmak için uygun hale getirir 7,8,11,12,13. Bu makale, araştırmacıları bu modele alıştırmak ve akciğer transplantasyonunu takiben hava yolu obliterasyonu ile ilgili daha fazla araştırmayı kolaylaştırmak amacıyla murin IPTT modelinin metodolojisini sunmaktadır.

Protokol

Tüm hayvanlar, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi tarafından Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda belirtilen yönergelere uygun olarak tedavi edildi. Deney protokolü, Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü, Üniversite Sağlık Ağı Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Donör ameliyatı

NOT: BALB/c fareleri, deney için donör örneği olarak kullanılmıştır. Tüm prosedürler steril bir teknik kullanılarak yapılmalıdır.

1. İşlemden önce, her farenin ağırlığını kaydedin.
2. Bir CO₂ odası kullanarak fareyi ötenazi yapın.
3. Ölüm onaylandıktan sonra, fareyi sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve uzuvları bantla sabitleyin.
4. Ameliyat bölgesini %70 izopropil alkol ile sterilize ederek hazırlayın.
   NOT: Gerekirse ve yerel hayvan etik komitesi tarafından önerildiği gibi, kürkü kesi bölgesinden kırpın.
5. Ciltte orta karın bölgesinden başlayıp ön servikal bölgeye kadar uzanan orta hat kesisi yapın.
6. Yağ yastıkçıklarını dikkatlice geri çekerek, kayış kaslarını yanal olarak hareket ettirerek ve trakeayı çevreleyen bağ dokusundan ayırarak trakeaya erişin. Trakea ve yemek borusu arasında boşluk oluşturmak için forseps kullanın.
7. Ksifoidi kaldırın ve diyaframı kesin.
8. Sternumu kaldırın, bir hemostat yerleştirerek sternumdan boyun bölgesine açık bir yol sağlayın. Göğüs kafesini her iki taraftan sıkıştırın ve boyun kaslarından yukarı doğru uzanarak sternumdan kesin.
9. Trakeal çatallanmayı ortaya çıkarmak için timusu ve trakeayı tıkayan herhangi bir yağ veya kası çıkarın.
10. Hem ana bronşları kesin hem de hava yolunu yemek borusundan dikkatlice ayırın.
11. Gırtlağı kesin ve çıkarın.
12. Diseke edilen trakeaya steril salin solüsyonu veya steril salin veya koruma solüsyonuna batırılmış steril gazlı bez ile koruma solüsyonu püskürtün ve canlılığını korumak için buzun üzerine yerleştirin.

2. Alıcı cerrahisi

NOT: C57BL/6 fareler, deney için alıcılara örnek olarak kullanılmıştır.

1. Ameliyat gününün sabahı sürekli salimli buprenorfini deri altına 1 mg/kg'lık bir dozda uygulayın.
2. % 5 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında anesteziyi indükleyin.
3. Fare hafifçe uyuşturulduktan sonra, intraperitoneal olarak (0.1 mg / g) ksilazin ve (0.01 mg / g) ketaminden oluşan bir kokteyl enjekte edin.
4. Fareyi% 2-3 izofluran ile indüksiyon odasına geri koyun.
5. Ameliyat bölgesinde kürkü tıraş edin. Ayrıca, bupivakaini planlanan insicisyon bölgesi boyunca deri altından 7 mg / kg'lık bir dozda bir çizgi bloğu olarak uygulayın.
6. Orotrakeal entübasyondan önce ayak parmağı tutamına refleks yanıtının olmadığını doğrulayın. 20 G intravenöz kateter kullanarak fareyi orotrakeal olarak entübe edin ve 500 μL tidal hacmi, 120 bpm solunum hızı, %100 oksijen ve %2 izofluran olan bir ventilatöre bağlayın. Bu prosedürü kolaylaştırmak için, hayvanı boynu uzatılmış olarak dikey konumda tutan, dile kelepçe uygulanmış bir stand kullanın.
7. Bir ısıtma yastığını etkinleştirin ve fareyi, başı cerrahtan uzakta ve kuyruğu cerraha bakacak şekilde pedin üzerinde sağ yanal konuma getirin (Şekil 2). Uzuvları bantla sabitleyin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün.
8. Ameliyat bölgesini %7,5 povidon iyot ile ovalayın, %70 izopropil alkol ile sterilize edin ve %10 povidon iyot ile yeniden fırçalayın. Ameliyat bölgesini kaplamak için steril cerrahi örtüler uygulayın.
9. Bu süre zarfında donör trakeasını 16 G'lik bir intravenöz katetere yükleyin (Şekil 3C,D).
10. Alıcının cildinde bir kesi yapmak için neşter kullanın ve kas ve bağ dokusunu dağlayın.
11. Beşinci veya altıncı interkostal boşluğu açın ve iki ekartör kullanarak göğüs kafesini açık tutun.
12. Pamuklu çubuklar ve makas kullanarak inferior pulmoner ligamenti inceleyin.
13. Donör trakea için yolun oluşturulmasını simüle edin (Şekil 3G, H).
14. Sol akciğerin şişirilmesini kolaylaştırmak için ventilatör çıkış tüpünü üç bir vana ile kısmen kapatarak sabitleyin.
15. Sol akciğeri 20 G iğne ile delerek bir yol oluşturun. Delinme derinliğinin kabaca trakeal allogreftin uzunluğuna eşit olmasını sağlamak. Akciğerin kenarındaki delinme bölgesini seçin ( Şekil 3I'de gösterildiği gibi), yolun masa üstüne paralel uzandığından emin olun ( Şekil 3J'de mavi bir daire ile işaretlendiği gibi).
    NOT: Yukarı doğru bir yerleştirme açısı plevral tabakanın penetrasyonuna neden olurken, daha derin bir açı büyük damarlardan kanamaya neden olabilir ( Şekil 3J'de kırmızı çarpı ile işaretlendiği gibi).
16. 16 G intravenöz kateteri sol akciğere yerleştirin ve donör trakeayı sol akciğere ekstrüde edin. Trakeal allogreftin yerleştirilmesinden sonra, çıkış borusundan engelsiz ekspiratuar akışa izin vermek için üç vanayı serbest bırakın.
17. Plevral enjeksiyon bölgesini bir klipsle kapatın (Şekil 3K,L). Klipsi, kenarı akciğer kenarının konturuna uyacak şekilde hizalanacak şekilde (Şekil 3L'de mavi daire ile gösterilmiştir) tam olarak delinme bölgesine yerleştirin.
    NOT: Kırpma bölgesi için yanlış bir konum, etkisiz sızdırmazlığa ve hava sızıntısına neden olabilirken, yetersiz klips derinliği, ameliyat sonrası klipsin ayrılmasına neden olabilir ( Şekil 3L'deki kırmızı çarpı işaretleriyle gösterildiği gibi).
18. Göğüs boşluğunu salin solüsyonu ile doldurun ve salini bir gazlı bezle emdirin.
19. Sol akciğeri yeniden şişirin ve çalışan bir dikiş tekniği kullanarak kaburgaları kapatın.
20. Kesintili dikişlerle kas ve cildi kapatın.
21. Ameliyat sonunda 5 mg/kg'lık bir dozda deri altına meloksikam analjezik uygulayın.
22. Alıcı fareyi uyanık olana kadar gözlemleyin. Ardından, trakeal tüpü çıkarın ve alıcı fareyi bir kafese koyun.
    NOT: Alıcı fareler ayrı ayrı yerleştirilmelidir.
23. Ameliyattan 24 saat sonra başlayarak ve ameliyat sonrası 3 gün boyunca devam ederek deri altı enjeksiyon yoluyla günde bir kez meloksikam (5 mg / kg) uygulayın.

3. Alıcı farelerden örneklerin toplanması

1. % 5 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında anesteziyi indükleyin.
2. Orotrakeal entübasyondan önce ayak parmağı tutamına refleks yanıtının olmadığını doğrulayın. Entübasyon yöntemi ve solunum cihazı ayarı, alıcı cerrahisindekiyle aynıdır.
3. Fareyi sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve uzuvları sabitleyin.
4. Ameliyat bölgesini %70 izopropil alkol ile sterilize ederek hazırlayın.
5. Ciltte orta karın bölgesinden başlayıp ön servikal bölgeye kadar uzanan orta hat kesisi yapın.
6. 25 G'lik bir iğneye bağlı 1 ml'lik bir şırınga kullanarak fareyi inferior vena kava yoluyla kansızlaştırın ve ötenazi ile sonuçlanın.
7. Göğsü açın ve trakeaya donör fare ile aynı şekilde erişin. Trakeayı entübasyon tüpünün etrafına 7-0 ipekle bağlayın.
8. Kalbi ortaya çıkarmak için timüs, yağ ve kasları çıkarın.
9. Sol atriyumu, sağ atriyumu ve inferior vena kavayı kesin. Akciğerleri sağ ventrikül yoluyla 3 mL steril salin ile perfüze edin.
10. Histolojik analiz için, akciğerleri bir entübasyon tüpü aracılığıyla% 10 formalin ile şişirin.
11. Ventilasyon tüpünü ekstübe edin ve trakeayı 7-0 ipekle bağlayın.
12. Gırtlak ve yemek borusunu bölün. Onları daha düşük bir yöne çekin ve ardından kalp ve akciğer bloğunu çıkarın,% 10 formalin içine yerleştirin.

Sonuçlar

Deneyimlerimize dayanarak, bu modeldeki yeterlilik tipik olarak yaklaşık 2 aylık bir eğitim gerektirir. Yeterlilik sağlandıktan sonra, donör prosedürleri tipik olarak 15 dakika gerektirirken, alıcı prosedürleri yaklaşık 30 dakika gerektirir. Eğitimli bir operatör için beklenen ölüm oranı %0'dır.

Şekil 4A'da bir trakeal allogreft fibroblastik doku ile tam obstrüksiyon gösterir ve epitel hücreleri gözle görülür şekilde tahrip edilir. Ter...

Tartışmalar

Murin IPTT prosedürü kritik adımları içerir. Anestezi ile ilgili olarak, ilk önemli adım endotrakeal entübasyondur. Ses tellerini görselleştirmek ve anında entübasyonu kolaylaştırmak için fareyi bacakları masanın üzerinde olacak şekilde uygun bir yükseklikte tutmak önemlidir. Ek olarak, dikkatli solunum hacmi ve pozitif ekspirasyon sonu basıncı (PEEP) ayarlaması gereklidir. Tipik olarak, 25-30 g ağırlığındaki fareler için 500 μL'lik birsolunum hacmi ve 2 cmH2O'luk bir PEEP yeterl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cJ	The Jackson Laboratory	8-10 weeks 25-30 g	Male, Donor
BD 1 mL Syringe	Becton Dickinson	309659
BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD PrecisionGlide	Becton Dickinson	305122
Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture	Bovie	DEL1
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	8-10 weeks 25-30 g	Male, Recipient
Dumont #5/45 Forceps	F·S·T	11251-35
Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers-	Ethicon	LX107
Extra Fine Graefe Forceps	F·S·T	11150-10
Glover Bulldog Clamp	Integra	320-127
Halsted-Mosquito Hemostats	F·S·T	13009-12
Horizon Titanium Ligating Clips	Teleflex	001201
Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures	Leica
Magnetix Fixator with spring lock	CD+ LABS	ACD-001
Microsurgical Scissor	Jarit	277-051
Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687	Harvard	55-0001
Perfadex Plus	XVIVO	19850
Retractor Tip Blunt - 2.5 mm	CD+ LABS	ACD-011
small animal table	CD+ LABS	ACD-003
Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double Armed	Covidien	VP702X
Systane ointment	Alconn	1444062
System Elastomer	CD+ LABS	ACD-007
Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in	Terumo Medical Corporation	SR-OX2025CA
VMT table Top	benson	91803300