Intrapulmonale Trachealtransplantation bei Mäusen: Ein Modell zur Untersuchung obliterativer Atemwegserkrankungen nach Lungentransplantation

Zusammenfassung

Das Modell der intrapulmonalen Trachealtransplantation (IPTT) ist wertvoll für die Untersuchung der obliterativen Atemwegserkrankung (OAD) nach Lungentransplantation. Es bietet Einblicke in das lungenspezifische immunologische und angiogene Verhalten bei der Atemwegsobliteration nach Allotransplantation mit hoher Reproduzierbarkeit. Hier beschreiben wir das IPTT-Verfahren und die zu erwartenden Ergebnisse.

Zusammenfassung

Die intrapulmonale Trachealtransplantation (IPTT) wird als Modell für obliterative Atemwegserkrankungen (OAD) nach Lungentransplantation verwendet. Dieses Modell, das ursprünglich von unserem Team berichtet wurde, hat sich aufgrund seiner hohen technischen Reproduzierbarkeit und Eignung für die Untersuchung immunologischer Verhaltensweisen und therapeutischer Interventionen in der Untersuchung von OAD durchgesetzt.

Im IPTT-Modell wird ein Nagetier-Trachealtransplantat durch das Rippenfell direkt in die Lunge des Empfängers eingeführt. Dieses Modell unterscheidet sich von der heterotopen Trachealtransplantation (HTT), bei der Transplantate in subkutane oder omentale Stellen transplantiert werden, und vom orthotopen Trachealtransplantationsmodell (OTT), bei dem die Spenderluftröhre die Luftröhre des Empfängers ersetzt.

Die erfolgreiche Umsetzung des IPTT-Modells erfordert fortgeschrittene anästhetische und chirurgische Fähigkeiten. Zu den Anästhesiefähigkeiten gehören die endotracheale Intubation des Empfängers, die Einstellung geeigneter Beatmungsparameter und die zeitlich angemessen abgestimmte Extubation nach der Genesung von der Anästhesie. Chirurgische Fähigkeiten sind unerlässlich für die präzise Platzierung des Transplantats in der Lunge und für eine effektive Abdichtung des viszeralen Rippenfells, um Luftleckagen und Blutungen zu verhindern. In der Regel dauert der Lernprozess ca. 2 Monate.

Im Gegensatz zu den HTT- und OTT-Modellen entwickelt der Allotransplantat-Atemweg im IPTT-Modell eine Atemwegsobliteration in der relevanten Lungenmikroumgebung. Dies ermöglicht es den Forschern, lungenspezifische immunologische und angiogene Prozesse zu untersuchen, die an der Verödung der Atemwege nach einer Lungentransplantation beteiligt sind. Darüber hinaus ist dieses Modell auch insofern einzigartig, als es tertiäre lymphatische Organe (TLOs) aufweist, die auch in menschlichen Lungentransplantaten zu finden sind. TLOs bestehen aus T- und B-Zellpopulationen und zeichnen sich durch das Vorhandensein hoher endothelialer Venolen aus, die die Rekrutierung von Immunzellen steuern. Daher spielen sie wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei der Annahme und Abstoßung von Transplantaten. Wir kommen zu dem Schluss, dass das IPTT-Modell ein nützliches Werkzeug ist, um intrapulmonale Immun- und profibrotische Signalwege zu untersuchen, die an der Entwicklung der Atemwegsobliteration im Lungentransplantat-Allotransplantat beteiligt sind.

Einleitung

Die Lungentransplantation hat sich als wirksame Behandlung für Patienten mit Atemwegserkrankungen im Endstadium etabliert. Die mediane Überlebensrate für Empfänger menschlicher Lungentransplantate beträgt jedoch nur etwa 6 Jahre, wobei die Entwicklung einer obliterativen Bronchiolitis (OB), einer Art obstruktiver Atemwegserkrankung (OAD), eine der Haupttodesursachen nach dem ersten Jahr nach der Transplantation ist¹.

Mehrere Tiermodelle wurden verwendet, um den Mechanismus zu untersuchen, der OAD zugrunde liegt. Ein solches Modell ist das Modell der heterotopen Trachealtransplantation (HTT)². Bei diesem Modell werden Trachealtransplantate in das Unterhautgewebe oder Omentum des Empfängers implantiert. Es kommt zu einem Ischämie-induzierten Verlust von Trachealtransplantat-Epithelzellen, gefolgt von alloreaktiver Lymphozyteninfiltration und Apoptose von Spenderepithelzellen. Fibroblasten und Myofibroblasten wandern um die Luftröhre herum und produzieren eine extrazelluläre Matrix. Schließlich kommt es zu einer vollständigen fibrösen Verödung des Atemwegslumens. Das HTT-Modell ist technisch einfach, bietet eine In-vivo-Umgebung und bietet eine hohe Reproduzierbarkeit.

Ein weiteres Modell zur Untersuchung von OAD ist das Modell der orthotopen Trachealtransplantation (OTT) der Ratte, bei dem Trachealtransplantate in die Luftröhre des Empfängers eingesetzt werden, um die physiologische Beatmung aufrechtzuerhalten³. In diesem Modell führt die Ischämie-induzierte Depletion von Spenderepithelzellen dazu, dass diese durch Empfängerepithelzellen in der Luftröhre ersetzt werden, wodurch ein ungehinderter Atemweg entsteht, der von einer moderaten Fibrose begleitet wird. Obwohl diese Modelle zum Verständnis der Atemwegsobliteration nach Lungentransplantation beigetragen haben, haben sie Einschränkungen in Bezug auf die Rekapitulation der Lungenparenchymmikroumgebung.

Unsere Forschungsgruppe führte das Modell der intrapulmonalen Trachealtransplantation (IPTT) der Ratte ein, bei dem Trachealtransplantate in die Empfängerlunge implantiert werden⁴ (Abbildung 1). Das IPTT-Modell zeigt eine fibröse Verödung des Atemwegslumens in der Mikroumgebung der Lunge. Darüber hinaus wurde es erfolgreich bei Mäusen angewendet, die technisch anspruchsvoller sind als Ratten-IPTT 5,6,7,8,9,10. Diese Anpassung des murinen IPTT-Modells ermöglichte es uns, tiefer in die komplizierten Details der lungenimmunologischen Umgebung von OAD nach Lungentransplantation mit transgenen Mäusen einzutauchen.

Das IPTT-Modell verfügt über einige einzigartige Funktionen. Eine davon ist die Neoangiogenese, die durch die Lungenzirkulation begünstigt wird und eine entscheidende Rolle bei der Verödung der Atemwege spielt ^4,10. Darüber hinaus weist das IPTT-Modell lymphatische Aggregate auf, von denen einige hohe endotheliale Venolen aufweisen, die peripheres Knotenadressin exprimieren, was darauf hindeutet, dass es sich um tertiäre lymphatische Organe (TLOs) ^handelt7,8. TLOs ähneln Lymphknoten und bestehen aus T-Zellen, B-Zellen und häufig einem Keimzentrum, das von follikulären dendritischen Zellen begleitet wird^11,12. TLOs wurden bei verschiedenen chronisch entzündlichen Erkrankungen, einschließlich der Obliteration der Atemwege, beschrieben, so dass das IPTT-Modell für die Untersuchung der Rolle von TLOs bei der Verödung der Atemwege geeignet ist 7,8,11,12,13. In dieser Arbeit wird die Methodik des murinen IPTT-Modells vorgestellt, mit dem Ziel, Forscher mit diesem Modell vertraut zu machen und weitere Untersuchungen zur Atemwegsverödung nach Lungentransplantation zu ermöglichen.

Protokoll

Alle Tiere wurden gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren behandelt. Das Versuchsprotokoll wurde vom Animal Care Committee des Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, genehmigt.

1. Spender-Chirurgie

HINWEIS: BALB/c-Mäuse werden als Beispiel für Spender für das Experiment verwendet. Alle Eingriffe müssen mit einer sterilen Technik durchgeführt werden.

1. Notieren Sie vor dem Eingriff das Gewicht jeder Maus.
2. Euthanasieren Sie die Maus mit einer CO_{2 -} Kammer.
3. Sobald der Tod bestätigt ist, positionieren Sie die Maus in Rückenlage und sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband.
4. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie ihn mit 70%igem Isopropylalkohol sterilisieren.
   HINWEIS: Bei Bedarf und wie von der örtlichen Tierethikkommission empfohlen, schneiden Sie das Fell von der Einschnittsstelle ab.
5. Machen Sie einen Mittellinienschnitt auf der Haut, beginnend am Mittelbauch bis zur vorderen Halsregion.
6. Greifen Sie auf die Luftröhre zu, indem Sie die Fettpolster vorsichtig zurückziehen, die Bandmuskeln seitlich bewegen und die Luftröhre vom umgebenden Bindegewebe trennen. Verwende eine Pinzette, um Platz zwischen der Luftröhre und der Speiseröhre zu schaffen.
7. Heben Sie das Xiphoid an und schneiden Sie das Zwerchfell durch.
8. Heben Sie das Brustbein an und sorgen Sie für einen freien Weg vom Brustbein in die Halsregion, indem Sie ein Hämostat einführen. Klemmen Sie den Brustkorb auf beiden Seiten und schneiden Sie durch das Brustbein, wobei Sie sich durch die Nackenmuskulatur nach oben erstrecken.
9. Entfernen Sie den Thymus und jegliches Fett oder Muskel, das die Luftröhre blockiert, um die Trachealverzweigung freizulegen.
10. Durchtrennen Sie beide Hauptbronchien und trennen Sie vorsichtig die Atemwege von der Speiseröhre.
11. Schneiden Sie den Kehlkopf ab und entfernen Sie ihn.
12. Besprühen Sie die präparierte Luftröhre mit steriler Kochsalzlösung oder Konservierungslösung mit steriler Gaze, die in steriler Kochsalzlösung oder Konservierungslösung getränkt ist, und legen Sie sie auf Eis, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten.

2. Operation des Empfängers

HINWEIS: C57BL/6-Mäuse werden als Beispiel für Empfänger für das Experiment verwendet.

1. Verabreichen Sie Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung subkutan in einer Dosis von 1 mg/kg am Morgen des Operationstages.
2. Eine Anästhesie in einer Induktionskammer mit 5%igem Isofluran einleiten.
3. Sobald die Maus leicht betäubt ist, wird intraperitoneal ein Cocktail aus (0,1 mg/g) Xylazin und (0,01 mg/g) Ketamin injiziert.
4. Bringen Sie die Maus mit 2-3% Isofluran in die Induktionskammer zurück.
5. Rasieren Sie das Fell an der Operationsstelle. Außerdem ist Bupivacain als Linienblock subkutan entlang der geplanten Einschubstelle in einer Dosis von 7 mg/kg zu verabreichen.
6. Vergewissern Sie sich, dass vor der orotrachealen Intubation keine Reflexreaktion auf ein Einklemmen des Zehs vorliegt. Die Maus wird orotracheal mit einem 20-G-intravenösen Katheter intubiert und an ein Beatmungsgerät mit einem Tidalvolumen von 500 μl, einer Atemfrequenz von 120 bpm, 100 % Sauerstoff und 2 % Isofluran angeschlossen. Verwenden Sie einen Ständer mit einer Klemme an der Zunge und halten Sie das Tier in vertikaler Position mit ausgestrecktem Hals, um diesen Vorgang zu erleichtern.
7. Aktivieren Sie ein Heizkissen und positionieren Sie die Maus in einer rechten Seitenposition auf dem Pad, wobei der Kopf vom Chirurgen weg und der Schwanz zum Chirurgen zeigt (Abbildung 2). Befestigen Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Tragen Sie Tiersalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
8. Schrubben Sie den Operationsbereich mit 7,5 % Povidonjod, sterilisieren Sie mit 70 % Isopropylalkohol und schrubben Sie erneut mit 10 % Povidonjod. Legen Sie sterile OP-Abdecktücher an, um den Operationsbereich abzudecken.
9. Während dieser Zeit wird die Spendertrachea in einen intravenösen 16-G-Katheter geladen (Abbildung 3C,D).
10. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt in die Haut des Empfängers zu machen und den Muskel und das Bindegewebe zu verätzen.
11. Öffnen Sie den fünften oder sechsten Zwischenrippenraum und halten Sie den Brustkorb mit zwei Retraktoren offen.
12. Sezieren Sie das untere Lungenband mit Wattestäbchen und einer Schere.
13. Simulieren Sie die Erstellung des Signalwegs für die Spendertrachea (Abbildung 3G,H).
14. Sichern Sie den Auslassschlauch des Beatmungsgeräts, indem Sie ihn teilweise mit einem Drei-Wege-Absperrhahn verschließen, um das Aufblasen der linken Lunge zu erleichtern.
15. Schaffen Sie einen Pfad, indem Sie den linken Lungenflügel mit einer 20-G-Nadel punktieren. Sicherstellen, dass die Einstichtiefe in etwa der Länge des Tracheal-Allotransplantats entspricht. Wählen Sie die Einstichstelle am Lungenrand aus (wie in Abbildung 3I dargestellt) und stellen Sie sicher, dass der Weg parallel zur Tischplatte verläuft (wie in Abbildung 3J durch einen blauen Kreis gekennzeichnet).
    HINWEIS: Ein nach oben gerichteter Einführwinkel führt zu einer Durchdringung der Pleuraschicht, während ein tieferer Winkel zu Blutungen aus großen Gefäßen führen kann (wie in Abbildung 3J durch rote Kreuze gekennzeichnet).
16. Führen Sie den intravenösen 16-G-Katheter in die linke Lunge ein und extrudieren Sie die Spenderluftröhre in die linke Lunge. Nach dem Einsetzen des Tracheal-Allotransplantats wird der Drei-Wege-Absperrhahn freigegeben, um einen ungehinderten exspiratorischen Fluss durch den Ausflussschlauch zu ermöglichen.
17. Verschließen Sie die Pleura-Injektionsstelle mit einem Clip (Abbildung 3K,L). Positionieren Sie den Clip genau auf der Einstichstelle, wobei die Kante so ausgerichtet ist, dass sie der Kontur des Lungenrandes entspricht (gekennzeichnet durch den blauen Kreis in Abbildung 3L).
    HINWEIS: Eine falsche Position für die Clip-Stelle kann zu einer unwirksamen Abdichtung und Luftleckagen führen, während eine unzureichende Cliptiefe dazu führen kann, dass sich der Clip nach der Operation löst (wie durch die roten Kreuze in Abbildung 3L dargestellt).
18. Füllen Sie die Brusthöhle mit Kochsalzlösung und nehmen Sie die Kochsalzlösung mit einer Gaze auf.
19. Den linken Lungenflügel wieder aufblasen und die Rippen mit einer Laufnahttechnik verschließen.
20. Schließen Sie den Muskel und die Haut mit unterbrochenen Nähten.
21. Verabreichen Sie Meloxicam Analgetikum subkutan in einer Dosis von 5 mg/kg am Ende der Operation.
22. Beobachten Sie die Empfängermaus, bis sie wach ist. Entfernen Sie dann den Trachealtubus und setzen Sie die Empfängermaus in einen Käfig.
    HINWEIS: Die Empfängermäuse sollten einzeln untergebracht werden.
23. Verabreichen Sie Meloxicam (5 mg/kg) einmal täglich als subkutane Injektion, beginnend 24 Stunden nach der Operation und 3 Tage postoperativ.

3. Entnahme von Proben von Empfängermäusen

1. Eine Anästhesie in einer Induktionskammer mit 5%igem Isofluran einleiten.
2. Vergewissern Sie sich, dass vor der orotrachealen Intubation keine Reflexreaktion auf das Einklemmen der Zehen vorliegt. Die Intubationsmethode und die Einstellung des Beatmungsgeräts sind die gleichen wie bei der Empfängerchirurgie.
3. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage und sichern Sie die Gliedmaßen.
4. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie ihn mit 70%igem Isopropylalkohol sterilisieren.
5. Machen Sie einen Mittellinienschnitt auf der Haut, beginnend am Mittelbauch bis zur vorderen Halsregion.
6. Die Maus wird mit einer 1-ml-Spritze, die an eine 25-G-Nadel angeschlossen ist, über die untere Hohlvene exsanguiniert, was zu einer Euthanasie führt.
7. Öffnen Sie den Brustkorb und greifen Sie wie bei einer Spendermaus auf die Luftröhre zu. Binden Sie die Luftröhre mit 7-0 Seide um den Intubationsschlauch zusammen.
8. Entferne die Thymusdrüse, das Fett und die Muskeln, um das Herz freizulegen.
9. Durchtrennen Sie den linken Vorhof, den rechten Vorhof und die untere Hohlvene. Die Lunge wird mit 3 ml steriler Kochsalzlösung über die rechte Herzkammer durchblutet.
10. Für die histologische Analyse wird die Lunge über einen Intubationsschlauch mit 10% Formalin aufgeblasen.
11. Extubieren Sie den Beatmungsschlauch und binden Sie die Luftröhre mit 7-0 Seide ab.
12. Teilen Sie den Kehlkopf und die Speiseröhre. Ziehen Sie sie in eine untere Richtung und extrahieren Sie dann den Herz- und Lungenblock, indem Sie ihn in 10% Formalin geben.

Ergebnisse

Basierend auf unserer Erfahrung erfordert die Beherrschung dieses Modells in der Regel eine ca. 2-monatige Schulung. Sobald die Beherrschung erreicht ist, dauern die Spenderverfahren in der Regel 15 Minuten, während die Empfängerverfahren etwa 30 Minuten dauern. Die erwartete Sterblichkeitsrate für einen geschulten Bediener liegt bei 0 %.

In Abbildung 4A weist ein Tracheal-Allotransplantat eine vollständige Obstruktion mit fibroblastischem Gewebe auf, und die ...

Diskussion

Das murine IPTT-Verfahren umfasst kritische Schritte. In Bezug auf die Anästhesie ist der erste entscheidende Schritt die endotracheale Intubation. Es ist wichtig, die Maus mit den Beinen auf dem Tisch auf einer angemessenen Höhe zu halten, um die Stimmbänder sichtbar zu machen und eine sofortige Intubation zu ermöglichen. Darüber hinaus ist eine sorgfältige Einstellung des Atemvolumens und des positiven endexspiratorischen Drucks (PEEP) erforderlich. Typischerweise sind ein Atemvolumen von 500 μl und ein PEEP von...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cJ	The Jackson Laboratory	8-10 weeks 25-30 g	Male, Donor
BD 1 mL Syringe	Becton Dickinson	309659
BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD PrecisionGlide	Becton Dickinson	305122
Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture	Bovie	DEL1
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	8-10 weeks 25-30 g	Male, Recipient
Dumont #5/45 Forceps	F·S·T	11251-35
Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers-	Ethicon	LX107
Extra Fine Graefe Forceps	F·S·T	11150-10
Glover Bulldog Clamp	Integra	320-127
Halsted-Mosquito Hemostats	F·S·T	13009-12
Horizon Titanium Ligating Clips	Teleflex	001201
Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures	Leica
Magnetix Fixator with spring lock	CD+ LABS	ACD-001
Microsurgical Scissor	Jarit	277-051
Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687	Harvard	55-0001
Perfadex Plus	XVIVO	19850
Retractor Tip Blunt - 2.5 mm	CD+ LABS	ACD-011
small animal table	CD+ LABS	ACD-003
Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double Armed	Covidien	VP702X
Systane ointment	Alconn	1444062
System Elastomer	CD+ LABS	ACD-007
Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in	Terumo Medical Corporation	SR-OX2025CA
VMT table Top	benson	91803300