κ-Carrageenan Sub-Microjel Ortamı Kullanılarak Doku Benzeri Yapıların Gömülü Biyobaskısı

Özet

Bu çalışma, dikkate değer geri dönüşümlü sıkışma-sıkışma giderme geçiş özellikleri sergileyen yeni bir κ-İrlanda yosunu alt mikrojel süspansiyon banyosunu tanıtmaktadır. Bu özellikler, gömülü 3D biyobaskıda biyomimetik doku ve organların inşasına katkıda bulunur. Kalp/özofagus benzeri dokuların yüksek çözünürlüklü ve hücre büyümesi ile başarılı bir şekilde basılması, yüksek kaliteli biyobaskı ve doku mühendisliği uygulamalarını göstermektedir.

Özet

Granül hidrojel destek banyosu kullanan gömülü üç boyutlu (3D) biyobaskı, biyomimetik iskeleler oluşturmak için kritik bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, hassas biyomürekkep birikimini hücre canlılığı ve işlevi ile dengeleyen uygun bir jel süspansiyon ortamının mühendisliği, özellikle istenen viskoelastik özelliklerin elde edilmesinde birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Burada, yeni bir κ-karagenan jel destek banyosu, homojen alt mikro ölçekli parçacıklar üreten, kullanımı kolay bir mekanik öğütme işlemiyle üretilir. Bu alt mikrojeller, biyomürekkeplerin düzgün bir şekilde birikmesini kolaylaştıran küçük akma gerilimi ve hızlı kesme inceltme özellikleri ile tipik Bingham akış davranışı sergiler. Ayrıca, κ-karagenan mikrojel ağının geri dönüşümlü jel-sol geçişi ve kendi kendini iyileştirme yetenekleri, basılı yapıların yapısal bütünlüğünü sağlayarak, tanımlanmış mimari özelliklere sahip karmaşık, çok katmanlı doku yapılarının oluşturulmasını sağlar. Baskı sonrası, κ-karagenan alt mikrojelleri, basit bir fosfat tamponlu tuzlu su yıkama ile kolayca çıkarılabilir. Hücre yüklü biyomürekkeplerle daha fazla biyobaskı, biyomimetik yapılar içindeki hücrelerin %92 gibi yüksek bir canlılığa sahip olduğunu ve psödopodiyi hızla uzattığını ve ayrıca sağlam proliferasyonu sürdürdüğünü göstermektedir, bu da doku ve organ üretimi için bu biyo-baskı stratejisinin potansiyelini göstermektedir. Özetle, bu yeni κ-İrlanda yosunu alt mikrojel ortamı, mühendislik doku ve organlarının in vitro gelişimi için derin etkiler taşıyan, olağanüstü kalitede gömülü biyo-baskı için umut verici bir yol olarak ortaya çıkmaktadır.

Giriş

Elektro-eğrilmiş lifler, gözenekli süngerler ve polimer hidrojeller dahil olmak üzere doku mühendisliği iskeleleri, hücre büyümesini, doku yenilenmesini ve organ fonksiyonunun restorasyonunu destekleyen yapısal bir çerçeve sağlayarak hasarlı doku ve organların onarımında ve yeniden yapılandırılmasında çok önemli bir rol oynar ^1,2,3. Bununla birlikte, geleneksel iskeleler, doğal doku yapılarını doğru bir şekilde kopyalamada zorluklarla karşılaşır ve bu da tasarlanmış ve doğal dokular arasında bir uyumsuzluğa yol açar. Bu sınırlama, kusurlu dokuların verimli bir şekilde iyileşmesini engelleyerek, daha doğru biyomimikri elde etmek için iskele tasarımı ilerlemelerine acil ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. Üç boyutlu (3D) biyobaskı, biyomalzeme mürekkepleri ve hücreleri kullanarak karmaşık biyolojik doku yapılarını katman katman hassas bir şekilde oluşturan yenilikçi bir üretim tekniğidir⁴. Çeşitli biyomalzemeler arasında, polimer hidrojeller, hücrelerin yerinde kapsüllenmesini kolaylaştıran ve büyümelerini en önemli şekilde destekleyen ayırt edici ağları ile ideal biyomürekkepler olarak ortaya çıkmaktadır ^5,6. Bununla birlikte, birçok yumuşak ve yüksek oranda hidratlı hidrojel, biyomürekkep olarak kullanıldığında, baskı işlemi sırasında basılı iskele yapılarının bulanıklaşmasına veya hızlı bir şekilde çökmesine neden olma eğilimindedir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, gömülü 3D biyo-baskı teknolojisi, destek malzemesi olarak bir mikrojel banyosu kullanır ve hassas yumuşak biyomürekkep biriktirmeye izin verir. Hidrojel biyomürekkeplerin jelleşmesi üzerine, mikrojel banyosu çıkarılarak karmaşık yapılara sahip rafine biyonik iskeleler elde edilir. Jelatin ^7,8, agaroz⁹ ve gellan zamkı^10,11 gibi malzemeler, gömülü 3D biyobaskı için mikrojel banyoları oluşturmak için kullanılmış ve doku mühendisliğinde yumuşak hidrojellerin uygulanmasını önemli ölçüde ilerletmiştir. Bununla birlikte, bu parçacıklı jellerin mikron düzeyinde ve tekdüze olmayan parçacık boyutu, 3D baskının^{çözünürlüğünü} ve aslına uygunluğunu zararlı bir şekilde etkiler ^12,13,14. Küçük ve homojen bir şekilde dağılmış parçacıklara sahip jel benzeri bir süspansiyon şamandırasının üretilmesine acil ihtiyaç vardır ve bu da yüksek kaliteli biyo-baskı elde etmede avantajlar sunar.

Bu protokolde, gömülü 3D baskı için tek tip bir mikron altı seviyesine sahip yeni bir kurban granül κ-İrlanda yosunu süspansiyon banyosu sunulmaktadır. Hızlı sıkışma-sıkışma giderme geçişinin bu yenilikçi alt mikrojel banyosu davranışı, yüksek yapısal doğruluğa sahip biyomimetik hidrojel iskelelerin hassas imalatını kolaylaştırır¹⁵. Bu yeni süspansiyon ortamını kullanarak, jelatin metakrilat ve ipek fibro metakrilattan oluşan kompozit bir biyomürekkep kullanılarak çok katmanlı doku yapılarına sahip bir dizi biyomimetik doku ve organ yapısı başarıyla basılmıştır. Bu çalışmada, özofagusun sadece çok katmanlı bir doku yapısına sahip olması değil, aynı zamanda kas tabakasının iç, dairesel ve dış, uzunlamasına karmaşık bir katmanlama yapısı sergilemesi nedeniyle, 3D biyo-baskı biyomimetik nesnesi olarak özofagusu seçtik. Bu katmanların uygun şekilde hizalanmasını ve organizasyonunu sağlamak, fonksiyonel doku rejenerasyonu için esastır. Bu nedenle, yemek borusunun çok katmanlı mimarisini çoğaltmayı çok arzuluyoruz. Daha da önemlisi, doku mühendisliği için biyomimetik bir iskele tasarlamak ve inşa etmek için süspansiyon banyosu olarak κ-karragenan alt mikrojelleri ve biyomürekkep olarak GelMA/SFMA'yı kullandık. Basılı yemek borusu, tekrarlanan fosfat tamponlu tuzlu su yıkama ile kolayca serbest bırakılabilir. Ayrıca, κ-karragenan alt mikrojel banyosu sitotoksik maddeler içermez ve yüksek sitouyumluluk sağlar¹⁵. Anizotropik iskeleler içine yüklenen düz kas hücreleri, kayda değer bir yayılma aktivitesi sergiler. Bu tek tip alt mikrojel süspansiyon ortamı, gömülü 3D biyo-baskı yoluyla karmaşık doku ve organların üretimi için yeni bir yol sunar.

Protokol

1. κ-İrlanda yosunu alt mikrojel süspansiyon banyosunun hazırlanması

1. 1.000 mL'lik bir cam şişe içinde 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) çözeltisine 1.75 g κ-İrlanda yosunu tozu ekleyerek 500 mL κ-İrlanda yosunu süspansiyon banyosu (ağırlıkça% 0.35 / hacim) hazırlayın.
2. Sulu karışımı karıştırmak için cam şişeye 70 mm'lik bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin. Cam şişe kapağını sıkın ve ardından yarım tur gevşetin.
3. Cam şişeyi 70 °C'lik bir su banyosuna koyun ve ısıtın. Manyetik karıştırıcıyı 300 rpm hızında açın, şişeyi yerleştirin ve polimer tamamen eriyene kadar karıştırın.
4. Başka bir cam şişe alın ve sterilizasyon için 121 °C'de 30 dakika boyunca çalışan bir otoklava koyun.
5. Yüksek basınçlı sterilizatör 80 °C'ye soğuduktan sonra, şişeyi sterilizatörden çıkarın ve daha fazla kullanım için ultra temiz çalışma tezgahına aktarın.
6. Tamamen çözünmüş κ-karagenan çözeltisini 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilmiş cam şişeye süzün.
   NOT: κ-İrlanda yosununun soğumasını ve filtreyi tıkamasını önlemek için çözelti sıcakken filtrelemeyi hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
7. 12 saat boyunca katyon çapraz bağlı bir jelleşmeyi indüklemek için κ-karragenan çözeltisini 4 ° C'de saklayın.
8. Κ-İrlanda yosunu hidrojellerini, 25 °C'de 1200 rpm karıştırma hızına sahip 60 mm'lik bir manyetik karıştırıcı kullanarak, yaklaşık 60 dakika sürecek şekilde başarılı bir şekilde sıvı hale gelene kadar mekanik olarak öğütün.
   NOT: Düşük sıcaklıklarda jelleşmeyi veya yüksek sıcaklıklarda çözünmeyi önlemek için κ-karragenan hidrojellerini 25-37 °C arasında saklayın.

2. Jelatin metakrilat / ipek fibroin metakrilat kompozit biyomürekkeplerin hazırlanması

1. PBS çözeltisinde (pH 7.4) %10 (ağırlıkça/hacim) jelatin metakrilat (GelMA) ve %6 (ağırlıkça/hacim) ipek fibroin metakrilatı (SFMA) birleştirerek kompozit biyomürekkepler hazırlayın. 2,0 g GelMA ve 1,2 g SFMA tozlarını ayrı ayrı tartın.
2. Tozları yavaşça iki adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne ekleyin. 50 mL santrifüj tüplerine ayrı ayrı 10 mL PBS çözeltisi ekleyin.
3. Her birine 10 mm'lik bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve 45 °C'de bir su banyosunda sürekli karıştırın ve ısıtın. GelMA ve SFMA tozlarının tamamen çözülmesine izin verin, yaklaşık 30 dakika sürer.
4. GelMA ve SFMA çözeltilerini 45 °C'de sürekli karıştırarak eşit hacimde karıştırın. 100 μm gözenek boyutu filtresi kullanarak kompozit biyomürekkepleri filtreleyin.
5. Kompozit GelMA/SFMA biyomürekkeplerini bir biyogüvenlik kabininde UV ışınlaması yoluyla 12 saat boyunca sterilize edin.
   NOT: SFMA'nın kendi kendine montaj yoluyla erken jelleşmesini önlemek için biyomürekkepleri hemen hazırlayın ve kullanın.

3. κ-İrlanda yosunu alt mikrojel süspansiyon banyosunun reolojik karakterizasyonu

1. Reoloji ile ilgili ekipmanı başlatın ve hazırlayın.
   1. Hava kompresörünü 30 dakika boyunca açın ve basıncın 30 psi'ye ulaştığından emin olun. Çekme çubuğunu saat yönünün tersine çevirerek yatak kelepçesini çıkarın. Aşağıdaki siyah kapağı sabitleyin ve cihazın üst kısmındaki düğme eksenini saat yönünde çevirin.
   2. Reometreyi açın ve başlamasına izin verin. Sirkülasyon suyu anahtarını açın ve sıcaklığın 15 °C'ye ulaşmasını bekleyin.
   3. Çevrimiçi bağlantıyı kurmak için reometre kontrol yazılımını açın.
2. Reometreyi kalibre edin ve paralel plaka geometrisini kurun.
   1. Esas olarak kalibrasyon cihazı atalet yolunun ayarlanmasını içeren kontrol yazılımında cihaz kalibrasyonu gerçekleştirin. Çekme çubuğunun ucuna 40 mm çapında bir paralel plaka geometrisi takın. Tutarlı geometri yerleşimi için motor milini başlangıç konumuna getirmek için Kilit düğmesini 3 saniye basılı tutun.
   2. Kontrol yazılımında Kalibrasyon Yöneticisi'ni seçin ve ardından paralel plaka geometrisini kalibre etmek için Atalet, Sürtünme Kalibrasyonu ve Rotasyonel Eşleme'ye tıklayın.
3. Hassas ölçümü sağlamak için standart bir boşluk sıfırlama prosedürü uygulayarak reometre boşluk yüksekliğini sıfırlayın.
4. 0,01 ila 1000 1/sn kesme hızı arasında değişen bir akış rampası, 10 rad/sn'de %0,1 ila %100 gerinim arasında değişen bir genlik taraması, 10 rad/sn'de %1 ve %100'lük alternatif gerinimlerle 60 saniye süren çok adımlı salınım süresi taraması ve 0,1 1/sn ve 10 1/sn alternatif kesme hızıyla 120 sn süren çok adımlı Tepe Tutma taraması dahil olmak üzere deneysel adımları ayarlayın.
5. Reometrenin Peltier plakasına 2 mL %0.35 κ-İrlanda yosunu süspansiyonu damlatın.
6. Geometri boşluğunu 510 μm'ye yerleştirin ve kelepçe cihazının kenarındaki fazla taşmayı giderin. Numunenin kelepçe kenarının biraz ötesine uzanmasını sağlamak için numune aralığını 500 μm'ye ayarlayın.
7. Deneysel tasarım seçeneklerinden Akış Rampasını seçerek bir akış deneyi yapın.
   1. Deney tasarımında Akış Rampası testini seçin. Kesme hızlarını 25 °C sıcaklıkta 0,001 ila 10 1/s arasında ayarlayın.
   2. Eklenen örnek üzerinde adım 3.5'i ve Akış Rampası deneyini gerçekleştirin.
8. Malzemenin geri kazanım performansını değerlendirmek için döngüsel bir Tepe Tutma testi gerçekleştirin.
   1. Deney tasarımında Peak Hold taramasını seçin ve 25 °C'de 120 s'lik bir süre ile 5 ardışık deney ayarlayın.
   2. Kesme hızını birinci, üçüncü ve beşinci adımlar için 0,01 1/sn'ye ve ikinci ve dördüncü adımlar için 10 1/sn'ye ayarlayın.
   3. 2 mL'lik yeni bir örnek ekleyin. Adım 3.5'i ve döngüsel kurtarma testini gerçekleştirin.
9. κ-İrlanda yosunu süspansiyon banyosunun potansiyel jel-sol geçişini değerlendirmek için viskoelastisite analizi yapın.
   1. Deneysel tasarımda Genlik Tarama testini seçin. Salınım gerinimini 25 °C sıcaklıkta %0,1 ila %100 arasında ayarlayın. Eklenen örnek üzerinde Genlik Tarama deneyini gerçekleştirmek için Başlat'a tıklayın.
10. Malzemenin elastik geri kazanım performansını değerlendirmek için alternatif gerinim analizi yapın.
    1. Deney tasarımında Salınım Süresi Taraması'nı seçin ve 25 ° C'de 60 s'lik bir süre ile 5 ardışık deney ayarlayın.
    2. Gerinimi birinci, üçüncü ve beşinci adımlar için %1'e ve ikinci ve dördüncü adımlar için %100'e ayarlayın.
    3. 2 mL'lik yeni bir örnek ekleyin. Adım 3.5'i ve sürekli döngüsel kurtarma testini gerçekleştirin.
       NOT: Her deney testinden sonra geometri plakasını ve Peltier plakasını temizleyin ve 2 mL'lik yeni bir numune ekleyin.

4. Özel olarak tasarlanmış bir mikro ekstrüzyon biyoyazıcı kullanarak biyomimetik hidrojel iskelelerinin yazdırılması

1. Bir 3B grafik yazılımı kullanarak STL biçimli küpler tasarlayın ve 3B veritabanından (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.) doku benzeri modeller indirin.
   1. STL formatındaki modelleri PANGO yazılımına aktarın ve yazdırma parametrelerini girin. Modelin belirli X, Y ve Z koordinatlarını 3B uzayda ayarlayın, modelin beklenen ölçekleme boyutunu milimetre (mm) cinsinden girin, X, Y ve Z eksenlerindeki nesnenin boyutunu ve ölçekleme oranını ayarlayın ve modelin uzayda dönme açısını gerektiği gibi ayarlayın.
   2. Her katmanın Z ekseni kalınlığını belirlemek için tahmini filament çapını (çoğu biyomürekkep için tipik olarak yaklaşık 200-500 μm) katman kalınlığı alanına girin. Baskı hızını beklenen çizgi kalınlığına (yaklaşık 10-90 mm/sn) göre ayarlayın ve dolgu yoğunluğunu %30-%80 olarak ayarlayın.
   3. Son parametreleri G kodu olarak bir SD karta aktarın.
2. Biyoyazıcıyı ve mikro ekstrüzyon pompasını çalıştırın.
   1. Mikro ekstrüzyon pompası kontrolörünü açın, ilgili hacim şırıngasını (5 mL) seçin ve ekstrüzyon hızını 0.08 mL/dk ve ekstrüzyon süresini, hidrojel hacminin ekstrüzyon hızına bölünmesiyle elde edilen istenen baskı süresi ile koordineli olarak ayarlayın.
   2. İç çapı 210 μm olan bir iğne ile şırıngayı, biyoyazıcının şırınga yuvasına yerleştirin.
   3. Şırınganın pistonunun vida ile yakın temas halinde olduğundan emin olmak için şırınga kontrol cihazını ayarlayın.
   4. 35 mm'lik bir hücre kültürü kabına 3 mL süspansiyon banyosu yerleştirin. Çanağı kod ayarlarına göre platforma yerleştirin ve baskı kafasının çanağın altından 1 mm yukarıda olduğunu onaylayın.
      NOT: Yazdırma sırasında yazdırma platformundaki çanak konumlarının doğruluğundan emin olmak için bir ön test yapın.
   5. Kodu içeren SD kartı 3D biyoyazıcıya takın, kod dosyasını etkinleştirin, biyoyazıcıyı başlatın ve denetleyicideki Başlat düğmesine tıklayın.
3. Yapıların işlenmesi
   1. Fotoçapraz bağlamayı başlatmak için yazdırılan yapıyı 405 dakika boyunca 1 nm mavi ışığa maruz bırakın.
   2. 1 mL'lik bir pipet kullanarak κ-karagenan jeli çıkarın, ardından yıkama ve ardından çıkarma için 3 mL PBS (pH 7.4) ekleyin. İyice yıkamak için bu işlemi tekrarlayın.
      NOT: Basılı yapılara zarar vermemek için yıkama işlemini nazikçe gerçekleştirin.

5. Özofagus kas tabakası analoglarının gömülü 3D biyobaskısı

1. Kültür tavşanı özofagus düz kas hücreleri (eSMC'ler).
   1. % 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 15 mL DMEM ortamı kullanarak 2 x 10⁶ hücre ile T75 şişelerinde kültürü başlatın.
   2. ESMC'leri 37 °C'de, %5_{CO 2 ve} %95 havadan oluşan nemli bir atmosferde, %80 birleşme noktasına ulaşana kadar tutun.
2. Özofagus kas tabakası biyomükkebinin hazırlanması
   1. Birleşme noktasına ulaştıktan sonra ortamı aspire edin ve eSMC'leri 5 mL 1x PBS ile yıkayın.
   2. Şişeye 2 mL% 0.2 Tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri sindirmek için 2 dakika inkübe edin. Hücreleri duvardan ayırmak için şişeye dokunun.
   3. 2 mL DMEM ekleyerek sindirimi sonlandırın ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 10 μL hücre süspansiyonlu bir hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu ölçün.
   4. 3 dakika boyunca 675 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini kompozit GelMA / SFMA biyomürekkeplerinde (adım 2.1'de hazırlandığı gibi) yeniden süspanse edin. Biyomürekkepte 10 x 10⁶ hücre/mL'lik bir yoğunluk elde etmek için nihai hücre konsantrasyonunu ayarlayın, böylece sonraki 3D biyo-baskı uygulamaları için koşulları optimize edin.
3. 3D biyoyazıcı ve ilgili materyallerin hazırlanması
   1. Baskı işlemi için aseptik bir ortam sağlamak için şırınga iğneleri, forseps, manyetik karıştırıcı ve 1000 mL silikat cam şişe dahil olmak üzere temel baskı aletlerini standart sterilizasyon koşullarında (30 dakika boyunca 121 °C) otoklavlayın.
   2. Biyoyazıcıyı bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve steriliteyi korumak için 30 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışıkla sterilize edin.
   3. Sırasıyla adım 1 ve adım 2'de açıklandığı gibi 50 mL steril κ-karragenan ve 5 mL steril GelMA / SFMA kompozit biyomürekkepleri hazırlayın.
   4. Modeli tasarlayın, istenen parametreleri ayarlayın ve biyoyazıcıyı adım 4.1'de belirtildiği gibi hazırlayın.
4. Biyo-baskı işleminin başlatılması
   1. 3D özofagus kas tabakasını biyolojik olarak yazdırmak için adım 4.2 ve 4.3'te açıklanan prosedürleri gerçekleştirin, ardından PBS yıkama ve değiştirme işlemini gerçekleştirin.
   2. Yazdırılan yapıda hücre kontaminasyonu riskini en aza indirmek için baskı işlemi boyunca steril tekniklerle hücre baskısı gerçekleştirin.
5. Baskı sonrası hücre kültürü ortamının değiştirilmesi
   1. PBS'yi dikkatlice aspire edin ve% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 3 mL DMEM ile değiştirin. Optimum hücre büyüme koşullarını sağlamak için yazdırılan yapıların tamamen suya batırıldığından emin olun.
   2. Basılı yapıları içeren hücre kültürü kabını,% 5 CO₂ ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde inkübe edin. Hücre kültürü ortamını her seferinde 3 mL kullanarak günlük olarak taze ortamla değiştirin ve ışık mikroskobu kullanarak yapılar içindeki hücrelerin durumunu izleyin.

6. Canlı / Ölü tahlil boyama yoluyla basılı yapılar içinde eSMC'lerin canlılığının değerlendirilmesi

1. 5 saatlik inkübasyondan sonra hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücre yüklü yapıları PBS ile yıkayın.
2. Basılı hücre yüklü yapılara 2 mL standart kalsein-/propidyum iyodür çözeltisi (1:1000) ekleyin ve inkübe edin.
3. 45 dakikalık bir inkübasyondan sonra yapıları 3x PBS ile yıkayın ve ardından taze hücre kültürü ortamı ekleyin.
4. Canlı ve ölü hücreleri gözlemleyin ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak floresan görüntüler yakalayın.

7. Basılı yapılar içindeki eSMC'lerin FITC-Phalloidin/DAPI boyama yoluyla gözlemlenmesi

1. Basılı yapıları, F-aktin için floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli phalloidin (Yeşil) ve 5 günlük inkübasyon sonrası nükleer için 4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol (DAPI, mavi) kullanarak boyayın.
2. Fiksasyon çözeltisi hazırlama
   1. 5 mL'lik bir polietilen (PE) tüpte 4 mL 1x PBS'yi 0.16 mL paraformaldehit (PFA) ile birleştirin ve %4'lük bir nihai konsantrasyon elde edin.
   2. Biyobaskılı yapıları içeren kültür kabını temiz bir yüzeye yerleştirin. Ortamı çıkarın ve yapıları PFA çözeltisi ile nazikçe kaplayarak tam olarak daldırılmalarını sağlayın. Çözeltiyi atmadan önce fiksasyonun oda sıcaklığında 20 dakika ilerlemesine izin verin.
      NOT: Biyo-baskılı yapıların yapısal bütünlüğünü korumak için ekleme ve çıkarma işlemleri sırasında sıvıları dikkatli kullanın.
   3. Kültür kabına 2,5 mL 1x PBS verin ve artık boyama reaktiflerini çıkarmak için yapıları tamamen daldırın.
3. Hücre zarı geçirgenliği
   1. 5 mL'lik bir PE tüpte 4 mL 1x PBS'ye 20 μL Triton X-100 ekleyerek %0.5'lik bir Triton X-100 çözeltisi formüle edin.
   2. Triton X-100 solüsyonunu, hücre zarlarına nüfuz etmesi için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yapılara uygulayın, ardından solüsyonu çıkarın.
   3. Kültür kabına 2,5 mL 1x PBS verin ve artık boyama reaktiflerini çıkarmak için yapıları tamamen daldırın.
4. Spesifik olmayan bağlamayı engelleme
   1. 4 mL 1x PBS'ye 0.12 mL BSA ekleyerek 5 mL'lik bir PE tüpte% 3'lük bir sığır serum albümini (BSA) bloke etme çözeltisi oluşturun.
   2. Spesifik olmayan alanları engellemek için BSA çözümünü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yapılara tanıtın, ardından çözeltiyi atın.
5. FITC-Phalloidin ile aktin boyama
   1. 4 mL 1x PBS ve 8 μL boyama reaktifi ile 5 mL'lik bir PE tüpte% 0.2 FITC-phalloidin çözeltisi hazırlayın.
   2. Yapıları karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bu çözeltiye daldırın, ardından çözeltiyi atın.
   3. Kültür kabına 2,5 mL 1x PBS ekleyin, artık boyama reaktiflerini çıkarmak için yapıları tamamen daldırın.
6. DAPI ile nükleer boyama
   1. Yapılara 4 mL DAPI boyama solüsyonu uygulayın ve tam kapsama alanı sağlayın.
   2. DAPI çözeltisini çıkarmadan önce karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
7. Son yıkama ve PBS daldırma: Kültür kabına 2,5 mL 1x PBS ekleyin, artık boyama reaktiflerini çıkarmak için yapıları tamamen daldırın.
   NOT: Boyama solüsyonlarını önceden hazırlayın ve nazikçe tutun. Hücreler hiçbir noktada kültür kabı içinde kurumaya uğramamalıdır.
8. Konfokal mikroskop kullanarak gözlemleyin: Hücre büyümesini değerlendirmek için konfokal mikroskopi kullanarak lekeli yapıları inceleyin ve görüntüleyin, sonuçların kapsamlı bir şekilde belgelenmesini sağlayın.

8. CCK-8 testi kullanılarak basılı yapılar içinde eSMC'lerin çoğalmasının değerlendirilmesi

1. Kültür ortamını 7. ve 14. günlerde yapılardan çıkarın. Artık ortamı ve ayrılmış hücreleri çıkarmak için yapıları PBS ile yıkayın.
2. Üreticinin talimatlarını izleyerek her yapıya CCK-8 çözümü ekleyin. CCK-8 çözümünün hacminin her bir yapıyı tamamen kaplamak için yeterli olduğundan emin olun.
3. Yapıları CCK-8 çözeltisi ile 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, süpernatanı dikkatlice 96 oyuklu yeni bir plakaya aktarın.
4. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 450 nm'de ölçün.

Sonuçlar

Granül κ-İrlanda yosunu jel banyosu, dökme hidrojellerin mekanik olarak partikül bir jel bulamacına ayrılmasıyla oluşturulmuştur. En son çalışma, κ-karragenan parçacıklarının, daha önce literatürde bildirilen mikrojellerin boyutlarından önemli ölçüde daha küçük olan, 1000 rpm mekanik harmanlamada¹⁵ tekdüze morfolojilerle yaklaşık 642 ± 65 nm'lik bir ortalama çap sergilediğini göstermiştir 16,17,18

Tartışmalar

Biyobaskıda kullanılmak üzere κ-karagenan alt mikrojel süspansiyon banyolarının hazırlanması, elde edilen ortamın biyomürekkepleri desteklemek için istenen özellikleri sergilemesini sağlamak için birkaç kritik adımı içeren, dikkatlice düzenlenmiş bir süreçtir. İlk olarak, κ-İrlanda yosunu tozunun yüksek sıcaklıklarda deiyonize su içinde çözülmesi ve homojen bir karışım oluşturulmasıyla bir κ-karagenan çözeltisi hazırlan...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D bioprinter	Custom-designed
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole	Solarbio Life Science	C0065	Ready-to-use
405 nm UV light	EFL	XY-WJ01
Cell Counter	Corning	Cyto smart 6749
Confocal laser scanning microscope	Leica	STELLARIS 5
DMEM high glucose	VivaCell	C3113-0500	High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine
Dynamic rotational rheometer	TA Instrument	Discovery HR-20
Esophageal smooth muscle cells	Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University		Primary cells from the rabbit esophagus
Fetal bovine serum	UE	F9070L
Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin	Solarbio Life Science	CA1610	300T
Gelatin methacrylate	EFL	EFL-GM-60	60% substitution
k-carrageenan	Aladdin	C121013-100g	Reagent grade
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate	Aladdin	L157759-1g	365~405 nm
Live-Dead kit	beyotime	C2015M
Microplate reader	Potenov	PT-3502B
Paraformaldehyde	Solarbio Life Science	P1110	4%
Penicillin/streptomycin	Solarbio Life Science	MA0110	100 ´
Phosphate buffered saline	VivaCell	C3580-0500	pH 7.2-7.4
Silk fibroin methacrylate	EFL	EFL-SilMA-001	39% substitution
Triton X-100	Solarbio Life Science	T8200
Trypsin-EDTA	VivaCell	C100C1	0.25%, without phenol red