Helicobacter pylori Enfeksiyonu ve Antibiyotik Direncinin Dışkı ile Saptanması Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu Analizi

Özet

Protokol, Helicobacter pylori enfeksiyonu ve klaritromisin ve kinolonlara direnci için uygun ve hızlı bir tanı yöntemi sunmak için kantitatif bir polimeraz zincir reaksiyonu ile birlikte invaziv olmayan bir dışkı örneklemesi kullanır.

Özet

Helicobacter pylori (H. pylori) dünya çapında yaygın olarak yaygındır ve küresel nüfusun yaklaşık% 50'sinde H. pylori enfeksiyonu öyküsü vardır. Çin'de enfeksiyon oranı %40 ile %70 arasında değişmektedir. H. pylori öncelikle kronik gastrit, mide ülseri ve duodenum ülseri gibi gastrointestinal hastalıklarla ilişkilidir. Şu anda, H. pylori enfeksiyonu için klinik tedavi üçlü veya dörtlü tedaviyi içerir. Bununla birlikte, antibiyotiklerin yaygın kullanımı, H. pylori'de antibiyotik direncinin gelişmesine yol açmıştır. Bu nedenle, hem H. pylori'nin hem de antibiyotik direncinin saptanması, klinik tedavinin yönlendirilmesi için çok önemlidir.

H. pylori için tanı yöntemleri arasında üre nefes testi (UBT), antijen testi, serolojik antikor testi, endoskopi, hızlı üreaz testi (RUT) ve bakteri kültürü bulunur. İlk üç yöntem non-invaziv olsa da, bakteri kazanımına izin vermezler ve bu nedenle direnç testi için kullanılamazlar. Son üç yöntem invazivdir, pahalıdır, yüksek teknik uzmanlık gerektirir ve hastalara zarar verebilir.

Bu nedenle, H. pylori enfeksiyonu ve antibiyotik direncinin aynı anda saptanması için invaziv olmayan, hızlı bir yöntem, H. pylori'nin etkili eradikasyonu için son derece klinik öneme sahiptir. Bu makale, H. pylori enfeksiyonunu ve antibiyotik direncini hızlı bir şekilde tespit etmek için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonunu (qPCR) TaqMan floresan prob teknolojisi ile birleştiren spesifik bir protokolü tanıtmayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, geleneksel bakteri kültürü ve diğer tekniklerin aksine, H. pylori enfeksiyonunu ve direncini teşhis etmek için uygun, hızlı ve invaziv olmayan bir yol sağlar. qPCR, enfeksiyonu tanımlamak ve sırasıyla klaritromisin ve kinolonlara dirençle bağlantılı olan 23S rRNA ve gyrA genlerindeki mutasyonları tespit etmek için kullanılır. Konvansiyonel kültür teknikleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım Helicobacter pylori enfeksiyonunu tespit etmek ve antibiyotik direncini belirlemek için non-invaziv, uygun maliyetli ve zaman açısından verimli bir yöntem sunar.

Giriş

Helicobacter pylori , insan mide epitelini¹ kalıcı olarak enfekte edebilen gram negatif, spiral şekilli bir bakteridir. 1994 yılında, Dünya Sağlık Örgütü H. pylori'yi mide kanseri için Grup 1 kanserojen olarak sınıflandırdı ve enfekte bireylerin ~% 3'ü sonuçta^{hastalık 2'yi} geliştirdi. Yakın zamanda yayınlanan bir sistematik derleme, son on yılda H. pylori'nin antibiyotik direnç oranının arttığı genel bir eğilimin gözlendiğini ve bu eğilimin dünya çapında endişe verici seviyelere, özellikle de klaritromisin direncine^{ulaştığını göstermiştir 3}. Çin'de, en son anket verileri, kentsel Çin halkı arasında H. pylori'nin toplam prevalansının %27,08 olduğunu göstermiştir; klaritromisin ve levofloksasin için direnç oranları %50.83 ve %47.17 ^idi.4 ve bunlar Amerika Birleşik Devletleri'nden (levofloksasin %37.6, klaritromisin %31.5)⁵ve Avrupa'dan (levofloksasin %15.8 ve klaritromisin %21.4)⁶. Bu nedenle erken ve doğru tanı ve tedavi çok önemlidir. Bununla birlikte, H. pylori'nin artan antibiyotik direnci, tedavi etkinliğini önemli ölçüde azaltmakta ve tanı ve tedavisi için devam eden araştırmalara acil ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır.

H. pylori tanı yöntemleri invaziv ve non-invaziv teknikler olarak kategorize edilir⁷. İnvaziv yöntemler arasında histopatolojik inceleme, hızlı üreaz testi (RUT) ve bakteri kültürü^{bulunur 8}. Histopatolojik inceleme, biyopsi örneklerinin işlenmesine ve mikroskobik gözlemine dayanır ve doğruluk, histolojik hazırlık ve patoloji uzmanlığı ile sınırlıdır⁹. RUT, H. pylori'yi üreayı amonyak üretmek üzere hidrolize eden ve reaktifte alkali bir kaymaya neden olan ve böylece bakteri^9'un varlığını gösteren üreaz aktivitesi yoluyla tespit eder. Basit ve uygun maliyetlidir. "Altın standart" olarak kabul edilen bakteri kültürü, H. pylori^10'un benzersiz fizyolojik özellikleri nedeniyle genellikle %50'nin altında bir başarı oranına sahiptir.

Non-invaziv yöntemler arasında 13C/14C üre nefes testi (UBT), serolojik tanı ve dışkı antijen testi (SAT) ^bulunur11. Nefes testi, enfeksiyonu doğrulamak için solunan havada izotopik olarak etiketlenmiş CO_2'yi tespit ederek RUT'unkine benzer bir prensipte çalışır¹². Serolojik tanı, bakteri eradikasyonundan sonra devam edebilen antikorları tespit eder ve bu da tedavi etkinliğini değerlendirmeyi zorlaştırır¹³. Dışkı antijen testi, dışkı örneklerinde H. pylori'ye özgü antijenleri tespit ederek, daha düşük yanlış pozitif oranı ve aktif enfeksiyonları teşhis etmek için iyi doğruluk ile güvenilir bir non-invaziv yöntem sağlar¹⁴.

Her tanı yönteminin kendine özgü avantajları ve sınırlamaları vardır¹⁵. Bakteri kültürü dışında, diğer yöntemler antibiyotik direncini tespit etmekte zorlanırken, kültür düşük başarı oranları nedeniyle engellenmektedir¹⁶. Son zamanlarda, gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) gibi moleküler tanı yöntemleri, mikrobiyal saptama için yaygın olarak uygulanmaktadır¹⁷. qPCR, H. pylori'yi doğru bir şekilde tespit edebilir ve direnç gen mutasyonlarını analiz ederek enfeksiyonun daha kapsamlı bir görünümünü sunar¹⁸.

Floresan problar, qPCR işlemi sırasında DNA'daki bir hedef diziye spesifik olarak bağlanmak üzere tasarlanmıştır. Bu problar tipik olarak, prob hedefine bağlandığında bir sinyal yayan ve amplifikasyon sırasında polimeraz tarafından parçalanan bir floresan boya ile etiketlenir. Bu, PCR işleminin gerçek zamanlı bir ölçümünü sağlar. Floresan problar, yalnızca hedef DNA dizisinin tespit edilmesini sağlayan, spesifik olmayan bağlanma şansını azaltan ve test özgüllüğünü iyileştiren probun benzersiz tasarımı nedeniyle yüksek özgüllükleri ile bilinir. Bu, floresan prob teknolojisini özellikle dışkı örneklerinde Helicobacter pylori DNA'sı gibi düşük bolluktaki hedefleri tespit etmek için kullanışlı hale getirir. SYBR Green, PCR'de yaygın olarak kullanılan bir DNA bağlayıcı boya olsa da, herhangi bir çift sarmallı DNA'ya bağlanabilir, bu da spesifik olmayan amplifikasyona ve yanlış pozitiflere neden olabilir.

Helicobacter pylori'nin klinik örneklerden kültürlenmesi, doğrudan antibiyotik direnci verileri sağlamaz. Buna karşılık, floresan prob tabanlı qPCR daha hızlı, daha kullanışlıdır ve H. pylori ve antibiyotik direnç belirteçlerinin aynı anda tespiti için uyarlanabilir. Bu yöntem yalnızca geleneksel kültür yöntemlerinden daha hızlı sonuçlar vermekle kalmaz, aynı zamanda antibiyotik direnç genlerinin aynı anda tespit edilmesine izin vererek tespit verimliliğini ve rahatlığını büyük ölçüde artırır. Bu yöntem, geleneksel bakteri kültürü ve diğer tekniklerin aksine, H. pylori enfeksiyonunu ve direncini teşhis etmek için uygun, hızlı ve invaziv olmayan bir yol sağlar.

H. pylori antibiyotik direnci için göz önünde bulundurulması gereken iki önemli konu vardır: i) genotip ve fenotip tutarlılığı, ii) çoklu ilaç direnci. Çin'de yapılan büyük ölçekli çok merkezli bir çalışma, klaritromisin/levofloksasin için çift direnç modellerinin %26.1 olduğunu buldu. Klaritromisin ve levofloksasine dirençli H pylori fenotipleri ve genotipleri tatmin edici bir uyum gösterdi (kappa katsayısı = sırasıyla 0.810 ve 0.782)¹⁹. Bu nedenle, H. pylori enfeksiyonunu ve ilaç direncini tespit etmek için qPCR yönteminin kullanılması mümkündür. Dışkı antijen testi (SAT) ve qPCR yöntemleri, örnekleme kolaylığı nedeniyle giderek daha fazla kullanılmaktadır. H. pylori tespiti için yöntemlerin duyarlılığı, özgüllüğü ve doğruluğu aşağıdaki gibidir: qPCR > UBT > SAT > RUT> CagA IgG > kültürü²⁰. Tüm non-invaziv yöntemler primer tarama için uygundur. qPCR ayrıca ilaca dirençli genleri de tespit edebildiğinden, qPCR ve kültür tedaviyi yönlendirmek için daha uygun olacaktır.

Endoskopik görüntüler²¹, dijital mikroakışkanlar²² ve RPA-CRISPR/Cas12a²³ ile birleştirilmiş yapay zeka (AI) algoritmaları gibi diğer yenilikçi yaklaşımlar, teorik olarak iyi tanısal verimlilik ve umut verici uygulama beklentileri göstermektedir. Bununla birlikte, qPCR şu anda H. pylori enfeksiyonlarının tanı ve tedavisi için üstün bir çözüm sağlama potansiyeline sahip en gelişmiş moleküler biyoloji tekniğidir.

Protokol

Bu çalışma, Guangzhou, Çin'deki Güney Tıp Üniversitesi, Guangdong İl Halk Hastanesi Etik Komitesi tarafından belirlenen etik yönergelere uygundur (Onay No: KY2024-445-01). Bu araştırmada kullanılan malzemelerle (reaktifler, kimyasallar, ekipman ve yazılım) ilgili ayrıntılı bilgiler Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Katılımcı seçimi

1. 18 ila 60 yaş aralığındaki katılımcıları seçin.
2. Gastrit, peptik ülser veya dispepsi gibi semptomlarla başvuran hastalar ve asemptomatik bireyler gibi Helicobacter pylori enfeksiyonu taraması yapılabilecek katılımcıları seçin.
3. Geçen ay içinde antibiyotik, bizmut içeren ajanlar (potasyum bizmut sitrat kapsülleri, kolloidal bizmut pektin kapsülleri veya bizmut-alüminyum bileşik tabletler gibi) veya antimikrobiyal Çin ilaçları kullanan hastaları veya proton pompa inhibitörleri veya H2 reseptör antagonistleri (omeprazol, pantoprazol, rabeprazol, simetidin veya nizatidin gibi) kullanmış olanları çalışma dışı bırakın. Ayrıca adet dönemindeki kadınları çalışmadan hariç tutun.

2. Dışkı örneklerinin toplanması

NOT: Bölüm 2'yi katılımcılara talimat olarak verin.

1. Numune alma kitinin dış ambalajının hasarsız ve son kullanma tarihi içinde olduğunu onaylayın. Malzemeleri kitten çıkarın.
2. Klozetin içine beyaz bir dışkı toplama kağıdı yerleştirin ve dışkılayın (idrarla kontaminasyonu önlemek için).
3. Bir spatula kullanarak, yaklaşık bir bakla büyüklüğünde (~ 5 g) dışkı toplayın ve numune kabına aktarın.
4. Numune alma spatulasını, dışkı numunesi ile birlikte toplama tüpüne yerleştirin ve sıvı seviyesinin tüp üzerinde belirtilen numune alma çizgisinin yakınına yükseldiğinden emin olun.
5. Tüp kapağını güvenli bir şekilde sıkın. Numunenin koruyucu solüsyonla iyice karışmasını sağlamak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
6. H. pylori'nin aşağıdaki tanımlaması ve qPCR ile antibiyotik direnç profillerinin değerlendirilmesi için numuneyi klinik laboratuvara teslim edilene kadar buzdolabında saklayın.

3. Nükleik asit ekstraksiyonu

NOT: Kontaminasyonu önlemek için tüm prosedürleri bir biyogüvenlik kabini içinde tamamlayın.

1. Numune koruma tüpünü ters çevirin ve iyice karıştırın. Dışkı örneği çözeltisinin 1.0 mL'sini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
2. Santrifüj tüplerini karıştırdıktan sonra, 80 °C'de 10 dakika boyunca metal bir banyoya yerleştirin ve beşinci dakikada 30 saniye aralıklı olarak karıştırın. Tüpler oda sıcaklığına soğuduktan sonra, 5 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin ve daha sonraki işlemler için süpernatanı toplayın.
3. Manyetik boncukları yeniden askıya almak için 96 oyuklu plakayı birden çok kez ters çevirin. Dökülmeyi önlemek için sallanmamaya dikkat ederek alüminyum folyo contayı dikkatlice çıkarın.
4. Hazırlanan numuneden 200 μL (adım 3.2'den itibaren) lizis tamponu içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna ekleyin ve her bir oyuğun tek bir numuneye karşılık geldiğinden emin olun. 96 oyuklu plakayı, otomatik ekstraksiyon için nükleik asit ekstraksiyon cihazının belirlenmiş numune bölmesine yerleştirin.
5. Kalan numuneleri ve ekstrakte edilen nükleik asit numunelerini uzun süreli koruma ve ileride kullanım için -20 °C'de saklayın.

4. Helicobacter pylori nükleik asitlerinin qPCR tespiti ve klaritromisin ve kinolonlara direnç mutasyonları

1. Reaktifleri reaktif saklama alanından alın ve oda sıcaklığında çözdürün.
   NOT: Bu kit, 23S rRNA genindeki (A2143G, A2143C, A2144G) ve gyrA genindeki (261A, 261G, 260T, 271A, 271T, 272G) mutasyonlar dahil olmak üzere H. pylori nükleik asidinin kalitatif tespiti için kullanılmıştır. Primerler, problar, Taq enzimi, UNG enzimi ve dNTP'ler kitte mevcuttu. H. pylori ve insan β-aktininin hedef genleri pozitif kalite kontrolüne dahil edildi. İnsanβ-aktin geni, iç kalite kontrol olarak seçildi.
2. Test edilecek numune sayısına bağlı olarak, liyofilize reaktifin N + 2 kopyasını kullanın, burada N test edilecek numune sayısını ve 2 negatif ve pozitif QC'leri temsil eder.
3. Liyofilize tozun tüplerin dibine çöktüğünden emin olmak için kısa bir süre santrifüjleyin. Liyofilize reaktifin kapağını açın (tozun herhangi bir şekilde dökülmesini önlemeye dikkat edin) ve test edilecek numunelerden ekstrakte edilen nükleik asitlerin yanı sıra pozitif ve negatif kontrollerin her yerine 25 μL ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın.
4. PCR reaktiflerini 8-10 saniye vorteksleyin, ardından kabarcık oluşumunu önlemek için 3-5 saniye kısa bir süre santrifüjleyin.
5. 96 oyuklu qPCR plakasını qPCR makinesine yerleştirin. Döngü programını aşağıdaki gibi ayarlayın: önce reaksiyon karışımını (primerler, problar, Taq polimeraz, UNG enzimi, dNTP'ler vb. İçeren) 42 °C ve 95 °C'de (her iki adım bir döngüde) 2 dakika inkübe edin; daha sonra 10 °C'de 10 s ve 95 °C'de 65 s ile 65x döngü; son olarak, denatürasyon, tavlama ve uzatma için 35 °C'de 10 s ve 45 °C'de 58 s ile 58x döngü.
6. Floresan sinyali algılama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: H. pylori korunmuş genlerin ROX floresan etiketlemesi; H. pylori klaritromisin direnç genlerinin FAM floresan etiketlemesi; H. pylori kinolon direnç genlerinin HEX floresan etiketlemesi; ve kitin dahili kontrolü olarak insan β-aktin geninin CY5 floresan etiketlemesi kullanıldı. 58 °C'de veri toplayın. Reaksiyonun tamamlanmasının ardından, verilerin gelecekteki analizler için kaydedildiğinden emin olun.
7. Cihaz referans değer eşiğini otomatik olarak seçtiği için qPCR'ye özel yazılımı kullanarak verileri analiz edin. Helicobacter pylori enfeksiyonu veya direnci de dahil olmak üzere tüm tanı kriterlerini BT değeri ≤30'a ayarlayın; karakteristik S şeklinde bir eğri sergilediklerini onaylayın.

Sonuçlar

Dışkı örneklerinde Helicobacter pylori enfeksiyonu ve antibiyotik direncinin tespiti için qPCR uygulaması
Helicobacter pylori'nin korunmuş genlerindeki nokta mutasyonlarının yanı sıra 23S rRNA geni ve gyrA genindeki nokta mutasyonlarına dayalı primerler ve problar tasarladık. Bu primerler ve problar farklı floresan boyalarla etiketlendi ve daha sonra qPCR tespiti için kullanıldı. qPCR deneyleri için kalite kontrol sonuçları önerilen aralıktaydı ve bu da güvenilir tespit sonuçlarını gösteriyordu (Şekil 1). Bu çalışmada, deneysel protokolün güvenilirliğini karakterize etmek için beş temsili örnek (S1-S5) seçtik (Şekil 2 ve Tablo 1). S1, H. pylori enfeksiyonu olmayan bir örnek iken, S2-S5 farklı ilaç direnç profillerine sahip örneklerdir.

Helicobacter pylori enfeksiyonu için pozitif numuneler için, numune S2, sadece Helicobacter pylori için tespit aralığında BT değerleri gösterdi, bu da bu numunenin Helicobacter pylori için pozitif olduğunu ve hem klaritromisin hem de kinolonlara duyarlı olduğunu ve her iki ilaçla da tedaviye izin verdiğini gösterdi. Numune S3, hem Helicobacter pylori enfeksiyonu hem de klaritromisin direnci için tespit aralığında BT değerleri gösterdi, kinolon direnci için BT değeri tespit edilmedi, bu da numune S3'ün klaritromisine dirençli bir hastadan olduğunu düşündürdü. Benzer şekilde, numune S4, Helicobacter pylori enfeksiyonu ve kinolon direnci için tespit aralığında BT değerlerine sahipti, klaritromisin direnci için BT değeri tespit edilmedi, bu da kinolonlara direnci gösterdi ve tedavi için klaritromisin önerdi. Son olarak, numune S5, tüm testlerde saptanabilir BT değerlerine sahipti, bu da numunenin Helicobacter pylori için pozitif olduğunu ve hem klaritromisin hem de kinolonlara karşı ikili direnç gösterdiğini gösteriyor; Bu nedenle alternatif tedavi seçenekleri klinisyenler tarafından düşünülmelidir. Diğer Helicobacter pylori tespit yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım sadece numune alımını kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda Helicobacter pylori ve direnç profilinin aynı anda tespit edilmesine olanak tanıyarak uygun tedavi kararlarını yönlendirmek için güvenilir sonuçlar sağlar.

Şekil 1: Negatif ve pozitif kontrollerin kalite kontrol sonuçları. Negatif kontroller, CT değeri 30.00 olan CY5 algılama kanalı için S şeklinde bir büyüme eğrisi ≤; FAM, HEX ve ROX kanalları için floresan sinyalleri, CT değerleri 30.00'> veya kayda değer bir sinyal olmadan önemli artışlar göstermemelidir; pozitif kontroller, CT değerleri 30.00 olan tüm algılama kanallarında S-şekilli eğriler ≤ sunmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Dışkı örneklerinde Helicobacter pylori ve antibiyotik direncinin qPCR ile saptanması. Her renk bir floresan sinyalini temsil eder ve farklı floresan sinyalleri farklı genleri temsil eder. Floresan kanalları: H. pylori korunmuş genlerin ROX floresan etiketlemesi (turuncu); H. pylori klaritromisin direnç genlerinin FAM floresan etiketlemesi (mavi); H. pylori kinolon direnç genlerinin HEX floresan etiketlemesi (yeşil); Dahili kontrol geninin CY5 floresan etiketlemesi (kırmızı). Örnek fenotipleri: S1, H. pylori enfeksiyonu için negatif bir örnektir (eşiğin üzerinde sinyal yok); S2, antibiyotik direnci olmayan bir H. pylori-pozitif numunedir (eşiğin üzerinde ROX sinyali); S3, klaritromisin direncine sahip bir H. pylori pozitif numunedir (eşiğin üzerinde FAM sinyali); S4, kinolonlara dirençli bir H. pylori-pozitif numunedir (eşiğin üzerinde HEX sinyali); S5, hem klaritromisin hem de kinolonlara (eşiğin üzerinde FAM ve HEX sinyali) dirençli bir H. pylori pozitif numunedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Örnek	H.Pylori (ROX)		Klaritromisin (FAM)		Kinolonlar (HEX)		CY5
	+/-	CT	+/-	CT	+/-	CT	CT
S1	-	-	-	-	-	-	9.96
S2	+	23.08	-	-	-	-	12.66
S3	+	19.58	+	22.41	-	-	11.4
S4	+	20.65	-	-	+	26.06	14.59
S5	+	19.82	+	22.49	+	21.65	9.48
Negetive	-	-	-	-	-	-	14.73
Pozitif	+	12.7	+	14.47	+	13.07	14.78

Tablo 1: Klaritromisin ve kinolon direnci için H. pylori enfeksiyonu tespiti ve qPCR sonuçları.Tablo, H. pylori enfeksiyonunun kalitatif sonuçlarını sunmaktadır. 23S rRNA gen mutasyonlarının saptanması klaritromisin direncini, gyrA gen mutasyonları ise kinolon direncini gösterir. Semboller: +/-, nitel sonuç; +, olumlu sonuç; -, olumsuz sonuç.

Tartışmalar

Son yıllarda, moleküler tespit yöntemleri mikrobiyoloji alanında yaygın olarak uygulanmakta ve çeşitli bulaşıcı hastalıkların klinik yönetimini önemli ölçüde değiştirmektedir. Bu yöntemler genetik düzeyde çalışır ve sadece bakteri varlığının doğrulanmasına değil, aynı zamanda gen tiplemesi ve antibiyotik direnci testine de izin verir. Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR (qPCR), kısa işlem süresi, yüksek hassasiyeti ve doğruluğu ve düşük çapraz kontaminasyon riski nedeniyle giderek daha fazla tercih edilmektedir. Helicobacter pylori enfeksiyonlarının tanısı için klinik laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Dışkı örneği toplama koruma solüsyonlarının gen tespit yöntemleriyle birleştirilmesi, H. pylori'nin hızlı ve verimli bir şekilde taranmasına ve klaritromisin 23S rRNA geni ve kinolon gyrA genindeki mutasyonların analizi yoluyla daha fazla antibiyotik direnç testine olanak tanır. Bu yöntem, H. pylori duyarlılığını ve ilaçlara karşı direncini değerlendirebilir. Önceki fekal antijen tespit yöntemleri, düşük antijen konsantrasyonları ve numunelerde antijen bozunması nedeniyle azalmış doğruluk ve stabilite gibi dikkate değer sınırlamalara sahiptir. Ek olarak, geleneksel antijen tespit yöntemleri, karmaşık numunelerde yeterli duyarlılık ve özgüllüğe sahip olmayabilir ve bu da sonuçların güvenilirliğini etkileyebilir.

Bu sorunları ele almak için, dışkı örneklerini kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) teknolojisi ile birleştiren bir yöntem öneriyoruz. Bu yaklaşım, algılama hassasiyetini ve doğruluğunu önemli ölçüde artırarak dışkı testini daha güvenilir ve verimli hale getirir ve klinik kullanım için daha yüksek kaliteli sonuçlar sağlar.

Kalite kontrol standartları, qPCR tespiti için çok önemlidir. Kalite kontrolümüz, cihazın periyodik kalibrasyonunu, algılama sisteminin performans doğrulamasını, nükleik asit ekstraksiyon verimliliğinin değerlendirilmesini ve her bir deney partisinin kalite kontrolünü içerir. İlk olarak, numune alma cihazlarımız her 6 ayda bir kalibre edilir ve ekstraksiyon ekipmanı ve amplifikasyon ekipmanı yıllık olarak kalibre edilir. Ek olarak, her bir reaktif partisi için kalibrasyon yapılır. Kalibrasyondan sonra, Macrostone 96S floresan kantitatif PCR cihazı, H. pylori ve direnç mutasyonu tespit kitleri, ekstraksiyon reaktifleri ve ilgili numune alma tüpleri, pipetler ve uçlar dahil olmak üzere algılama sistemi için performansımızı doğrulayabiliriz. Uygunluk oranı, algılama sınırı, çapraz reaksiyon, parazit önleme yeteneği ve hassasiyet ihtiyaçlarımızı karşılar. DNA ürünlerinin konsantrasyonları, nükleik asit ekstraksiyon verimliliği için kabul kriterlerini karşılamak üzere bir DNA konsantrasyon test cihazı ile belirlendi. DNA konsantrasyonu 10 ng/μL'nin üzerindeydi. A260/A280, 1.6 ile 2.0 arasındaydı. Niteliksiz numuneler yeniden çıkarılmalıdır. Sonuçlar sadece günlük kalite kontrol kontrol altında olduğunda geçerlidir. H. pylori ve antibiyotik direnç testi (klaritromisin ve kinolonlar) için kalite kontrol kriterleri aşağıdaki gibidir: negatif kontroller, CT değeri 30.00 olan CY5 tespit kanalı için S şeklinde bir büyüme eğrisi göstermelidir≤; FAM, HEX ve ROX kanalları için floresan sinyalleri, CT değerleri >30.00 veya kayda değer bir sinyal olmadan önemli artışlar göstermemelidir; pozitif kontroller, CT değerleri 30.00 olan tüm algılama kanallarında S-şekilli eğriler ≤ sunmalıdır. Bu koşullar aynı deney içinde karşılanmalıdır; aksi takdirde test geçersiz sayılır ve yeniden test edilmesi gerekir. Ticari tescilli kısıtlamalar nedeniyle, bu belgede primer ve prob dizisi bilgilerinin sağlanamayacağını unutmayın.

Önceki bir çalışmada, araştırmacılar, bu yazıda kullanılanla aynı metodolojiyi kullandılar ve dışkı örneklerinde H. pylori enfeksiyonu için RT-PCR testinin olağanüstü tanısal performans sergilediğini gösterdiler²⁴. Spesifik olarak, test %99.1'lik bir duyarlılık, %100'lük bir özgüllük ve %99.1'lik bir tanısal doğruluk elde etti ve bu da mide biyopsisi örneklerinden (%93.9) elde edilen sonuçlarla yakından uyumluydu (Kappa = 0.929, p < 0.001). Bu dikkate değer anlaşma, RT-PCR testinin son derece güvenilir bir non-invaziv yöntem olarak kabul edilebileceğinin altını çizdi.

Ayrıca, çalışma, özellikle klaritromisin ve levofloksasin direncine odaklanarak, H. pylori'de fekal RT-PCR'nin antibiyotik direncini tespit etme yeteneğini de değerlendirdi. Klaritromisin direnci için dışkı örneklerinde %79.6 duyarlılık, %98.4 özgüllük ve %78.0 tanısal doğruluk ile 43 olgu (%37.3) tespit edildi (Kappa = 0.788, p < 0.001). Benzer şekilde, levofloksasin direnci için 37 olgu (%32.1) tespit edildi ve %86.3 duyarlılık, %91.1 özgüllük ve %74.4 tanısal doğruluk sağladı (Kappa = 0.739, p < 0.001). Bu bulgular, mide biyopsi örneklerinden elde edilenlerle (54 vakada klaritromisin direnci, 36 vakada levofloksasin direnci) oldukça tutarlıydı, bu da fekal RT-PCR testinin antibiyotik direncini tespit etmede etkili olduğunu, her iki antibiyotik için yüksek özgüllüğe ve kabul edilebilir duyarlılığa sahip olduğunu gösteriyor. Bu metodolojinin önceki çalışmada doğrulanması, bu makale bağlamında güvenilirliğini ve uygulanabilirliğini daha da desteklemektedir.

qPCR'ye dayalı dışkı tespit protokolü, H. pylori için non-invaziv tanı alanında kayda değer bir ilerlemeyi temsil ederken, çeşitli sınırlamalar titiz bir değerlendirme gerektirir. İlk olarak, dışkı numunelerinin kullanılması, yöntemin numune kalitesinden etkilenmesini sağlar. Yanlış negatifler, dışkıdaki düşük bakteri yüklerinden kaynaklanabilir, özellikle asemptomatik taşıyıcılarda veya erken evre enfeksiyonları olan hastalarda, H. pylori'nin gastrointestinal sisteme dökülmesi aralıklı olarak gerçekleşir²⁵. Ayrıca, dışkı örnekleri alırken, bakteri miktarı, örneğin alındığı yere bağlı olarak değişebilir. Bu, mide mukozasını doğrudan örnekleyen ve böylece bakteri yükündeki dalgalanmalardan daha az etkilenen mide biyopsi kültürü gibi invaziv yöntemlerle belirgin bir tezat oluşturur. İkincisi, protokolün hedefli amplifikasyon yaklaşımı spesifik olsa da, primer tasarımına dahil edilmeyen nadir veya ortaya çıkan direnç mutasyonlarını tespit etmekte başarısız olabilir ve bu da potansiyel olarak eksik direnç profillerine^{yol açabilir 26}.

Gelecekteki araştırmalar, düşük bolluğa dirençli mutasyonların daha iyi tanımlanması için dijital PCR'nin (dPCR) benimsenmesi de dahil olmak üzere, mutasyon tespit yeteneklerini geliştirmek için metodolojik gelişmelere odaklanmalıdır²⁷. Prob panelleri, klinik olarak ilgili polimorfizmleri kapsayacak şekilde stratejik genişleme gerektirir. UBT, mide mukozal veya fekal PCR testi ve antijen tespiti dahil olmak üzere tanı metodolojilerini karşılaştırmalı olarak değerlendirmek için çok merkezli çalışmaların yürütülmesi, klinik uygulama için kapsamlı tanısal performans verileri sağlar ve böylece dışkı PCR test protokollerinin standardizasyonunu ilerletir. Bu birleşik iyileştirmeler, fekal qPCR'nin non-invaziv bir tanı aracı olarak kullanışlılığını güçlendirirken, kesin antibiyotik tedavisine rehberlik etmek için hala önemli olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
Disposable fecal collection and storage tube	Mole		Collect fecal specimens
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube
Helicobacter pylori nucleic acid, clarithromycin, and quinolone resistance mutation detection kit	Mole		Detection of Helicobacter pylori infection and antibiotic resistance; freeze-dried H. pylori reagent (containing primers, probes, Taq polymerase, UNG enzyme, dNTPs, etc.), a positive control for H. pylori (containing Helicobacter pylori and human β-actin target genes), and a negative control for H. pylori (containing human β-actin target genes)
Mole 96M automated nucleic acid extractor	Mole		For DNA extraction
Nucleic acid extraction kit	Mole		To extract nucleic acid; contains lysis buffer (guanidine salt, tris hydroxymethyl aminomethane, Tween-20, sodium chloride), Wash Buffer 1 (sodium chloride), Wash Buffer 2 (tris hydroxymethyl aminomethane, Tween-20), Wash Buffer 3 (magnetic beads, Tween-20), Wash Buffer 4 (nuclease-free water), and Elution Buffer (tris hydroxymethyl aminomethane), along with a magnetic rack
SLAN Fully automatic medical PCR analysis system	HONGSHI		Data Analysis
SLAN-96S Real-Time PCR machine	HONGSHI		Fluorescent quantitative PCR amplification
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent