Выявление инфекции Helicobacter pylori и устойчивости к антибиотикам с помощью количественного анализа полимеразной цепной реакции кала

Резюме

Протокол использует неинвазивный отбор образцов кала в сочетании с количественной полимеразной цепной реакцией, чтобы предложить удобный и быстрый метод диагностики инфекции Helicobacter pylori и ее устойчивости к кларитромицину и хинолонам.

Аннотация

Helicobacter pylori (H. pylori) широко распространена во всем мире, при этом примерно 50% населения мира имеют в анамнезе инфекцию H. pylori. В Китае уровень заражения колеблется от 40% до 70%. H. pylori в первую очередь связана с желудочно-кишечными заболеваниями, такими как хронический гастрит, язва желудка и двенадцатиперстной кишки. В настоящее время клиническое лечение инфекции H. pylori включает в себя тройную или четверную терапию. Однако широкое использование антибиотиков привело к развитию устойчивости к антибиотикам у H. pylori. Таким образом, обнаружение как H. pylori, так и ее устойчивости к антибиотикам имеет решающее значение для назначения клинического лечения.

Методы диагностики H. pylori включают уреа-дыхательный тест (UBT), тест на антиген, серологический тест на антитела, эндоскопию, экспресс-тест на уреазу (RUT) и бактериальный посев. Хотя первые три метода являются неинвазивными, они не позволяют восстанавливать бактерии и, таким образом, не могут использоваться для тестирования на устойчивость. Последние три метода являются инвазивными, дорогостоящими, требуют высокой технической квалификации и могут причинить вред пациентам.

Таким образом, неинвазивный, быстрый метод одновременного выявления инфекции H. pylori и устойчивости к антибиотикам имеет первостепенное клиническое значение для эффективной эрадикации H. pylori. Целью данной работы является внедрение специального протокола, сочетающего количественную полимеразную цепную реакцию (кПЦР) с технологией флуоресцентного зонда TaqMan для быстрого выявления инфекции H. pylori и устойчивости к антибиотикам. Этот метод обеспечивает удобный, быстрый и неинвазивный способ диагностики инфекции и резистентности H. pylori , в отличие от традиционного бактериального культивирования и других методов. qPCR используется для идентификации инфекции и обнаружения мутаций в генах 23S рРНК и gyrA , которые связаны с устойчивостью к кларитромицину и хинолонам соответственно. По сравнению с традиционными методами культивирования, этот подход предлагает неинвазивный, экономически эффективный и эффективный по времени метод выявления инфекции Helicobacter pylori и определения ее устойчивости к антибиотикам.

Введение

Helicobacter pylori – грамотрицательная спиралевидная бактерия, которая может постоянно инфицировать 1-й желудочный^{эпителий человека}. В 1994 году Всемирная организация здравоохранения классифицировала H. pylori как канцероген группы 1 для рака желудка, при этом у ~3% инфицированных людей в конечном итоге развилось заболевание². Недавно опубликованный систематический обзор показал, что в последнее десятилетие наблюдалась общая тенденция к повышению устойчивости H. pylori к антибиотикам, которая достигла тревожных уровней во всем мире,^{особенно} резистентность к кларитромицину. В Китае данные последнего обследования показали, что совокупная распространенность H. pylori среди городского населения Китая составляет 27,08%; Показатели резистентности к кларитромицину и левофлоксацину составили 50,83% и 47,17%⁴, что выше, чем в США (левофлоксацин 37,6%, кларитромицин 31,5%)⁵и Европе (левофлоксацин 15,8% и кларитромицин 21,4%)⁶. Следовательно, ранняя и точная диагностика и лечение имеют решающее значение. Тем не менее, растущая устойчивость H. pylori к антибиотикам значительно снижает эффективность лечения, что подчеркивает настоятельную необходимость продолжения исследований в области ее диагностики и лечения.

Методы диагностики H. pylori подразделяются на инвазивные и неинвазивные методы⁷. Инвазивные методы включают гистопатологическое исследование, экспресс-тест на уреазу (RUT) и бактериальный посев⁸. Гистопатологическое исследование основано на обработке и микроскопическом наблюдении образцов биопсии, точность которых ограничена гистологической подготовкой и патологоанатомической экспертизой⁹. RUT обнаруживает H. pylori через активность уреазы, которая гидролизует мочевину с образованием аммиака, что приводит к щелочному сдвигу в реагенте, что указывает на присутствие бактерии⁹. Это просто и экономически выгодно. Бактериальная культура, считающаяся «золотым стандартом», часто имеет вероятность успеха ниже 50% из-за уникальных физиологических характеристик H. pylori¹⁰.

К неинвазивным методам относятся уреа-дыхательный тест (UBT) 13C/14C, серологическая диагностика и анализ кала на антиген (SAT)¹¹. Дыхательный тест работает по принципу, аналогичному принципу RUT, обнаруживая изотопно меченный CO₂ в выдыхаемом воздухе для подтверждения инфекции¹². Серологический диагноз выявляет антитела, которые могут сохраняться после эрадикации бактерий, что затрудняет оценку эффективности лечения¹³. Анализ кала на антиген выявляет специфические антигены H. pylori в образцах кала, обеспечивая надежный неинвазивный метод с меньшим процентом ложноположительных результатов и хорошей точностью для диагностики активных инфекций¹⁴.

Каждый метод диагностики имеет свои преимущества и ограничения¹⁵. Помимо бактериального культивирования, другие методы испытывают трудности с выявлением устойчивости к антибиотикам, в то время как культивирование затруднено низкими показателями успеха¹⁶. В последнее время для обнаружения микроорганизмов широко применяются методы молекулярной диагностики, такие как количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР)¹⁷. Количественная ПЦР позволяет точно обнаруживать H. pylori и анализировать мутации гена резистентности, обеспечивая более полное представление об инфекции¹⁸.

Флуоресцентные зонды предназначены для специфического связывания с целевой последовательностью в ДНК в процессе количественной ПЦР. Эти зонды обычно помечены флуоресцентным красителем, который излучает сигнал, когда зонд связывается со своей мишенью, и расщепляется полимеразой во время амплификации. Это обеспечивает измерение процесса ПЦР в режиме реального времени. Флуоресцентные зонды известны своей высокой специфичностью благодаря уникальной конструкции зонда, которая обеспечивает обнаружение только целевой последовательности ДНК, снижая вероятность неспецифического связывания и улучшая специфичность анализа. Это делает технологию флуоресцентных зондов особенно полезной для обнаружения мишеней с низким содержанием, таких как ДНК Helicobacter pylori в образцах стула. Хотя SYBR Green является широко используемым ДНК-связывающим красителем в ПЦР, он может связываться с любой двухцепочечной ДНК, что может привести к неспецифической амплификации и ложноположительным результатам.

Культивирование Helicobacter pylori из клинических образцов не дает данных об устойчивости к антибиотикам напрямую. Напротив, кПЦР на основе флуоресцентных зондов является более быстрой, удобной и может быть адаптирована для одновременного обнаружения H. pylori и маркеров устойчивости к антибиотикам. Этот метод не только дает более быстрые результаты, чем традиционные методы культивирования, но и позволяет одновременно обнаруживать гены устойчивости к антибиотикам, что значительно повышает эффективность и удобство обнаружения. Этот метод обеспечивает удобный, быстрый и неинвазивный способ диагностики инфекции и резистентности H. pylori , в отличие от традиционного бактериального культивирования и других методов.

Существуют два важнейших вопроса, которые необходимо учитывать для устойчивости к антибиотикам H. pylori : 1) постоянство генотипа и фенотипа, 2) множественная лекарственная устойчивость. Крупномасштабное многоцентровое исследование в Китае показало, что модели двойной резистентности к кларитромицину/левофлоксацину составили 26,1%. Фенотипы и генотипы H. pylori, устойчивые к кларитромицину и левофлоксацину, показали удовлетворительное совпадение (коэффициент каппа = 0,810 и 0,782 соответственно)¹⁹. Таким образом, целесообразно использовать метод количественной ПЦР для выявления инфекции H. pylori и лекарственной устойчивости. Тест кала на антиген (SAT) и методы количественной ПЦР используются все чаще из-за удобства забора. Чувствительность, специфичность и точность методов обнаружения H. pylori представлены следующим образом: qPCR > UBT > SAT > RUT> CagA IgG > культуре²⁰. Для первичного скрининга подходят все неинвазивные методы. Поскольку кПЦР может дополнительно обнаруживать гены лекарственной устойчивости, кПЦР и культуральное исследование будут более подходящими для руководства лечением.

Другие инновационные подходы, такие как алгоритмы искусственного интеллекта (ИИ) в сочетании с эндоскопическими изображениями²¹, цифровая микрофлюидика²² и RPA-CRISPR/Cas12a²³, теоретически показывают хорошую диагностическую эффективность и многообещающие перспективы применения. Тем не менее, кПЦР в настоящее время является наиболее сложным методом молекулярной биологии, способным обеспечить превосходное решение для диагностики и лечения инфекций, вызванных H. pylori .

протокол

Это исследование соответствует этическим принципам, установленным Комитетом по этике Народной больницы провинции Гуандун Южного медицинского университета, Гуанчжоу, Китай (Одобрение No: KY2024-445-01). Подробную информацию о материалах, использованных в этом исследовании (реактивы, химикаты, оборудование и программное обеспечение), можно найти в Таблице материалов.

1. Отбор участников

1. Выбирайте участников в возрастном диапазоне от 18 до 60 лет.
2. Выбирайте участников, которые могут пройти скрининг инфекции Helicobacter pylori , таких как пациенты с такими симптомами, как гастрит, пептическая язва или диспепсия, а также бессимптомные люди.
3. Исключить из исследования пациентов, которые в течение последнего месяца применяли антибиотики, препараты, содержащие висмут (такие как капсулы цитрата калия, капсулы коллоидного пектина висмута или таблетки на основе соединения висмута) или противомикробные китайские препараты, или тех, кто в течение последних 2 недель применял ингибиторы протонной помпы или антагонисты Н2-рецепторов (такие как омепразол, пантопразол, рабепразол, циметидин или низатидин). Также исключите из исследования женщин во время менструального периода.

2. Забор образцов кала

ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставьте участникам раздел 2 в качестве инструкций.

1. Убедитесь, что внешняя упаковка набора для отбора проб не повреждена и срок годности не истек. Выньте материалы из набора.
2. Положите в унитаз белую бумагу для сбора кала и испражнитесь (во избежание загрязнения мочой).
3. С помощью шпателя соберите порцию кала размером примерно с боб (~5 г) и переложите ее в контейнер для образца.
4. Поместите шпатель для отбора проб вместе с образцом кала в пробирку для сбора, следя за тем, чтобы уровень жидкости поднялся до уровня, близкого к линии отбора проб, указанной на пробирке.
5. Надежно затяните крышку трубки. Переверните пробирку несколько раз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание образца с консервирующим раствором.
6. Образец хранят в холодильнике до доставки в клиническую лабораторию для последующей идентификации H. pylori и оценки профилей устойчивости к антибиотикам с помощью количественной ПЦР.

3. Экстракция нуклеиновых кислот

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры в шкафу биобезопасности, чтобы избежать загрязнения.

1. Переверните пробирку для консервации образцов и тщательно перемешайте. Перелейте 1,0 мл раствора кала в микроцентрифужную пробирку.
2. После смешивания пробирок центрифуги поместите их в металлическую ванну при температуре 80 °C на 10 минут, с прерывистым перемешиванием в течение 30 с на пятой минуте. После того, как пробирки остынут до комнатной температуры, центрифугируйте при 10 000 × г в течение 5 минут и соберите надосадочную жидкость для дальнейшей обработки.
3. Переверните 96-луночную пластину несколько раз, чтобы снова суспендировать магнитные шарики. Осторожно снимите уплотнитель из алюминиевой фольги, стараясь не трястись, чтобы предотвратить разлив.
4. Добавьте 200 мкл подготовленного образца (начиная с шага 3.2) в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего буфер для лизиса, чтобы убедиться, что каждая лунка соответствует одному образцу. Поместите 96-луночный планшет в специальный отсек для образцов прибора для экстракции нуклеиновых кислот для автоматической экстракции.
5. Храните оставшиеся образцы и извлеченные образцы нуклеиновых кислот при температуре -20 °C для долгосрочного хранения и использования в будущем.

4. Количественная ПЦР Обнаружение нуклеиновых кислот Helicobacter pylori и мутаций резистентности к кларитромицину и хинолонам

1. Возьмите реактивы из хранилища реактивов и разморозьте их при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот набор был использован для качественного обнаружения нуклеиновой кислоты H. pylori, включая мутации в гене 23S рРНК (A2143G, A2143C, A2144G) и гене gyrA (261A, 261G, 260T, 271A, 271T, 272G). В наборе были доступны праймеры, зонды, фермент Taq, фермент UNG и dNTP. Гены-мишени H. pylori и человеческого β-актина были включены в положительный контроль качества. В качестве внутреннего контроля качества был выбран ген β-актина человека.
2. Исходя из количества образцов, подлежащих тестированию, используйте N + 2 копии лиофилизированного реагента, где N представляет количество образцов, подлежащих тестированию, а 2 представляет отрицательный и положительный контроль качества.
3. Кратковременно центрифугируйте, чтобы убедиться, что лиофилизированный порошок осел на дне пробирок. Откройте крышку лиофилизированного реагента (стараясь не допустить рассыпания порошка) и добавьте 25 мкл на лунку экстрагированных нуклеиновых кислот из исследуемых образцов, а также из положительного и отрицательного контроля. Плотно закройте трубки.
4. Вортексируйте реагенты для ПЦР в течение 8-10 с, затем кратковременно центрифугируйте в течение 3-5 с, чтобы избежать образования пузырьков.
5. Поместите 96-луночный планшет для количественной ПЦР на аппарат для количественной ПЦР. Установите программу циклов следующим образом: сначала инкубируйте реакционную смесь (содержащую праймеры, зонды, Taq-полимеразу, фермент UNG, dNTP и т.д.) при 42 °C и 95 °C (оба этапа в одном цикле) в течение 2 мин; затем цикл 10 раз по 10 с при 95°С и 45 с при 65°С; наконец, цикл 35x с 10 с при 95 °C и 45 с при 58 °C для денатурации, отжига и растяжения.
6. Установите следующие параметры детектирования флуоресцентного сигнала: ROX флуоресцентное мечение консервативных генов H. pylori; FAM флуоресцентное мечение генов устойчивости к кларитромицину H. pylori; HEX-флуоресцентное мечение генов устойчивости к хинолонам H. pylori; и флуоресцентное мечение CY5 гена β-актина человека использовались в качестве внутреннего контроля набора. Собирайте данные при температуре 58 °C. По завершении реакции убедитесь, что данные сохранены для будущего анализа.
7. Анализируйте данные с помощью специального программного обеспечения для количественной ПЦР, так как прибор автоматически выбирает базовый порог. Установите все диагностические критерии, включая наличие инфекции Helicobacter pylori или резистентность, к значению КТ ≤30; подтверждают, что они демонстрируют характерную S-образную кривую.

Результаты

Применение количественной ПЦР для выявления инфекции Helicobacter pylori и устойчивости к антибиотикам в образцах кала
Нами были разработаны праймеры и зонды на основе точечных мутаций в консервативных генах Helicobacter pylori, а также в гене 23S рРНК и гене gyrA . Эти праймеры и зонды были помечены различными флуоресцентными красителями, а затем использованы для обнаружения количественной ПЦР. Результаты контроля качества экспериментов с количественной ПЦР находились в пределах рекомендуемого диапазона, что указывает на надежные результаты обнаружения (рис. 1). В этом исследовании мы отобрали пять репрезентативных образцов (S1-S5) для характеристики надежности экспериментального протокола (Рисунок 2 и Таблица 1). S1 — образец без инфекции H. pylori , а S2-S5 — образцы с различными профилями лекарственной устойчивости.

Для образцов, положительных на инфекцию Helicobacter pylori , образец S2 показал значения КТ в пределах диапазона обнаружения только для Helicobacter pylori, что указывает на то, что этот образец положительен на Helicobacter pylori и чувствителен как к кларитромицину, так и к хинолонам, что позволяет проводить лечение любым из препаратов. Образец S3 показал значения КТ в пределах диапазона обнаружения как инфекции Helicobacter pylori , так и резистентности к кларитромицину, при этом значения КТ для резистентности к хинолонам не были обнаружены, что позволяет предположить, что образец S3 был взят у пациента, резистентного к кларитромицину. Аналогичным образом, образцы S4 имели значения КТ в пределах диапазона обнаружения инфекции Helicobacter pylori и резистентности к хинолонам, при этом значения КТ не были обнаружены для устойчивости к кларитромицину, что указывает на устойчивость к хинолонам и рекомендацию кларитромицина для лечения. Наконец, образец S5 имел обнаруживаемые значения КТ во всех тестах, указывающие на то, что образец положительен на Helicobacter pylori и демонстрирует двойную устойчивость как к кларитромицину, так и к хинолонам; Таким образом, клиницисты должны рассмотреть альтернативные варианты лечения. По сравнению с другими методами обнаружения Helicobacter pylori , этот подход не только облегчает получение образцов, но и позволяет одновременно обнаруживать Helicobacter pylori и ее профиль резистентности, обеспечивая надежные результаты для принятия соответствующих решений о лечении.

Рисунок 1: Результаты контроля качества негативного и положительного контроля. Отрицательные элементы управления должны отображать S-образную кривую роста для канала детектирования CY5 со значением CT ≤ 30,00; флуоресцентные сигналы для каналов FAM, HEX и ROX не должны демонстрировать значительного увеличения, при этом значения CT > 30,00 или без заметного сигнала; положительный контроль должен представлять S-образные кривые во всех каналах детектирования со значениями КТ ≤ 30,00. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Обнаружение Helicobacter pylori и ее устойчивости к антибиотикам в образцах кала с помощью количественной ПЦР. Каждый цвет представляет флуоресцентный сигнал, а разные флуоресцентные сигналы представляют разные гены. Флуоресцентные каналы: флуоресцентное мечение ROX (оранжевый) консервативных генов H. pylori ; FAM флуоресцентное мечение (синий) генов устойчивости к кларитромицину H. pylori ; HEX-флуоресцентное мечение (зеленое) генов устойчивости к хинолонам H. pylori ; CY5 флуоресцентное мечение (красный) гена внутреннего контроля. Фенотипы образцов: S1 является отрицательным образцом на инфекцию H. pylori (сигнал выше порога отсутствует); S2 является H . pylori-положительным образцом без устойчивости к антибиотикам (сигнал ROX выше порога); S3 является H . pylori-положительным образцом с резистентностью к кларитромицину (сигнал FAM выше порога); S4 является H. pylori-положительным образцом с устойчивостью к хинолонам (сигнал HEX выше порога); S5 является H . pylori-положительным образцом, устойчивым как к кларитромицину, так и к хинолонам (сигнал FAM и HEX выше порога). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Образец	H.Pylori (ROX)		Кларитромицин (FAM)		Хинолоны (HEX)		CY5
	+/-	КТ	+/-	КТ	+/-	КТ	КТ
С1	-	-	-	-	-	-	9.96
С2	+	23.08	-	-	-	-	12.66
С3	+	19.58	+	22.41	-	-	11.4
С4	+	20.65	-	-	+	26.06	14.59
С5	+	19.82	+	22.49	+	21.65	9.48
негетив	-	-	-	-	-	-	14.73
Положительная	+	12.7	+	14.47	+	13.07	14.78

Таблица 1: Результаты выявления инфекции H. pylori и количественной ПЦР на резистентность к кларитромицину и хинолонам. В таблице приведены качественные результаты инфекции H. pylori. Обнаружение мутаций гена 23S рРНК указывает на устойчивость к кларитромицину, в то время как мутации гена gyrA указывают на устойчивость к хинолонам. Символы: +/−, качественный результат; +, положительный результат; −, отрицательный результат.

Обсуждение

В последние годы методы молекулярного детектирования широко применяются в области микробиологии, что значительно изменило клиническое лечение ряда инфекционных заболеваний. Эти методы работают на генетическом уровне, позволяя не только подтвердить присутствие бактерий, но и типировать гены и тестировать устойчивость к антибиотикам. Флуоресцентная количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР) становится все более предпочтительной из-за ее короткого времени обработки, высокой чувствительности и точности, а также низкого риска перекрестного загрязнения. Он стал широко использоваться в клинических лабораториях для диагностики инфекций, вызванных Helicobacter pylori .

Сочетание решений по сохранению сбора образцов кала с методами обнаружения генов позволяет быстро и эффективно проводить скрининг H. pylori и дальнейшее тестирование на устойчивость к антибиотикам путем анализа мутаций в гене рРНК кларитромицина 23S и гене хинолона gyrA . С помощью этого метода можно оценить чувствительность H. pylori и резистентность к лекарственным препаратам. Предыдущие методы обнаружения фекальных антигенов имеют заметные ограничения, такие как сниженная точность и стабильность из-за низких концентраций антигена и деградации антигена в образцах. Кроме того, традиционные методы обнаружения антигенов могут не обладать достаточной чувствительностью и специфичностью в сложных образцах, что влияет на достоверность результатов.

Для решения этих проблем мы предлагаем метод, сочетающий образцы кала с технологией количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). Такой подход значительно повышает чувствительность и точность обнаружения, делая анализ кала более надежным и эффективным, а также обеспечивая более высокое качество результатов для клинического использования.

Стандарты контроля качества имеют решающее значение для обнаружения количественной ПЦР. Наш контроль качества включает в себя периодическую калибровку прибора, проверку работоспособности системы обнаружения, оценку эффективности экстракции нуклеиновых кислот и контроль качества каждой партии экспериментов. Во-первых, наши приборы для отбора проб калибруются каждые 6 месяцев, а оборудование для экстракции и амплификаторное оборудование калибруются ежегодно. Кроме того, для каждой партии реагентов производится калибровка. После калибровки мы можем проверить нашу работу системы обнаружения, включая флуоресцентный количественный ПЦР-прибор Macrostone 96S, наборы для обнаружения мутаций H. pylori и резистентности, экстракционные реагенты, а также соответствующие пробирки для отбора проб, пипетки и наконечники. Коэффициент соответствия, предел обнаружения, перекрестная реакция, помехозащищенность и точность отвечают нашим потребностям. Концентрации продуктов ДНК определяли с помощью тестера концентрации ДНК в соответствии с критериями приемлемости эффективности экстракции нуклеиновых кислот. Концентрация ДНК была выше 10 нг/мкл. У A260/A280 был от 1,6 до 2,0. Неквалифицированные образцы должны быть повторно извлечены. Результаты действительны только в том случае, если ежедневный контроль качества находится под контролем. Для тестирования на H. pylori и устойчивость к антибиотикам (кларитромицин и хинолоны) критерии контроля качества следующие: отрицательные контрольные данные должны отображать S-образную кривую роста для канала обнаружения CY5 со значением КТ ≤ 30,00; флуоресцентные сигналы для каналов FAM, HEX и ROX не должны демонстрировать значительного увеличения, при этом значения CT >30,00 или без заметного сигнала; положительный контроль должен представлять S-образные кривые во всех каналах детектирования со значениями КТ ≤ 30,00. Эти условия должны быть соблюдены в рамках одного и того же эксперимента; В противном случае тест будет признан недействительным и должен быть протестирован повторно. Обратите внимание, что из-за коммерческих проприетарных ограничений информация о праймере и последовательности зонда не может быть представлена в данной статье.

В предыдущем исследовании ученые использовали методологию, идентичную той, которая использовалась в этой статье, продемонстрировав, что тестирование ОТ-ПЦР на инфекцию H. pylori в образцах кала продемонстрировало исключительную диагностическую эффективность^. В частности, тест достиг чувствительности 99,1%, специфичности 100% и диагностической точности 99,1%, что близко согласуется с результатами биопсии желудка (93,9%) (Kappa = 0,929, p < 0,001). Это замечательное соглашение подчеркнуло, что тестирование ОТ-ПЦР можно рассматривать как высоконадежный неинвазивный метод.

Кроме того, в исследовании также оценивалась способность фекальной ОТ-ПЦР выявлять устойчивость к антибиотикам у H. pylori, уделяя особое внимание резистентности к кларитромицину и левофлоксацину. Что касается резистентности к кларитромицину, то в образцах кала было выявлено 43 случая (37,3%) с чувствительностью 79,6%, специфичностью 98,4% и диагностической точностью 78,0% (Kappa = 0,788, p < 0,001). Аналогичным образом, для резистентности к левофлоксацину было выявлено 37 случаев (32,1%), что дало чувствительность 86,3%, специфичность 91,1% и диагностическую точность 74,4% (Kappa = 0,739, p < 0,001). Эти результаты в значительной степени согласуются с данными, полученными из образцов биопсии желудка (резистентность к кларитромицину в 54 случаях, резистентность к левофлоксацину в 36 случаях), что указывает на то, что фекальное тестирование ОТ-ПЦР эффективно в выявлении устойчивости к антибиотикам, обладая высокой специфичностью и приемлемой чувствительностью к обоим антибиотикам. Валидация этой методологии в предыдущем исследовании еще раз подтверждает ее надежность и применимость в контексте данной статьи.

Несмотря на то, что протокол обнаружения кала на основе количественной ПЦР представляет собой заметный шаг вперед в области неинвазивной диагностики H. pylori, некоторые ограничения требуют тщательного рассмотрения. Во-первых, использование образцов кала влияет на качество образца на метод. Ложноотрицательные результаты могут быть результатом низкой бактериальной нагрузки в кале, особенно у бессимптомных носителей или пациентов с инфекциями на ранних стадиях, у которых выделение H. pylori в желудочно-кишечный тракт происходит с перерывами^. Более того, при взятии образцов кала количество бактерий может варьироваться в зависимости от того, где берется проба. Это заметно контрастирует с инвазивными методами, такими как биопсия желудка, которая непосредственно исследует слизистую оболочку желудка и, таким образом, меньше подвержена влиянию колебаний бактериальной нагрузки. Во-вторых, несмотря на то, что подход к таргетной амплификации в протоколе специфичен, он может не обнаруживать редкие или возникающие мутации резистентности, которые не включены в дизайн праймера, что потенциально может привести к неполному профилю резистентности^.

Будущие исследования должны быть сосредоточены на методологических достижениях для расширения возможностей обнаружения мутаций, включая внедрение цифровой ПЦР (дПЦР) для улучшенной идентификации мутаций с низкой устойчивостью²⁷. Панели зондов требуют стратегического расширения, чтобы охватить клинически значимые полиморфизмы. Проведение многоцентровых исследований для сравнительной оценки методологий диагностики, включая UBT, ПЦР-тестирование слизистой оболочки желудка или кала, а также обнаружение антигенов, позволяет получить исчерпывающие диагностические данные для клинической практики, тем самым способствуя стандартизации протоколов ПЦР-тестирования кала. Эти комбинированные улучшения повысят полезность количественной ПЦР кала в качестве неинвазивного диагностического инструмента, в то же время сохраняя важность для точного определения лечения антибиотиками.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
Disposable fecal collection and storage tube	Mole		Collect fecal specimens
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube
Helicobacter pylori nucleic acid, clarithromycin, and quinolone resistance mutation detection kit	Mole		Detection of Helicobacter pylori infection and antibiotic resistance; freeze-dried H. pylori reagent (containing primers, probes, Taq polymerase, UNG enzyme, dNTPs, etc.), a positive control for H. pylori (containing Helicobacter pylori and human β-actin target genes), and a negative control for H. pylori (containing human β-actin target genes)
Mole 96M automated nucleic acid extractor	Mole		For DNA extraction
Nucleic acid extraction kit	Mole		To extract nucleic acid; contains lysis buffer (guanidine salt, tris hydroxymethyl aminomethane, Tween-20, sodium chloride), Wash Buffer 1 (sodium chloride), Wash Buffer 2 (tris hydroxymethyl aminomethane, Tween-20), Wash Buffer 3 (magnetic beads, Tween-20), Wash Buffer 4 (nuclease-free water), and Elution Buffer (tris hydroxymethyl aminomethane), along with a magnetic rack
SLAN Fully automatic medical PCR analysis system	HONGSHI		Data Analysis
SLAN-96S Real-Time PCR machine	HONGSHI		Fluorescent quantitative PCR amplification
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent