Yazarlar AV kalemi ile hücre blok kesme bölümünde gösteren Chris Chartrand, HT (ASCP) teşekkür ederim.

Giriş: Bu HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG) kullanarak sıvı bazlı sitoloji (LBC) örnek hücre blok hazırlanması için Shidham yöntemi anlatan bir video. Gibi rastgele diğer yaklaşımlara göre, bu protokolün iki kritik özellikleri tek tek dağılmış gevşek hücreleri (1-5) ile nispeten hiposellüler örneklerinden hücre bloklarının hazırlanması için. <ol><li> Bu protokol, hücrelerin hücre blok kesme yüzeyine paralel düzlemi boyunca konsantre için gerekli adımları içerir. </li><li> Ayrıca, aşağıdaki amaçlarla iki hizmet AV-işaretleyici (Şekil 1b), bir deniz feneri gibi koyu dahil içerir: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Hücrelerin yoğunlaştığı hangi düzeyde görselleştirmek için. Koyu renkli işaret kesme sırasında maruz kaldığında ilgi hücreler ile hücre bloğu alanı histotechnologist tarafından görüntülendi olabilir. Bu yetenek izlemek için hücrelerin en düzeyi ile kesme ya da örnek hücrelerinin yüksek konsantrasyon seviyesine çok yüzeysel kesim önleyecektir. </li><li> Farklı slaytlar seri hücre blok bölümünde konumlandırıcı referans noktası olarak hizmet etmek. Bu referans noktası SCIP yaklaşım (6,7) ile bir koordinat immünoreaktivite desen değerlendirilmesi için hücrelerin özellikle hücre ya da gruplar bulmasına yardımcı olmak için bir işaret olarak görür. </li></ol></li></ol> PROTOKOL (Şekil 2) Numunenin hazırlanması. <ol><li> Düz bir alt cam tüp (15mm çap x 45mm) (Şekil 2.1 üzerinden 2.4) artık LBC servikal sitoloji örnek aktarın. Daha büyük bir plastik taşıyıcı tüp (28 x 85mm) ve santrifüj cam tüp içine yerleştirin. Taşıyıcı tüp cam altındaki tüp çıkarın ve süpernatantı dökün. </li><li> Cam tüp daha sonra kapatılmış (bir sonraki adımda ısıtma su dökülmesini önlemek için) ve daha büyük bir düz dipli taşıyıcı plastik tüp içine yerleştirilir </li><li> Cam tüp içeren taşıyıcı plastik tüp daha sonra, şapkalı bir santrifüj yerleştirilir (hücreler, düz cam tüp alt dik düşmek, böylece döner bardak ve sabit açılı bardak), ve 1805 G (3000 rpms döndü. rotor yarıçapı-17cm) beş dakika (Şekil 2.5). </li><li> Sonra santrifüj tüpleri dikey olarak kaldırılır ve küçük cam tüp hücreleri ile tortulaşmış pelet bozmadan daha büyük taşıyıcı plastik tüp forseps ile kaldırılır. </li><li> Numune ile cam tüp kapağını açıp ve süpernatantı tortu hücreler altta düz bir tabaka (Şekil 2.6) rahatsız etmemek için özen dökülür. </li></ol> İçerme ve jel ek referans koordinat AV-işaretleyici <ol><li> Karanlık bir işaret AV-işaretleyici (yaklaşık 2 mm X 2 mm boyutlarında, düz, koyu renkli, sectionable malzeme parçası, su yüzüne) (Şekil 3), cam tüp tabelasını (Şekil 2.7) eklenir. </li><li> 10 saniye boyunca orta güçte mikrodalga eriterek HG bir kısım Liquefy. </li><li> 0.5 ml erimiş HG hızlı bir tortu ile tüp karışımı ekleyin ve (HG katılaşabilme başlamak için izin vermeden hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin) (Şekil 2.8) recap. </li><li> Yaklaşık 2.5 ml ılık (45 ° C) su taşıyıcı plastik tüp (Şekil 2.9). </li><li> Küçük kapaklı cam tüp ılık su ile plastik tüp içine yerleştirilir. (Bu adım, sonraki adımlarda katılaşabilme HG tutmak için gerekli) (Şekil 2.9). </li><li> Taşıyıcı plastik tüp santrifüj yerleştirilir (hücreler, düz cam tüp alt dik düşmek, böylece döner bardak ve sabit açılı bardak) ve beş 1805 G (3000 rpms, rotor yarıçapı-17cm) bükülmüş dakika. Bu santrifüj adımın amacı, AV-işaretleyici itmek ve son parafin hücre bloğu (Şekil 1d) kesim yüzeyi daha yakın bir tabaka haline hücrelerin konsantre. </li><li> Bu tüpler daha sonra, alt kısmında örnek hücreleri ile tortulaşmış ince bir tabaka rahatsız etmemek için özen santrifüj yavaşça ve dikey kaldırılır. </li><li> Büyük plastik boru kapağını açtı ve küçük cam tüp örnek hücrelerinin tortu tabakası bozmadan bir forseps ile dikey olarak kaldırılır. </li><li> Küçük bir cam tüp, dikey pozisyonda, serin ve HG (Şekil 2.11) katılaşmaya 15 dakika boyunca buzdolabında. </li></ol> Son işlem için jel ile örnek bir düğme olarak hücre blok çıkarılması <ol><li> Şırınga (Şekil 2.12) ile 23 gauge iğne ile% 10 formalin squirting tarafından, alt tortu / konsantre örnek tabakası ile katılaşmış HG disk, düz dipli cam tüp yerinden. </li><li> Örnek (Şekil 2.12) katılaşmış HG diskin çevresindeki tüpün kenarı boyunca iğne yerleştirilir. </li><li> Needlformalin şırınga yoluyla yavaş yavaş itilir e tüpün kenarı boyunca döndürülür. Bu sonuç, koyu renkli işaret AV-marker ve düz cam tüp altında (Şekil 2.12) konsantre numune ile birlikte HG düğmesine ayrılması. </li><li> Hücre bloğu (örnek hücreleri ile jel düğmesi) etiketli bir kaset yerleştirilir ve parafin hücre bloklarının (Şekil 2.13) hazırlamak için doku işleme için sunulur. </li></ol> Gömülmesi ve numunenin kesme <ol><li> Disk aşağı kesim yüzeyi gibi karanlık işaret işaretleyici tarafında (Şekil 1) parafine gömülü. </li><li> Bir işaret açık ve net bir şekilde görünür olduğu gibi blok koyu renkli AV-işaretleyici kadar kesitli. </li><li> Üç dört mikron bölümleri numune tek tek dağılmış hücreleri en içermelidir bu düzeyde kesilir. </li><li> Bölümler daha fazla boyama, immünhistokimyasal boyama ya da belirtildiği gibi diğer testler için cam slayt üzerinde toplanır. Bölümler montaj için kullanılacak slayt türü de dahil olmak üzere bu testleri için protokolleri farklılık gösterebilir. Genellikle immün kaplı slaytlar immün adımları sırasında kayan ve slaytlar bölümlerini kaybı önlemek için kullanılır. </li></ol> (Alfabetik sırayla) kullanılan kısaltmalar: CISH, in-situ hibridizasyon testleri kromojenik; FISH, Floresan in situ hibridizasyon testleri; FFPE, formalin ile fikse parafine gömülmüş; ince iğne aspirasyon biyopsisi, ince iğne aspirasyon, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, sıvı bazlı sitoloji; PCR Polimeraz zincir reaksiyonu; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. hücre blok yapı Shidham protokol tarafından hazırlanmış. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Shidham protokol LBC örnek hücre blok hazırlamak için farklı adımlar özeti. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 muz soyma AV-marker hazırlanması. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 ve AV-işaretleyici ve bölümlerin hücre bloklarının karşılaştırılması. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 AV-damgalı olan ve olmayan hücre blok bölümleri hücresellik karşılaştırılması.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

Hücre blokları çeşitli sitolojisinde (1) değerlendirilmesi için değerli bir araç. En önemlisi, örnek mimari detaylara ek olarak, hücre bloklarının gibi immünsitokimya gibi yardımcı çalışmalar, kromojenik / floresan in-situ hibridizasyon testleri (FISH / CISH) ve in-situ PCR değerlendirilmesi için izin verir. Hücre blok hazırlanması için çeşitli yöntemler açıklanmıştır. Ancak, bunların çoğu nispeten birçok hücreleri içeren ve doku FNA aspiratlarda gibi microfragments ve seröz efüzyonlar (1,3,4,5) gibi bazı sıvılar ile non-jinekolojik sitoloji örnekleri için uygundur. Hücre bloklarının öncelikle immünositokimyasal değerlendirilmesi için bir fırsat sağladığı için, onların işleme tercihen formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) dokuları ile benzer olmalıdır. Sonuçta hücre blok bölümden immünositokimyasal değerlendirmesinden sonra elde edilen sonuçlar bu FFPE doku kesitlerinde ağırlıklı yayınlanan literatür ile karşılaştırıldı. Protokol herhangi bir değişikliğin potansiyel uzlaşma ve farklı fiksatif ve diğer rutin FFPE için kullanılan daha reaktif dizileri ile işlenmiş hücre bloklarının elde edilen sonuçların geçerliliğini geçersiz. Bazı ticari teknikleri, diğer fiksatif-reaktif maruz maruz kalma bir protokol ile işleme dezavantajı olabilir. Hücre blok hazırlanması, tortu ve doku parçaları önemli bir miktarı ile örnekler için çeşitli yöntemler mevcuttur. Prensip olarak, konsantre sedimanlar bazı jel veya pıhtılaşma prensibi tarafından desteklenmektedir. Manevra düğmesine sonra cerrahi patoloji örneklerinde / biyopsileri gibi işlendikten sonra parafine gömüldü. Kullanılan jeller, jelatin, agar, fibrinojen / plazma trombin ve diğer ticari jeller gibi HG içerir. Konsantrasyon yöntemleri, çeşitli tipte membran boyunca hücreler santrifüj tarafından tortu basit peletleme konsantrasyonu değişir. Örnekler şunlardır: Milipore, collodin (Celloidin) torba veya cam slayt (1) sitoloji smear hücreleri kazıma. Ayrıca jeller agar ve jelatin farklı kombinasyonları deneyerek çeşitli değerlendirildi. Kombinasyonların hiçbiri, katılaşmış jel kolayca manevra diski tek parça halinde numune gömülü hücreler elde etmek için bir firma yeterince tutarlılık elde etti. HG uygun tutarlılık gösterdi ve tecrübemizi HG hücre blok bölümlerde immün sonuç mükemmel olmuştur. Yukarıda da belirtildiği gibi servikovajinal sitoloji için Sıvı bazlı sitoloji (LBC) örnekleri Jinekolojik olmayan örneklerin daha az hücresel. Jinekolojik LBC örneklerin yanı sıra, ağırlıklı olarak bireysel servikovajinal mukoza dağınık eksfolyatif yüzeysel hücreler içeriyor. Bu nedenle, hücre bloğu bölümleri içinde uygun hücresellik özel bir yaklaşım olmadan elde edilebilir. Bu tek başına blok hücresel bileşenleri dağınık olarak bölüm kesim sırasında histotechnologist görülen olması değil. Hücrelerin bölümlerde görünen başlatmak hangi düzeyi ya çoğu hücremizde düzeyini geçmiş kesim tarafından ya da değil, takdir olarak değil edebilir ve atlanabilir örnek hücreleri (Şekil 4) ile en yüksek konsantrasyon seviyesine yeterince derin kesme. Shidham protokol HG, orta ve geleneksel laboratuvar ekipmanları (2) (Şekil 2) gömme olarak kullanarak bu konuların her iki adres. Bu protokol, iki önemli özellikleri (Şekil 1) Aşağıdaki içerir: <ol><li> Konsantrasyon ve hücre bloğu (Şekil 5) kesim yüzeyine paralel ve bitişik dar bir düzlemde tek tek dağılmış hücreleri uyum. </li><li> Tabelasını olarak bir deniz feneri gibi koyu AV-işaretleyici dahil edilmesi. Bu aşağıdaki özelliklere ulaşmak için kritik öneme sahiptir: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Belirlenmesi ve hücreleri hücre blokta yoğunlaştığı hangi düzeyde izlenmesi koyu renkli tabelasını hücre bloğu içinde tek tek dağılmış hücreleri (Şekil 4) yer olması bekleniyor hangi maruziyet düzeyi vurgulamaktadır. Engeller (seviye geçmiş en hücreleri ile kesme) veya hücre bloğu kırarak (örnek hücrelerinin yüksek konsantrasyon seviyesine yeterince derin kesme) ve en yüksek konsantrasyon ile ilgili hücre bloğunda seviyesinden bölümlerin seçimine izin kesmesini hücre. </li><li> Bölümlerde koyu renkli tabelasını da aynı hücrelerden farklı slaytlar hücre bloğu (Şekil 4) farklı seri bölümlerde araştırma ve tanımlamak için bir referans noktası olarak hizmet vermektedir. Yorumlanması ve SCIP yaklaşımı özellikle hücrelerin immunoprofile aynı hücrelerin farklı bölümler (6,7) takip koordinat özelliklerini değerlendirirken Bu kritik. </li></ol></li></ol> Rağmen our protokolü standardize edilmiş ve sıvı bazlı servikal sitoloji örnekleri için bildirilen, aynı zamanda efüzyon sıvılar, ince iğne aspirasyon biyopsisi, manşonlarla, kist içeriği vs gibi diğer birçok Jinekolojik olmayan örneklerin yanı sıra tanısal verimi artırmak için kullanılan olabilir AV marker geliştirilmiş kolaylaştırmak Bu örneklerin hücre blok bölümden immünohistokimyasal değerlendirme sırasında SCIP yaklaşım uygulama. Gömme orta ilgili adımları uygun değişiklikleri ile diğer reaktifler tarafından değiştirilebilir. HG, oda sıcaklığında (1) Trombin tarafından jel plazma (Fibrinojen) tarafından değiştirilebilir.

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

Bu video için Shidham tek tek dağılmış hücreleri ve küçük hücre grupları içeren sıvı bazlı servikovajinal sitolojisinde hücre bloklarının hazırlanması yöntemi göstermektedir. Bu teknik, geleneksel laboratuvar ekipmanları ile HistoGel (Thermo Scientific) kullanır. Hücre blok bölümlerinin kullanımı, non-jinekolojik sitoloji değerlendirme için değerli bir yardımcı araçtır. Lezyonun mimarisi de dahil olmak üzere ek morfolojik örnek ayrıntılı çalışma sitopatolog sağlar. En önemlisi, in-situ hibridizasyon testleri (FISH / CISH) ve in-situ polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi immünsitokimya gibi yan çalışmaların değerlendirilmesi için izin verir. Geleneksel hücre blok hazırlama teknikleri, genellikle vücut sıvısı efüzyonlar ve ince iğne aspirasyon biyopsileri, çoğunlukla jinekolojik olmayan sitolojisinde uygulanır olmuştur. Sıvı bazlı servikovajinal örneklerinde birçok bireysel dağınık hücreleri ile bunların non-jinekolojik bir muadillerine göre nispeten daha az hücresel. Bu nedenle, hücre blok kesimleri içinde yeterli hücresellik başarmak zordur. Buna ek olarak, blok kesit histotechnologist hücrelerin en yüksek konsantrasyon hangi düzeyde görselleştirmek. Bu nedenle, uygun seviyeye bölümlerde test için cam slaytlar aktarılacak seçilebilir hangi izlemek için zordur. Sonuç olarak, ya geçmişte kesme veya yeterince derin kesim tarafından ilgi hücreler ile hücre bloğu alanı, cevapsız olabilir. Shidham yöntemi için geçerli protokol, bu sorunları giderir. Bu protokol standart ve jinekolojik sıvı bazlı sitoloji örneklerinde için rapor olmasına rağmen, efüzyon sıvılar için hücre blok bölümlerde tanı malzeme kalitesi, ince iğne aspirasyon biyopsisi, manşonlarla, kist içeriği vb gibi Jinekolojik olmayan örneklerin de uygulanabilir olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells at JoVE.com

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Tek tek dağılmış hücreleri ve küçük hücre grupları içeren sitolojisinde AV-işaretleyici ile hücre bloklarının hazırlanması için Shidham yöntemi.

Bireysel Az hücreler baskın Sitoloji Numune Cell Block Hazırlama

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

cell-block-preparation-from-cytology-specimen-with-predominance

Research

JoVE Journal

Biology

73.0K Görüntüleme.  University of Wisconsin - Milwaukee. Tek tek dağılmış hücreleri ve küçük hücre grupları içeren sitolojisinde AV-işaretleyici ile hücre bloklarının hazırlanması için Shidham yöntemi.

Video: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

Donmuş Hücreler itibaren Kültür: İnsan Embriyonik kök hücrelerin

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Biyoloji

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Fare Dalak gentleMACS Dissociator Tek Hücreli Cezalar hazırlanması

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...