Bu yazıda anlatılan çalışma Patrick F. Taylor Vakfı fon ile mümkün olmuştur.

1.. Yapışık Hücrelerin kromozom Hasat <ol><li> Standard protokol <ol><li> Belirli bir hücre kültürü koşullarına göre hücreler büyür. Hücreler logaritmik fazı (% 80 kaynaşma) ulaştığı zaman, hücre kültürü şişesine Colcemid 10 ul / ml. 2 x 10 6 hücre bir minimum tavsiye edilir. </li><li> 45 dakika boyunca bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. Steril bir pipet kullanılarak, 15 ml konik bir tüp içine hücrelerden ortam aktarın. Kenara koyun. </li><li> Yavaşça şişeye HBSS Tampon 2 ml ekleyerek hücreleri yıkayın. Girdap tampon ve daha sonra bir pipet kullanılarak çıkarılabilir. Atın. </li><li> Bu, şişenin tüm yüzeyini kaplar sağlanması, tripsin 1 ml ilave edilir. Sadece yaklaşık 2 dakika boyunca tripsin hücreleri bırakın. Hücrelerin çoğunun müstakil sonra, geri hücreler üzerine konik bir tüp içinde ortam pipetle. </li><li> 15 ml konik tüp içine 10 ml alikotları hücre süspansiyonu aktarın.10 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj. Süpernatantı ve pelet tekrar süspansiyon. </li><li> Konik bir tüp içinde kalan topak 37 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış olan 0.075 M KCI 10 ml ilave edilir. KCI ve hücrelerin karışımı orta hızda vorteks tüp. </li><li> 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. 25 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüje Ve tekrar süspansiyon pelet (yaklaşık 0.5 ml kalmayıncaya kadar) süpernatant kaldırmak. </li><li> Vorteks edilirken hücrelere: dikkatle taze Carnoy fiksatif 5 ml (buzlu asetik asit, metanol içinde 3:1 oranında) ekleyin. Daha sonra 10 ml &#39;lik bir toplam için girdap olmayan sabitleyici daha 5 ml ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj. Süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Her tüpe fiksatif 5 ml. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj. Süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Her tüpe fiksatif 5 ml. Hücreler, şimdiye kadar, bir yıl boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> Protokol Modifikasyon: Kromozom harvestilenfoblastoid hücre çizgilerinin ng <ol><li> Belirli bir hücre kültürü koşullarına göre hücreler büyür. (Kullanım hücreleri kültüre edildikten miktarı için uygun bir balon). Hücreler logaritmik fazı (hücre bölünmüş olan yaklaşık 2 gün sonra) ulaştığı zaman, hücre kültürü şişesine Colcemid 10 ul / ml. </li></ol></li><li> Protokol Modifikasyon: kandan kromozom hasat Fitohemagglutinin (PHA), kırmızı barbunya elde edilen bir lektin, bir insan T-hücreleri 16 için güçlü bir mitojen olduğu. 72 saat kültüre PHA eklenmesinden sonra, hücrelerin yaklaşık% 45 S aşamasında bulunmaktadır. Bu durum, zirve mitotik faaliyet gösteren ve kromozom çalışmaları için hasat için hangi uygun bir yer. B hücreleri 17,18 analiz edilirken pok otu (1-10 ug / ml) gibi diğer mitojenlerdir kullanılabilmektedir. <ol><li> Yeşil bir üst sodyum heparin bir tüp içinde, bütün haldeki kan, en az 1 ml toplayın. Toplandıktan sonra 3 gün içinde kullanın. RT un saklayınız kankullanıma hazır til. </li><li> Kısım L-glutamin (% 20 fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 fungizon ve% 1 PHA) ihtiva eden RPMI komple ortam içinde, 10 ml tam kan, 0.25 ml. % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de kültür. </li></ol></li><li> Protokol Modifikasyon: Kemik iliğinden kromozom hasat Kromozomal anormal klon gözlem lösemi belirli bir türü için tanısal olabilecek kemik iliği üzerine sitogenetik analiz Birçok malign hematolojik hastalıklarda yararlı. Kromozom çalışmalar aynı zamanda blast krizi ve tedaviye cevabın başlangıcı olarak hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için kullanılır. Kemik iliği hücreleri aktif bölünen yana, hiçbir mitojenle stimülasyon gereklidir 9,19 olduğunu. Akut lösemiler için 24 ve 48 saat kültürleri de kurulur. <ol><li> Yeşil bir üst sodyum heparin tüpte kemik iliği en az 1 ml toplayın. L-glutamin (2 içeren RPMI tam ortam, 10 ml kemik iliği kısım 0.25 mi0% fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 fungizon). % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de kültür. </li></ol></li></ol> 2. Slayt Hazırlama ve Katı Boyama Temsili bir slayt hızlı bir değerlendirmesi gibi G-bantlama, FISH, CGH, ya da SKY gibi başka işlemlere devam etmeden önce hasat kalitesi hakkında bilgi verecektir. Bazı laboratuvarlar katı leke hızlı hasat ve kromozom değerlendirilmesi için hücreleri tercih ederim. Alternatif olarak, bir faz kontrast mikroskop Bu analiz için kullanılabilir. Slaytlar iyi nem yaklaşık% 50 olduğu zaman hazırlanmış ve çevre sıcaklığı (20-25 ° C) gerçekleştirilmiştir. <ol><li> 25 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüje hücreleri Sadece 0,3-0,5 ml kalmayıncaya kadar süpernatant kaldırmak. </li><li> Sonra yavaşça 45 ° &#39;lik bir açıda eğilmiş ve bir süspansiyon sağlayan bir slayt üzerine yaklaşık 2 arasında, bir mesafeden hücre süspansiyonu topak, pipet üç damla yeniden süspanseslaytta rulo. Slayt taze Carnoy Fiksatif bir büyük damla ekleyin. </li><li> Bir kağıt havlu üzerine slayt arka kurulayın ve ardından en az 10 dakika boyunca kuru dışarı slayt oturun. Slayt tamamen kuru olmalıdır. </li><li> Taze Giemsa Boyama Çözüm (Gurr Tampon ve Giemsa Leke 3:1 oranı) hazırlayın. Bir boyama rafa slaytlar yerleştirin. Giemsa boyama çözüm tüm slayt örtün. Kayar parçalar 5 dakika boyunca boyama çözeltisi içinde kalmasına izin verin. , Distile su ile durulayın slaytlar drenaj ve kurumaya bırakın. </li><li> 4 Permount damla ve slayta bir kapak kayma ekleyin. Emin coverslip altında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Fazla Permount bir kağıt havlu ile temizlenebilir. </li><li> 10X ve 100X büyütme altında bir ışık mikroskobu ile hücrelerin analiz. Metafaz hücreleri bol ve iyi yayılmış ise, kalan slaytlar diğer deneysel işlemler için kullanılabilir. </li></ol> 3. G-Bantlama Tripsin ve Giemsa (GTG) kullanma &lt;p&gt; Tripsin daha fazla transkripsiyonel aktivite ile elde edilen DNA bölgelerde ökromatik histonları denatüre bir proteolitik enzimdir. Giemsa boyama takiben, bu bölgeler ışık bantları gibi görünecektir. Az ya da hiç transkripsiyon aktivitesi (heterokromatin) ile son derece yoğun kromatin tripsin ile korunmuş olan histon büyük bir bölümü olacaktır ve bu nedenle Giemsa lekelemesi aşağıdaki koyu leke olacaktır. Başlangıçta G-bant için bir slayt koşullarını izlemek ve gerekirse daha sonra slaytlar için tripsin zamanlaması ayarlamak için gereklidir. <ol><li> 4 Coplin kavanoz için aşağıdaki çözümleri ekleyin. Jar 1. 1x HBSS = 30 ml 10x tripsin 4 ml (% 0.5) 1x HBSS&#39;nin Jar # 2 = 50 ml Jar # 3 = 1 x 45 ml HBSS ve fetal sığır serumu, 5 ml 1x HBSS&#39;nin Jar # 4 = 50 ml </li><li> 5 saniye için Jar # 1 her slayt, Jar # 2 hızlı durulama batırın, en az 30 saniye boyunca Jar # 3 Kavanoz 4. hızlı durulama her slayt bırakın sonra slaytlar kurumasını bekleyin. </li><li> Fres hazırlayınh Giemsa Boyama Çözüm (Gurr Tampon ve Giemsa Leke 3:1 oranı). Bir boyama rafa slaytlar yerleştirin. Giemsa boyama çözüm tüm slayt örtün. Kayar parçalar 5 dakika boyunca boyama çözeltisi içinde kalmasına izin verin. </li><li> Bu lekeli aynı sırayla damıtılmış su içinde slaytlar durulayın. Slaytlar için yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin. Slayt tamamen kuru olmalıdır. </li><li> 4 Permount damla ve slayta bir kapak kayma ekleyin. Emin coverslip altında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Fazla Permount bir kağıt havlu ile temizlenebilir. </li><li> 10X ve 100X büyütme altında bir ışık mikroskobu ile hücrelerin analiz. Ilk slayt sonuçlarına göre slaytların kalanı tripsin zamanlamasını ayarlayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li><li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics in Medicine: 7th Edition. , 76 (2007).</li><li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages.">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li><li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions.">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li><li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stillbirth+classification&#8212;Developing+an+international+consensus+for+research:+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop.">Stillbirth classification&#8212;Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li><li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+congenital+heart+defects:+Current+knowledge.">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li><li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Syndrome:+Trisomy+21..">Down Syndrome: Trisomy 21..</a> PubMed Health. , (2010).</li><li>Cin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li><li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics.">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li><li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation.">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li><li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells.">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li><li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q.">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li><li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells.">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li><li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis.">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li><li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+cytogenetics:+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology.">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis.">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li><li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , (1997).</li><li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J., McClatchey, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders.">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. , 658-685 (2002).</li><li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7R&#945;+deficiency+in+p53(null)+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis.">IL-7R&#945; deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li><li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--&gt;qter+due+to+paternal+Y;+16+translocation.">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22--&gt;qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li><li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements.">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li><li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+conventional+cytogenetics+(G-banding),+comparative+genomic+hybridization+(CGH)+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+(i-FISH)+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia.">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li></ol>

Çeşitli insan elde edilen hücre tipleri, Rhesus macaque maymunlarının, sıçanlar ve fareler dahil olmak üzere çeşitli 11,20-22 organizmaların hücrelerinden kromozom izolasyonu için, bu prosedür kullanılmıştır var. Standart protokol sağlanır, ancak bazı önemli adımlar ve değişkenler, bu çeşitli hücre türleri için ayarlanması gerekebilir. Birkaç belirli adımlar kromozomal hazırlanması ve sonuçların olası en iyi kaliteyi sağlamak için G-bantlama hem de çok önemlidir. Tahl...

Kromozom analizi kromozom istikrarsızlığı ve genetik bozukluklar ve malignite 1,2,8,9 giden düzenlenmeleri teşhis etmek için dünya çapında kullanılan geleneksel bir tekniktir. Ayrıca, yapısal ve kanser kaynaklı genetik anormalliklerin teşhis ve araştırma için daha yüksek bir çözünürlük gibi floresan in situ hibridizasyon (FISH) sitogenetik olarak klasik prosedürler ve moleküler sitogenetik metodolojileri kombinasyonu, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) ile elde edilebilir ve spektral karyotip (SKY) 14,15. Daha yakın zamanda, bu teknikler, kök hücre araştırma ile ilgili kromozom istikrarsızlık değerlendirilmesi için kullanılmıştır. Bu tür uzun süreli kültür embriyonik hücreler (ES) ve çeşitli organizmaların erişkin kök hücrelerinin anöploidinin olarak kromozomlarda anormallikler birden laboratuarlar tarafından bildirilmiştir. Yeni kanıtlar, bazı hücre hatları doğal kromozom instabilitenin birlik daha eğilimli olduğunu desteklerne olursa olsun kültür koşulları bağdaştırılır. Kurulması ve / veya insan, fare veya Rhesus kök hücre hatları muhafaza, bu nedenle, kromozom analizi, kalite kontrol işleminin bir parçası olarak tavsiye edilir. Birçok rapor, kültür 10-13 kök hücreleri ve habis hücrelerinin veya çeşitli organizmaların kromozomal stabilitesini izlemek için rutin ve moleküler sitogenetik kullanımında artan bir ilgi açıklar. Bu protokoller giderek onların kültürlü hücrelerin 13 hızlı kromozomal değerlendirilmesi için nongenetik laboratuvarlar tarafından kullanılmaktadır. Çeşitli organizmalardan elde edilen klinik ve araştırma amaçlı ve hücreler hem de uygulanabilir çeşitli hücre tipleri, kromozom hazırlanmasına yönelik temel prosedürleri sunuyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">KaryoMAX Colcemid</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:145px;">15212-012</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin EDTA 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Tablets &#34;GURR&#34;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10580-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Geimsa Stain</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3250-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>6700130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Krackeler Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>11-9508-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromosome preparation from cultured cells

Kromozom (sitogenetik) analizi yaygın kromozom istikrarsızlık tespiti için kullanılır. G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan gibi moleküler teknikler ile, ardından, bu deney, bir veya daha fazla kromozom içeren genom ve yeniden düzenleme bölümlerinin kar ya da zarar içeren sapmalarını için tek tek hücrelerin analiz etmek için güçlü bir yeteneği vardır. İnsanlarda, kromozom anormallikleri yaklaşık 1 160 canlı doğumda 1,2, tüm düşüklerin% 60-80 meydana 3,4, ölü doğumların% 10 2,5, konjenital kalp hastalığı 6,% 3-6 olan bireylerin% 13 infertilite vakalarının 2, ve gelişimsel gecikme ve doğum kusurları 7 ile birçok hastada. Klonal kromozomal anomalilerin gözlemler hem tanısal ve prognostik önemi 8,9 olduğu gösterilmiştir gibi habis sitogenetik analizi rutin olarak, araştırmacılar ve klinisyenler tarafından kullanılmaktadır.60; Kromozom izolasyon gen tedavisi için çok değerli olduğunu ve insan olmayan primatlarda ve kemirgenler 10-13 gibi organizmaların kök hücre araştırmaları. Kromozomlar kan lenfositlerinin, deri fibroblastları, Amniyon sıvısı, plasenta, kemik iliği ve tümör örneklerinde de dahil olmak üzere, canlı dokular, hücreler izole edilebilir. En çok yoğunlaşmış ve bu nedenle daha net görünür olduğunda Kromozomlar, mitoz metafaz aşamasında analiz edilir. Kromozom izolasyon tekniği ilk adımı anafaz sonraki aşamaya geçmeden gelen hücreleri önlemek için Colcemid ile inkübasyon yoluyla iğ liflerin bozulmasını içerir. Hücreler daha sonra, hipotonik bir solüsyon ile muamele edildi ve Carnoy sabitleyici ile şişmiş bir halde muhafaza edilmektedir. Hücreler daha sonra slaytlar üzerine bırakılır ve daha sonra çeşitli prosedürler için kullanılabilir. G-bantlama karakteristik açık ve koyu renkli bantlar oluşturmak için Giemsa ile boyanarak, ardından tripsin muamele edilmesini içerir. Aynı prkromozom izole etmek ocedure örneğin in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) ve spektral karyotipleme (gökyüzü) 14,15 gibi işlemler için hücrelerin hazırlanması için kullanılabilir.

Yüksek kaliteli metafaz yayılır kromozom analizi için gereklidir. Başarılı bir deney de yayılmış ve uygun kromozom morfolojisi olan kromozom verir. Düzgün G-bantlı kromozomlar karakteristik ışık ve karanlık bantlama desenler içerir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Şekil 1. Kromozomları normal uzunlukta olduğu b...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Preparation From Cultured Cells at JoVE.com

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Kromozomlar gibi lenfositler ya da deri fibroblast gibi canlı hücrelerden izole edilir ve insan ya da fare gibi organizmalardan elde edilebilir. Bu kromozom preparatları ayrıca rutin G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), ve spektral karyotip (SKY) gibi moleküler sitogenetik işlemler için kullanılabilir.

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

chromosome-preparation-from-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

80.7K Görüntüleme.  Louisiana State University Health Science Center.  Kromozomlar gibi lenfositler ya da deri fibroblast gibi canlı hücrelerden izole edilir ve insan ya da fare gibi organizmalardan elde edilebilir. Bu kromozom preparatları ayrıca rutin G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), ve spektral karyotip (SKY) gibi moleküler sitogenetik işlemler için kullanılabilir. 

Video: Chromosome Preparation From Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Doku ve Hücre Sayım ve Canlılık Belirlenmesi

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Biyoloji

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups. This technique uses HistoGel (Thermo Scientific) with conventional laboratory equipment.
The use of cell block sections is a valuable ancillary tool for evaluation of non-gynecologic cytology. They enable the cytopathologist to study additional morphologic specimen detail including the architecture of the lesion. Most importantly, they allow for the evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ polymerase chain reaction (PCR). Traditional cell block preparation techniques have mostly been applied to non-gynecologic cytology specimens, typically for body fluid effusions and fine needle aspiration biopsies.
Liquid based cervicovaginal specimens are relatively less cellular than their non-gynecologic counterparts with many individual scattered cells. Because of this, adequate cellularity within the cell block sections is difficult to achieve. In addition, the histotechnologist sectioning the block cannot visualize the level at which the cells are at the highest concentration. Therefore, it is difficult to monitor the appropriate level at which sections can be selected to be transferred to the glass slides for testing. As a result, the area of the cell block with the cells of interest may be missed, either by cutting past or not cutting deep enough. Current protocol for Shidham's method addresses these issues. Although this protocol is standardized and reported for gynecologic liquid based cytology specimens, it can also be applied to non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc for improved quality of diagnostic material in cell block sections.

Shidham's method for preparation of cell blocks with AV-marker from cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups.

Bireysel Az hücreler baskın Sitoloji Numune Cell Block Hazırlama

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Bitkilerde FISH için uygun bir Hızlı Hava kuru Damlama Kromozom Hazırlama Yöntemi

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler