Name: chromosome preparation from cultured cells
Uploaded: 2014-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Preparation From Cultured Cells at JoVE.com

Bu yazıda anlatılan çalışma Patrick F. Taylor Vakfı fon ile mümkün olmuştur.

1.. Yapışık Hücrelerin kromozom Hasat <ol><li> Standard protokol <ol><li> Belirli bir hücre kültürü koşullarına göre hücreler büyür. Hücreler logaritmik fazı (% 80 kaynaşma) ulaştığı zaman, hücre kültürü şişesine Colcemid 10 ul / ml. 2 x 10 6 hücre bir minimum tavsiye edilir. </li><li> 45 dakika boyunca bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. Steril bir pipet kullanılarak, 15 ml konik bir tüp içine hücrelerden ortam aktarın. Kenara koyun. </li><li> Yavaşça şişeye HBSS Tampon 2 ml ekleyerek hücreleri yıkayın. Girdap tampon ve daha sonra bir pipet kullanılarak çıkarılabilir. Atın. </li><li> Bu, şişenin tüm yüzeyini kaplar sağlanması, tripsin 1 ml ilave edilir. Sadece yaklaşık 2 dakika boyunca tripsin hücreleri bırakın. Hücrelerin çoğunun müstakil sonra, geri hücreler üzerine konik bir tüp içinde ortam pipetle. </li><li> 15 ml konik tüp içine 10 ml alikotları hücre süspansiyonu aktarın.10 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj. Süpernatantı ve pelet tekrar süspansiyon. </li><li> Konik bir tüp içinde kalan topak 37 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış olan 0.075 M KCI 10 ml ilave edilir. KCI ve hücrelerin karışımı orta hızda vorteks tüp. </li><li> 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. 25 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüje Ve tekrar süspansiyon pelet (yaklaşık 0.5 ml kalmayıncaya kadar) süpernatant kaldırmak. </li><li> Vorteks edilirken hücrelere: dikkatle taze Carnoy fiksatif 5 ml (buzlu asetik asit, metanol içinde 3:1 oranında) ekleyin. Daha sonra 10 ml &#39;lik bir toplam için girdap olmayan sabitleyici daha 5 ml ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj. Süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Her tüpe fiksatif 5 ml. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj. Süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Her tüpe fiksatif 5 ml. Hücreler, şimdiye kadar, bir yıl boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> Protokol Modifikasyon: Kromozom harvestilenfoblastoid hücre çizgilerinin ng <ol><li> Belirli bir hücre kültürü koşullarına göre hücreler büyür. (Kullanım hücreleri kültüre edildikten miktarı için uygun bir balon). Hücreler logaritmik fazı (hücre bölünmüş olan yaklaşık 2 gün sonra) ulaştığı zaman, hücre kültürü şişesine Colcemid 10 ul / ml. </li></ol></li><li> Protokol Modifikasyon: kandan kromozom hasat Fitohemagglutinin (PHA), kırmızı barbunya elde edilen bir lektin, bir insan T-hücreleri 16 için güçlü bir mitojen olduğu. 72 saat kültüre PHA eklenmesinden sonra, hücrelerin yaklaşık% 45 S aşamasında bulunmaktadır. Bu durum, zirve mitotik faaliyet gösteren ve kromozom çalışmaları için hasat için hangi uygun bir yer. B hücreleri 17,18 analiz edilirken pok otu (1-10 ug / ml) gibi diğer mitojenlerdir kullanılabilmektedir. <ol><li> Yeşil bir üst sodyum heparin bir tüp içinde, bütün haldeki kan, en az 1 ml toplayın. Toplandıktan sonra 3 gün içinde kullanın. RT un saklayınız kankullanıma hazır til. </li><li> Kısım L-glutamin (% 20 fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 fungizon ve% 1 PHA) ihtiva eden RPMI komple ortam içinde, 10 ml tam kan, 0.25 ml. % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de kültür. </li></ol></li><li> Protokol Modifikasyon: Kemik iliğinden kromozom hasat Kromozomal anormal klon gözlem lösemi belirli bir türü için tanısal olabilecek kemik iliği üzerine sitogenetik analiz Birçok malign hematolojik hastalıklarda yararlı. Kromozom çalışmalar aynı zamanda blast krizi ve tedaviye cevabın başlangıcı olarak hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için kullanılır. Kemik iliği hücreleri aktif bölünen yana, hiçbir mitojenle stimülasyon gereklidir 9,19 olduğunu. Akut lösemiler için 24 ve 48 saat kültürleri de kurulur. <ol><li> Yeşil bir üst sodyum heparin tüpte kemik iliği en az 1 ml toplayın. L-glutamin (2 içeren RPMI tam ortam, 10 ml kemik iliği kısım 0.25 mi0% fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 fungizon). % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de kültür. </li></ol></li></ol> 2. Slayt Hazırlama ve Katı Boyama Temsili bir slayt hızlı bir değerlendirmesi gibi G-bantlama, FISH, CGH, ya da SKY gibi başka işlemlere devam etmeden önce hasat kalitesi hakkında bilgi verecektir. Bazı laboratuvarlar katı leke hızlı hasat ve kromozom değerlendirilmesi için hücreleri tercih ederim. Alternatif olarak, bir faz kontrast mikroskop Bu analiz için kullanılabilir. Slaytlar iyi nem yaklaşık% 50 olduğu zaman hazırlanmış ve çevre sıcaklığı (20-25 ° C) gerçekleştirilmiştir. <ol><li> 25 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüje hücreleri Sadece 0,3-0,5 ml kalmayıncaya kadar süpernatant kaldırmak. </li><li> Sonra yavaşça 45 ° &#39;lik bir açıda eğilmiş ve bir süspansiyon sağlayan bir slayt üzerine yaklaşık 2 arasında, bir mesafeden hücre süspansiyonu topak, pipet üç damla yeniden süspanseslaytta rulo. Slayt taze Carnoy Fiksatif bir büyük damla ekleyin. </li><li> Bir kağıt havlu üzerine slayt arka kurulayın ve ardından en az 10 dakika boyunca kuru dışarı slayt oturun. Slayt tamamen kuru olmalıdır. </li><li> Taze Giemsa Boyama Çözüm (Gurr Tampon ve Giemsa Leke 3:1 oranı) hazırlayın. Bir boyama rafa slaytlar yerleştirin. Giemsa boyama çözüm tüm slayt örtün. Kayar parçalar 5 dakika boyunca boyama çözeltisi içinde kalmasına izin verin. , Distile su ile durulayın slaytlar drenaj ve kurumaya bırakın. </li><li> 4 Permount damla ve slayta bir kapak kayma ekleyin. Emin coverslip altında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Fazla Permount bir kağıt havlu ile temizlenebilir. </li><li> 10X ve 100X büyütme altında bir ışık mikroskobu ile hücrelerin analiz. Metafaz hücreleri bol ve iyi yayılmış ise, kalan slaytlar diğer deneysel işlemler için kullanılabilir. </li></ol> 3. G-Bantlama Tripsin ve Giemsa (GTG) kullanma &lt;p&gt; Tripsin daha fazla transkripsiyonel aktivite ile elde edilen DNA bölgelerde ökromatik histonları denatüre bir proteolitik enzimdir. Giemsa boyama takiben, bu bölgeler ışık bantları gibi görünecektir. Az ya da hiç transkripsiyon aktivitesi (heterokromatin) ile son derece yoğun kromatin tripsin ile korunmuş olan histon büyük bir bölümü olacaktır ve bu nedenle Giemsa lekelemesi aşağıdaki koyu leke olacaktır. Başlangıçta G-bant için bir slayt koşullarını izlemek ve gerekirse daha sonra slaytlar için tripsin zamanlaması ayarlamak için gereklidir. <ol><li> 4 Coplin kavanoz için aşağıdaki çözümleri ekleyin. Jar 1. 1x HBSS = 30 ml 10x tripsin 4 ml (% 0.5) 1x HBSS&#39;nin Jar # 2 = 50 ml Jar # 3 = 1 x 45 ml HBSS ve fetal sığır serumu, 5 ml 1x HBSS&#39;nin Jar # 4 = 50 ml </li><li> 5 saniye için Jar # 1 her slayt, Jar # 2 hızlı durulama batırın, en az 30 saniye boyunca Jar # 3 Kavanoz 4. hızlı durulama her slayt bırakın sonra slaytlar kurumasını bekleyin. </li><li> Fres hazırlayınh Giemsa Boyama Çözüm (Gurr Tampon ve Giemsa Leke 3:1 oranı). Bir boyama rafa slaytlar yerleştirin. Giemsa boyama çözüm tüm slayt örtün. Kayar parçalar 5 dakika boyunca boyama çözeltisi içinde kalmasına izin verin. </li><li> Bu lekeli aynı sırayla damıtılmış su içinde slaytlar durulayın. Slaytlar için yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin. Slayt tamamen kuru olmalıdır. </li><li> 4 Permount damla ve slayta bir kapak kayma ekleyin. Emin coverslip altında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Fazla Permount bir kağıt havlu ile temizlenebilir. </li><li> 10X ve 100X büyütme altında bir ışık mikroskobu ile hücrelerin analiz. Ilk slayt sonuçlarına göre slaytların kalanı tripsin zamanlamasını ayarlayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li><li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics in Medicine: 7th Edition. , 76 (2007).</li><li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages.">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li><li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions.">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li><li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stillbirth+classification&#8212;Developing+an+international+consensus+for+research:+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop.">Stillbirth classification&#8212;Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li><li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+congenital+heart+defects:+Current+knowledge.">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li><li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Syndrome:+Trisomy+21..">Down Syndrome: Trisomy 21..</a> PubMed Health. , (2010).</li><li>Cin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li><li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics.">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li><li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation.">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li><li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells.">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li><li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q.">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li><li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells.">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li><li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis.">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li><li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+cytogenetics:+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology.">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis.">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li><li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , (1997).</li><li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J., McClatchey, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders.">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. , 658-685 (2002).</li><li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7R&#945;+deficiency+in+p53(null)+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis.">IL-7R&#945; deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li><li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--&gt;qter+due+to+paternal+Y;+16+translocation.">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22--&gt;qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li><li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements.">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li><li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+conventional+cytogenetics+(G-banding),+comparative+genomic+hybridization+(CGH)+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+(i-FISH)+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia.">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li></ol>

Çeşitli insan elde edilen hücre tipleri, Rhesus macaque maymunlarının, sıçanlar ve fareler dahil olmak üzere çeşitli 11,20-22 organizmaların hücrelerinden kromozom izolasyonu için, bu prosedür kullanılmıştır var. Standart protokol sağlanır, ancak bazı önemli adımlar ve değişkenler, bu çeşitli hücre türleri için ayarlanması gerekebilir. Birkaç belirli adımlar kromozomal hazırlanması ve sonuçların olası en iyi kaliteyi sağlamak için G-bantlama hem de çok önemlidir. Tahl...

Kromozom analizi kromozom istikrarsızlığı ve genetik bozukluklar ve malignite 1,2,8,9 giden düzenlenmeleri teşhis etmek için dünya çapında kullanılan geleneksel bir tekniktir. Ayrıca, yapısal ve kanser kaynaklı genetik anormalliklerin teşhis ve araştırma için daha yüksek bir çözünürlük gibi floresan in situ hibridizasyon (FISH) sitogenetik olarak klasik prosedürler ve moleküler sitogenetik metodolojileri kombinasyonu, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) ile elde edilebilir ve spektral karyotip (SKY) 14,15. Daha yakın zamanda, bu teknikler, kök hücre araştırma ile ilgili kromozom istikrarsızlık değerlendirilmesi için kullanılmıştır. Bu tür uzun süreli kültür embriyonik hücreler (ES) ve çeşitli organizmaların erişkin kök hücrelerinin anöploidinin olarak kromozomlarda anormallikler birden laboratuarlar tarafından bildirilmiştir. Yeni kanıtlar, bazı hücre hatları doğal kromozom instabilitenin birlik daha eğilimli olduğunu desteklerne olursa olsun kültür koşulları bağdaştırılır. Kurulması ve / veya insan, fare veya Rhesus kök hücre hatları muhafaza, bu nedenle, kromozom analizi, kalite kontrol işleminin bir parçası olarak tavsiye edilir. Birçok rapor, kültür 10-13 kök hücreleri ve habis hücrelerinin veya çeşitli organizmaların kromozomal stabilitesini izlemek için rutin ve moleküler sitogenetik kullanımında artan bir ilgi açıklar. Bu protokoller giderek onların kültürlü hücrelerin 13 hızlı kromozomal değerlendirilmesi için nongenetik laboratuvarlar tarafından kullanılmaktadır. Çeşitli organizmalardan elde edilen klinik ve araştırma amaçlı ve hücreler hem de uygulanabilir çeşitli hücre tipleri, kromozom hazırlanmasına yönelik temel prosedürleri sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Gibco</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Buffer</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin EDTA 10x</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Tablets &quot;GURR&quot;</td><td>Gibco</td><td>10580-013</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Stain</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3250-16</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>6700130</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Krackeler Scientific Inc.</td><td>11-9508-05</td><td></td></tr></tbody></table>

chromosome preparation from cultured cells

Kromozom (sitogenetik) analizi yaygın kromozom istikrarsızlık tespiti için kullanılır. G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan gibi moleküler teknikler ile, ardından, bu deney, bir veya daha fazla kromozom içeren genom ve yeniden düzenleme bölümlerinin kar ya da zarar içeren sapmalarını için tek tek hücrelerin analiz etmek için güçlü bir yeteneği vardır. İnsanlarda, kromozom anormallikleri yaklaşık 1 160 canlı doğumda 1,2, tüm düşüklerin% 60-80 meydana 3,4, ölü doğumların% 10 2,5, konjenital kalp hastalığı 6,% 3-6 olan bireylerin% 13 infertilite vakalarının 2, ve gelişimsel gecikme ve doğum kusurları 7 ile birçok hastada. Klonal kromozomal anomalilerin gözlemler hem tanısal ve prognostik önemi 8,9 olduğu gösterilmiştir gibi habis sitogenetik analizi rutin olarak, araştırmacılar ve klinisyenler tarafından kullanılmaktadır.60; Kromozom izolasyon gen tedavisi için çok değerli olduğunu ve insan olmayan primatlarda ve kemirgenler 10-13 gibi organizmaların kök hücre araştırmaları. Kromozomlar kan lenfositlerinin, deri fibroblastları, Amniyon sıvısı, plasenta, kemik iliği ve tümör örneklerinde de dahil olmak üzere, canlı dokular, hücreler izole edilebilir. En çok yoğunlaşmış ve bu nedenle daha net görünür olduğunda Kromozomlar, mitoz metafaz aşamasında analiz edilir. Kromozom izolasyon tekniği ilk adımı anafaz sonraki aşamaya geçmeden gelen hücreleri önlemek için Colcemid ile inkübasyon yoluyla iğ liflerin bozulmasını içerir. Hücreler daha sonra, hipotonik bir solüsyon ile muamele edildi ve Carnoy sabitleyici ile şişmiş bir halde muhafaza edilmektedir. Hücreler daha sonra slaytlar üzerine bırakılır ve daha sonra çeşitli prosedürler için kullanılabilir. G-bantlama karakteristik açık ve koyu renkli bantlar oluşturmak için Giemsa ile boyanarak, ardından tripsin muamele edilmesini içerir. Aynı prkromozom izole etmek ocedure örneğin in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) ve spektral karyotipleme (gökyüzü) 14,15 gibi işlemler için hücrelerin hazırlanması için kullanılabilir.

Yüksek kaliteli metafaz yayılır kromozom analizi için gereklidir. Başarılı bir deney de yayılmış ve uygun kromozom morfolojisi olan kromozom verir. Düzgün G-bantlı kromozomlar karakteristik ışık ve karanlık bantlama desenler içerir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Şekil 1. Kromozomları normal uzunlukta olduğu b...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Preparation From Cultured Cells at JoVE.com

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Kromozomlar gibi lenfositler ya da deri fibroblast gibi canlı hücrelerden izole edilir ve insan ya da fare gibi organizmalardan elde edilebilir. Bu kromozom preparatları ayrıca rutin G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), ve spektral karyotip (SKY) gibi moleküler sitogenetik işlemler için kullanılabilir.

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

chromosome-preparation-from-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

81.0K Görüntüleme.  Louisiana State University Health Science Center.  Kromozomlar gibi lenfositler ya da deri fibroblast gibi canlı hücrelerden izole edilir ve insan ya da fare gibi organizmalardan elde edilebilir. Bu kromozom preparatları ayrıca rutin G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), ve spektral karyotip (SKY) gibi moleküler sitogenetik işlemler için kullanılabilir. 

Video: Chromosome Preparation From Cultured Cells

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Sistem

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Genetik

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

Transforme İnsan Fibroblastlar gelen Proliferatif Tetraploid Hücreleri kurulması

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Gelişim Biyolojisi

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) is used to fix chromatin interactions. Then, chromatin digestion with a restriction enzyme and subsequent religation of fragment ends converts three-dimensional (3D) proximity into unique ligation products. Finally, after reversal of crosslinks, protein removal, and DNA isolation, DNA is sheared and prepared for high-throughput sequencing. The frequency of proximity ligation of pairs of loci is a measure of the frequency of their colocalization in three-dimensional space in a cell population.
A sequenced Hi-C library provides genome-wide information on interaction frequencies between all pairs of loci. The resolution and precision of Hi-C relies on efficient crosslinking that maintains chromatin contacts and frequent and uniform fragmentation of the chromatin. This paper describes an improved in situ Hi-C protocol, Hi-C 3.0, that increases the efficiency of crosslinking by combining two crosslinkers (formaldehyde [FA] and disuccinimidyl glutarate [DSG]), followed by finer digestion using two restriction enzymes (DpnII and DdeI). Hi-C 3.0 is a single protocol for the accurate quantification of genome folding features at smaller scales such as loops and topologically associating domains (TADs), as well as features at larger nucleus-wide scales such as compartments.

Hi-C 3.0 is an improved Hi-C protocol that combines formaldehyde and disuccinimidyl glutarate crosslinkers with a cocktail of DpnII and DdeI restriction enzymes to increase the signal-to-noise ratio and the resolution of chromatin interaction detection.

Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Biyoloji

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Bitkilerde FISH için uygun bir Hızlı Hava kuru Damlama Kromozom Hazırlama Yöntemi

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi