NIH hibe AI57159 (SCH) ve AI72346 (AMvO) tarafından desteklenmiştir. SCH Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırmacı.

Cam kapak kayma işlevsellik Füzyon tayininde kullanılan düzlemsel bilayeri dekstran sulu film desteklenmektedir. Dekstran düzlemsel bilayeri ve cam yüzeyi arasında boşluk gibi davranır. Bu cam yüzey takılıp haline membran bileşenleri önler ve aynı zamanda bir virüs parçacık içeriği füzyon üzerine kaçmak için yer sağlar. Cam lamelleri bize kimyasal bağ dekstran cam (Elender, ve ark 1996) sağlar silan epoksi ile tedavi yoluyla Fonksiyonlu. <ol><li> Seramik boyama raf 25 mm lamelleri düzenleyin ve bir kavanoz veya behere rafa yerleştirin. </li><li> Konteyner% 10 laboratuvar notu züccaciye deterjan solüsyonu ile doldurun. 30 dakika boyunca ultrasonik temiz kap yerleştirin. </li><li> Deiyonize su ile, konteyner ve kapak rafı ve dolum 1M postassium hidroksit ile durulayın. Başka bir 30 dakika banyo sonikatör konteyner dönün. </li><li> Aseton ve etanol kullanılarak bu temizlik işlemi tekrarlayın. </li><li> Su ve kuru coverlips durulayın. </li><li> Son olarak, üç dakikada bir oksijen plazma striptizci lamelleri temizleyin. </li><li> Son temizlik adım, cam aşağıdaki silanization adımları düzgün hidrofilik ve reaktif, yüzey oksitler. </li><li> Isopropanol 3-glycidoxypropyltrimethoxy silan% 0.2 solüsyon hazırlayın. Beş dakika için bu çözüm lamelleri bırakın. </li><li> Silan çözüm atın ve isopropanol lamelleri birkaç kez yıkayın. </li><li> Lamelleri silan bir tabaka ile kaplıdır, ancak cam kovalent bağ silan izin tedavi edilmelidir. Bir saat boyunca 80 santigrat dereceye ayarlanmış fırında lamelleri yerleştirin. </li><li> Lamelleri kuruyan, dekstran 500 tartmak ve% 30 w / v çözeltisi hazırlamak. Su Ön ısıtma çözülme yardımcı olacaktır. Biz, lamel başına bu çözüm yaklaşık 1 ml kullanabilirsiniz. Dekstran çözünmüş sonra, bir vakum desikatörde çözüm defoam. </li><li> Silanlanmış lamelleri kür bitirdiğinizde, seramik rafa kaldırmak ve onları plastik bir dondurucu kutusunun içine düz düzenlemek. Dekstran çözüm ~ 1 ml her lamel üst yüzeyi kapsayacak şekilde 1 ml pipet kullanın. Dondurucu kutusunu kapatın ve 24-36 saat boyunca sessiz bir yerde bekletin. </li><li> Plastik forseps ile lamelleri açgözlü, aşırı dekstran seramik rafın içine dökün ve bunların yerine. Lamelleri su birkaç kez durulayın ve lamelleri 48 saat süreyle su ile ıslatın. Kavanozu hafifçe bir masa üstü rotator ajite olabilir. </li><li> 80 santigrat derece ve bir vakum desikatörde saklayın ayarlanmış fırında lamelleri kurulayın. </li></ol> Lipozom Hazırlık Desteklenen çift katlı lipit katmanını dekstran Fonksiyonlu lamel lipozomlar adsorblama oluşur. Zar yırtıkları ve düz bir yüzey üzerinde yayılır kadar birbirleri ile adsorbe lipozomlar sigorta. <ol><li> Tayininde kullanılan tipik bir lipozom formülasyonu 1,2 oluşur, dioleoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin (DOPC), 1-oleoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin (POPC), kolesterol, sığır beyin Disialoganglioside (GD 1a) ve N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-Glycéro-3-phosphoethanolamine 4:4:2:0.1:5 x10 -5 &#39;lik bir oran. Tüm bileşenleri kloroform veya kloroform ve metanol çözümleri saklanır. </li><li> Bir cam tüpe aktararak her bir bileşenin hacimleri iki mikromolden lipid içeren bir karışım hazırlayın. Argon veya azot gazı akışı altında çözücü buharlaşır. Iki saat için bir vakum desikatörde test tüpü bırakarak kalan solvent çıkarın. </li><li> HNE tampon 400 mikrolitre (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) kurutulmuş lipid filmi tekrar </li><li> Süspansiyon, plastik bir mikrosantrifüj tüp aktarın. Sıvı azot banyo ve sıcak su banyosu bir çözülme içinde süspansiyon dondurun. Bu donma / çözülme döngüsü dört kez tekrarlayın. </li><li> 100 nm polikarbonat membran filtre ile lipid ekstruder birleştirin ve lipid süspansiyon 25 kez a&#39;ya. Ekstrüzyon sonra daha şeffaf olması için süspansiyon görünmelidir. </li><li> Lipozomlar hazırlanır gün kullanılmalıdır. Kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol> Mikroakışkan akışı hücre hazırlığı Mikroakışkan basit bir akış hücresi, bir kuvars slayt ve Fonksiyonlu lamel arasında çift kaset sopa sandviç tarafından yapılır. <ol><li> 20x20x3 mm kuvars slayt alın. Karşı tarafta iki adet 1 mm delik bir elmas tur kullanın. </li><li> Çift kaset sopa bir levha 20 mm kare kesilmiş ve bir jilet kullanarak merkezine 15 x 2 mm bölümü kesip. </li><li> Bir tarafı, teyp yedekleme ve litre bant uymak soyunz slayt. Fonksiyonlu lamel diğer tarafında uyun. </li><li> Polietilen boru, iki adet 20 cm uzunlukta kesin ve kuvars slayt deliklerin içine yerleştirin. </li><li> 5 dakikalık epoksi yapıştırıcı ile akış hücresi Seal. </li><li> tamponu ile tutkal tedavi, asal akış hücresi ve tüp. </li><li> Desteklenen bir çift katlı lipid kanallar içine lipozom süspansiyon yaklaşık 80 mikrolitre çizerek, bu aşamada oluşturulabilir. </li></ol> Virüs parçacık etiketleme <ol><li> H3N2 influenza A (X-31) tipik füzyon tayini için kullanılan, ancak, diğer grip suşlarının ve diğer virüsleri başarılı bir şekilde kullanılmıştır. </li><li> Virüs hemifusion ve gözenek oluşumu tespit izin vermek için iki farklı floresan boyalar ile etiketlenir. </li><li> 20 mM bir çözüm yapmak için HNE tampon sulforhodamine b (SRB) eritin. 10 mikrolitre viral süspansiyon ile boya çözüm 20 mikrolitre birleştirin ve oda sıcaklığında 20 saat bırakın. Bu dönemde, boya yavaş yavaş virüs parçacıkları birikebilir. </li><li> PD-10 tuzsuzlaştırma sütun aracılığıyla virüs süspansiyon geçerek aşırı boya çıkarın. Yeterli viral malzeme kullanılması durumunda, renkli bir bant sütununda görülebilir. Bu band etiketli virüs içerir ve yıkandı, olarak toplanabilir. </li><li> Hiçbir grubun görünmüyorsa, 200 mikrolitrelik kesirleri toplamak ve bir spektrofotometre ile 565 nm emme ölçerek virüs etiketli içeren fraksiyonları belirlemek. Toplam hacminin yaklaşık 0.8 ml virüs Zehir gerekir. </li><li> SRB etiketli virüs süspansiyonu 13 mikrolitre octadecyl rodamin 110 (Rh110C18) 2 mM dimetil formamid (DMF) çözümü ekleyerek viral zarf etiketleyin. </li><li> Süspansiyon bir laboratuvar rotator tüp ekleyerek karıştırın ve 3 saat bekletin. </li><li> Daha önce de açıklandığı gibi, PD-10 tuzsuzlaştırma sütun kullanarak aşırı Rh110C18 virüs arındırın. </li></ol> Mikroskop yapılandırma Deney, toplam iç yansıma floresan mikroskopi için uygun bir yüksek NA immersiyon yağı amacı ile donatılmış bir floresan mikroskop yapılır. Argon / kripton gaz lazer 488 ve 568 nm hatları Rh110C18 ve SRB etiketli virüs heyecanlandırmak için kullanılır. Her etiket eş zamanlı görüntüleme bölme dikroik bir ayna ile yeşil ve kırmızı floresan emisyon tarafından gerçekleştirilir ve görüntüleri bağımsız ayrı bir elektron çarparak CCD kamera yarısı üzerine duruluyor. Deneyin yapılması Etiketli virüs parçacıkları, floresein ile yüzey kaplama ve düşük pH tampon (Şekil 1A) ile reaksiyon başlangıcında yerleştirme, füzyon testinin Yürütme akışı hücre içinde biyokimyasal bileşenlerin aşamalı montaj içerir düzlemsel çift katlı lipid montaj: . <ol><li> Mikroskop sahneye akış hücre Dağı ve dakikada 40 mikrolitre hızında akış bir şırınga pompa çıkış boru takın. </li><li> HNE 300 mikrolitre akan aşırı lipozomlar akış kanalları temizleyin. </li><li> Mikroskop Focus ve 488 nm ışık ve 568 nm ışık 70 W / cm 2 350 W / cm 2 yüzey aydınlatmak için lazer gücünü ayarlamak. 1.45 NA 60x immersiyon yağı hedefi kullanıyorsanız, sırasıyla, lazer yoğunlukları mikro 100 Watt ve 20 Watt mikro ayarlayabilirsiniz. </li><li> Pompa akış hücresi içine etiketli virüsü (1 / 100 seyreltilmiş). Virüs akış kanalı alt yüzeye yayılır, parçacıklar, çift katlı lipid dahil gangliozid sopa başlayacak. </li><li> Demirledi virüs partikülleri uygun bir yoğunluk (görüş alanı başına yaklaşık 1000 parçacıklar) elde edilmiştir. Mililitre floresein etiketli streptavidin başına iki mikrogram içeren bir çözüm için giriş tüp geçiş yapın. Etiketli streptavidin bilayeri birleştiğinde lipid molekülleri biotin bağlamak ve sonunda loş bir yeşil arka plan görünür olacak. </li><li> Akış kanalı HNE 300 mikrolitre ile yıkayın. </li><li> Bir görüntüleme alanı seçin, mikroskop odak ve CCD kamera zaman lapsed görüntü elde etmek için hazırlar. Pozlama süresi 100 ms ayarlayın ve 10 Hz hızında kare toplamak. </li><li> 10 mM sodyum sitrat ve 140 mM NaCl içeren bir asidik tampon akan füzyon başlatın. Tampon pH test olan virüs kritik pH altında düzenlenmelidir. PH X-31 sigortalar aşağıda 5.5. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1B füzyon öncesi ve sırasında çift katlı demirledi virionlar anlık gösterir. Her kırınım sınırlı nokta ayrı bir virüs parçacık temsil eder. Kırmızı ve yeşil floresan ayrı viral zarf ve içerik etiketleri eş zamanlı gözlem sağlayan bir CCD kamera, üst ve alt yarısı üzerine imaged edilmiştir. Göre yeşil kanal iki kat daha fazla lekeler genellikle vardırkırmızı, ve bu zarf etikete göre içerik boya ile etiketleme düşük verimlilik yansıtır. Floresein bağlı yüzeyden yayılan yeşil arka plan floresan sitrat tampon vardıklarında kaybolur ve füzyon reaksiyonu başlama zamanını belirliyor. Hemifusion olaylar hemifusion sapı boyunca viral zarf yayılır söndürülür Rh110C18 yeşil floresan patlamaları gibi algılanır ve düzlemsel membran seyreltilir. Dışa doğru genişleyen bir floresan bulut düzlemsel membran yağ açil bağlantılı boya difüzyon gösteren, hemifused parçacıkların çevresinde görülebilir. Gözenek oluşumu viral parçacıkların iç içinde sıkışıp SRB kırmızı floresan çürüme olarak görülmektedir. Bir füzyon gözenek açılması, boya, sulu, gözlem bölgenin düzlemsel bilayeri ve dışarı altında uzaya kaçmak için olanak sağlar. Floresans şiddeti her parçacık için yörüngeleri, bireysel parçacıkların entegre şiddetleri çizilen hemifusion ve gözenek oluşumu (Şekil 1C) verim ve saatleri belirlenmesi kolaylaştırmak. Hemifusion ve gözenek oluşumu olay kez Rh110C18 floresan patlama veya SRB sinyal çürümesi maksimum eğim oluştuğu noktası olarak belirlenir. Başarılı bir deneyde, Rh110C18 verim dequenching sinyalleri ve SRB etiketli parçacıkların yüzde 30 ile etiketlenmiş parçacıkların yaklaşık yüzde 50 kullanışlı sinyal verir. Iki boya ile işaretlenmiş parçacıklar, yaklaşık yüzde 10, hem de lipid karıştırma ve gözenek oluşumu sinyalleri göstermektedir. Şekil 2A-C, tipik bir deney hemifusion ve gözenek oluşumu gecikme süreleri dağılım gösterir. Fig.2D-F, aynı koşullar altında yapılan beş deneyler kombine olayların olay dağılımını gösterir. Mütevazı bir gözlem bile, histogramlar şekli açıktır. Her bir deney pH damla zaman algılama ile senkronize olduğundan, birden fazla deneyler kombine edilebilir ve ara adımlar hız sınırlayıcı hakkında ayrıntılı bilgi elde edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="Şekil 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Deneysel tasarım . A) Virüs parçacıklar hemifusion ve füzyon gözenek oluşumu kinetiği izlemek için iki floresan boya ile etiketlenir. Floresans yüksek NA mikroskop objektif tarafından toplanan ve bir CCD üzerine görüntülenmiş. B) Floresan görüntüleri (sağda) önce (solda) ve sırasında bireysel viral parçacıkların füzyon. Desteklenen bilayeri aynı ~ 50 x 100 mm 2 &#39;lik alanın her resmin üst ve alt yarısında, sırasıyla, kırmızı ve yeşil floresan karşılık. C) kırmızı SRB viral içerik tracer (üst iz) floresan yoğunluğu, yeşil Rh110C18 membran boya (orta eser) ve pH düşmesi, hemifusion ve füzyon arasında geçen floresein pH sensörü (alt iz) kesin kez sağlar. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 floresan etiketli virüs Fusion kinetiği. PH düşüşü ve hemifusion (A, D) ve gözenek oluşumu (B, E) arasında geçen zaman dağılımları. Dağılımları yükselişi ve çürüme birden fazla ara adımları varlığını göstermektedir. Hemifusion ve bireysel tanecikleri için bir füzyon gözenek açılması arasında geçiş katlanarak hız sınırlayıcı tek bir adım öne dağıtılır. Panelleri AC tek bir deney sonuçları göstermektedir. Aynı koşullar altında yapılan beş ayrı deneylerde Panelleri DF derlenmektedir. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

Sıvı ve sürekli desteklenen çift katlı lipit katmanını hazırlanması zor olabilir. Malzeme veya yüzey kusurları kirlenmesine neden olan eser miktarda bilayers, yayılmasını önlemek. Dekstran düzgün bir tabaka dikkatli bir temizlik ve birikimi esastır. Virüs parçacıkları uzun süre görüntüleme floresan etiketleri çamaşır suyu veya inaktif hale gelmesine neden olabilir. Bu tür Foto-hasar ve biyo-görüntüleme ve tek bir molekül alanları bilinir ve genellikle heyec...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

Membran füzyon zarflı virüslerin hücre içine girişi sırasında önemli bir adım. Konvansiyonel füzyon deneyleri genellikle zor ilgili moleküler adımları sırası kantitatif analiz yapma, füzyon olayları çok sayıda rapor. Biz, in vitro bir hedef bilayeri aslında bir sıvı desteği ile tek bir virüs parçacıkları eritme kinetiği izlemek için iki renkli floresan tahlil geliştirdik. Grip viral parçacıkların, membran ve kırmızı bir hidrofilik fluorofor viral iç leke leke yeşil bir lipofilik fluorofor ile inkübe edilir. Biz bir akış hücresi dekstran-functionilized cam yüzeyinde bir gangliozid içeren çift katlı lipid mevduat, bir CCD parçacıkların yüzlerce içeren, düzlemsel bilayeri ve görüntü 100 x 100 mikron 2 alan floresan viral parçacıkların inkübe kamera. Görüntüleme hem de kırmızı ve yeşil floresan, biz aynı anda membran boya (yeşil) ve sulu içeriği (kırmızı) parçacıkların davranışlarını izlemek. Füzyon pH altında bir değere pH düşürücü üzerine, partiküllerin membran ile sigorta. Hemifusion, hedef zarının dış broşür ile viral zarının dış broşürün birleştirilmesi, yeşil floresan bir parçacığın ani bir değişim olarak görülebilir. Gözenek kalan iki distal broşür sonraki füzyon üzerine kurulacaktır ve viral partikül kırmızı yayan fluorofor hedef membran altında piyasaya sürülecek. Bu olay bireysel parçacıkların kırmızı floresan bir azalmaya yol açacaktır. Son olarak, hedef membran gömülü olduğu bir pH duyarlı fluorofor entegre floresan pH damla tam zamanı bildirir. Üç floresan-time izleri, tüm önemli olaylar (pH düşmesi, gözenek oluşumu üzerine karıştırma hemifusion, içerik üzerine karıştırma lipid) kolay bir şekilde ve tek tek her parçacık için ayıklanır. Histogramlar birçok bireysel parçacıklar için çeşitli geçişler için geçen süreleri toplayarak, ilgili ara yaşamlarda belirleyebilirsiniz. Doğrudan bir floresan gözlemlenebilir yoksa bile gizli ara bu histogramlar doğrudan görüntülenebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level at JoVE.com

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Biz mevcut bir<em&gt; In vitro</em&gt; Iki renkli bir sıvı hedef bilayeri ile tek bir virüs partikülü füzyon görselleştirmek için floresan tahlil. Farklı viral zarı ve iç leke fluorophores viral parçacıkların etiketleme, biz hemifusion ve gözenek oluşumu kinetiği izlemek mümkün.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Görüntüleme.  Harvard Medical School. Biz mevcut bir In vitro Iki renkli bir sıvı hedef bilayeri ile tek bir virüs partikülü füzyon görselleştirmek için floresan tahlil. Farklı viral zarı ve iç leke fluorophores viral parçacıkların etiketleme, biz hemifusion ve gözenek oluşumu kinetiği izlemek mümkün.

Video: Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Biyoloji

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Tek Çekirdek Düzeyde HAT-1 Retrotransposition Analizi

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Yalıtım ve floresan görüntüleme Chlamydomonas Centrioles tek-parçacık yeniden inşası için

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...