Bu çalışma, SK ve Heath National Institutes hibe R01EB008722 bir Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.

A. Malzeme Hazırlama ve Sterilizasyon <ol><li> Kapsülleme malzemelerin hazırlanması öncesinde karıştırma ve bir kaç gün 37 ° ° C için kuluçka, fosfat photoinitiator Irgacure 2959 (I2959) 0.5 ağırlıkça% çözelti hazırlamak tamponlu salin (PBS) Bu çözüm daha sonra şırınga sterilizasyonu için filtre ve uzun vadeli kullanım için oda sıcaklığında saklanan olabilir. </li><li> Sentezlenen jellerin istediğiniz kompozisyonu dayanarak, polimer ve çapraz bağlayıcı ağırlığı (Microsoft Excel gibi bir elektronik tablo programını kullanarak) hesaplamak gerekli. Polimer Belirli bir ağırlık, hidrojeller, çapraz bağlayıcı ve toplam jel hacmi polimer çözüm bölümlerini istediğiniz bir konsantrasyon elde etmek için tanımlanmış bir toplam hacmi içinde çözünmüş olması gerekir, çünkü tablo kullanarak tespit edilmelidir. Eğer herhangi bir kolye moieties önce crosslinking dahil edilmesi (örneğin, bir yapıştırıcı RGD veya Oligopeptide içeren YGSR) Benzer hesaplamalar yapılmalıdır. </li><li> Eppendorf tüpleri içine gerekli polimer ve çapraz bağlayıcı miktarı ve yeri tartılır. Elde edilen polimer gerçek ağırlık hesaplama tablo buna göre ayarlayın. (Not: hacimleri elde edilen polimer ve çapraz bağlayıcı gerçek kitle telafi etmek için değişmiş olabilir) . </li><li> Jel kalıpları ayrı ayrı sarılmış steril 1 ml tek kullanımlık şırınga üstleri kesmek için jilet kullanarak hazırlayın. Emin olun düz bir kesim photopatterned jeller için kullanılacak kalıplar için yapılır. </li><li> Şırınga kalıpları, Eppendorf tüpleri (kapaklar açık) ve antiseptik bir ışık kaynağı (genellikle biyolojik güvenlik kabinleri yerleşik) altında herhangi bir diğer gerekli malzemeleri koyun ve 30 dakika süreyle sterilize. </li></ol> B. Hücre Hazırlık <ol><li> Sterilizasyon sonrasında, uygun steril tampon hacmi (elektronik tablo hesaplamaları başına; tampon seçimi, değişebilir PBS gibi trietanolamin gibi zayıf bir baz tampon genellikle serbest radikal ve michael-tipi crosslinking, sırasıyla için kullanılır.) Polimer Eppendorf ve (isteğe bağlı) kolye benzer parçaları dahil edilmesi (örneğin, yapışkan peptid) ve çözmek için vorteks (parafilm ile steril kaput şal dışında Eppendorf vorteks varsa). </li><li> Polimer çözüm kolye benzer parçaları çözüm uygun hacim ve mühür ile parafilm sarın. Hücre hazırlanması sırasında 37 ° C tepki Kısaca vorteks ve inkübe (eğer mümkünse, döner bir heyecan plaka tepesinde). Bu peptid, son hidrojel bir kolye grup olarak dahil olduğu bir akrilat ve metakrilat peptid tiyol reaksiyonu (sistein grup üzerinden) içerir. </li><li> Trypsinize ve hücreleri ve jeller her set için uygun sayı içeren bölümlerini ayırmak saymak. Örneğin, 10 milyon hücre / mL ayrı ayrı bir konik tüp içine 1,5 milyon hücre yoğunluğu üç 50 mcL jeller bir dizi. En fazla 4 jeller, jelleşme zamanlaması (: birden fazla set jeller sentezleme halinde, tüm setleri için yeterli miktarda polimer çözüm içeren tek bir Eppendorf hazırlanmış olabilir dikkat edin) nedeniyle bir birey olarak hazırlanmış olması tavsiye edilir. </li><li> Hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Hücreleri aşağı dönerken <ol class="lalpha"><li> Işık serbest radikal çapraz bağlanma başlatılan, toplam jel seti hacminin% 10 (0.05 ağırlıkça% nihai bir başlatıcı konsantrasyonu için) eşit polimer çözüm 0.5 ağırlıkça% I2959 çözüm ekleyin . </li><li> Michael-tipi (ek) crosslinking uygun konsantrasyon çözüm elde etmek için çapraz bağlayıcı tampon eklemek. </li><li> Sıralı çapraz bağlanma için: bu jeller crosslinking her iki tip dahil ve önceki adımları gerektirir. </li></ol></li></ol> C. Hidrojel Oluşumu <ol><li> Santrifüj hücre kısmı süpernatant aspire. Hücre pelletini bozmadan mümkün olduğunca ortamı çıkarmak için ilk aspirasyon ve yeniden aspirat sonra yerleşmek için sıvı için bekleyin. </li><li> Polimer çözeltisi ile hücre pelletini tekrar hücreler eşit olarak dağıtılır kadar. Yavaş yavaş çözüm pipetleme tarafından kabarcık oluşumunu en aza indirmek ve aşağı (yaklaşık 10 döngü hücreleri dağıtmak için yeterli olacaktır). </li><li> Crosslinking Hidrojeller <ol><li> Temsili miktar şırınga ucu kalıplara uygun hacmi: Işık, serbest radikal çapraz bağlanma başlattı . Radikal çapraz bağlanma için UV ışık şırınga Açığa (örneğin, 365 nm 10 dakikalık bir maruz kalma, 4 mW/cm2 UV ışık akrilat sahip polimerler için yaygın olarak). Bu adım, hücre, UV ışık maruz önce yerleşen en aza indirmek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. </li><li> Michael-tipi (ek) crosslinking: geniş bir orifis pipet kullanarak, polimer / hücre çözümü için uygun çapraz bağlayıcı çözüm hacmi eklemek istenen bireysel jel hacmi pipet, çözüm pipeti ve aşağıhomojenize ve şırınga ucu kalıplar içine kısım. Bu adım, hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. 10-30 dakika (bireysel sistemin bağlı) kültür crosslinking kaputu inkübasyon izin verin. </li><li> : Sıralı crosslinking sonra Michael-tip yanı sıra ilk tepkisi ve ikinci crosslinking ışığa maruz içerir. Teorik çapraz bağları sadece bir kısmını ilk çapraz bağlanma sırasında reaksiyona girer ve daha sonra steril bir maske jel yüzeyine steril cımbız kullanarak ışığa maruz önce doğrudan uygulanabilir olmalıdır. Jel radikal çapraz bölgelerde tercihen bir araya getirecek bir Fonksiyonlu boya (örneğin 20 nM jel nihai bir konsantrasyonda, methacrylated rodamin (MeRho)) (Şekil 2, desenlendirme görselleştirmek için ilk çözüm olabilir .) </li></ol></li></ol> D. Hücre Kültürü ve Analiz <ol><li> Ardından çapraz bağlanma, kuluçka ve analiz için medya içeren bir doku kültürü plaka kuyu atılmak jelleri (bkz. aşağıdaki adımları). </li><li> Floresan ölü / canlı boyama kiti (Şekil 3 ve 4) kullanarak ve canlılığı, hücreleri morfolojisi ışık mikroskobu (genellikle, sentezlenmiş hidrojeller şeffaf Şekil 3) kullanılarak görüntülendi olabilir. Hücresel aktin (örneğin, rodamin ya da floresein Phalloidin etiketli) ve çekirdekler için (örneğin, 4&#39;-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) Boyama, aşağıdaki yordamı ile standart fiksasyon ve permeabilization prosedürleri (Şekil 4) kullanılarak yapılabilir. <ol class="laplha"><li> PBS ile 5 dk 3X yapıları durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika için 1 ml% 4 formaldehit inkübasyon jeller sabitleyin. </li><li> 3X yapıları engelleme çözümü içeren% 3 (w / v) BSA ve% 0,5 (w / v) PBS içinde Tween ile durulayın. </li><li> % 0.25 &#39;lik (w / v) 20 dakika için çözüm engelleme Triton X ile membran Permeabilize. </li><li> 3X yapıları çözümü engelleme ile durulayın. </li><li> 0.66 mcg / ml FITC veya oda sıcaklığında iki saat için bir çözüm engelleme rodamin Phalloidin ile F-aktin Leke. </li><li> Çözümü engelleme 3x durulayın. </li><li> 20 dakika için 0.4 mcL / ml DAPI PBS kullanarak hücre çekirdekleri Leke. </li><li> PBS ile 3 kere yıkayın. </li><li> Epifluorescent veya konfokal mikroskopi kullanılarak hücrelerin gözünüzde canlandırın. </li></ol></li><li> Jeller içinde hücrelerin çoğalması yaygın olarak piyasada mevcut testlerin (örneğin, toplam DNA veya biyokimyasal içeriği) kullanılarak değerlendirildi. PicoGreen çift iplikli DNA miktarının belirlenmesi için leke yaygın olarak kullanılan ve hassas bir floresan nükleik asit (Singer ve ark.) . Hücreler de sayılır ve Adım 2&#39;de açıklanan görüntüleme yöntemleri kullanılarak bir başlangıç ​​kontrol numarası normalize olabilir. </li><li> Histolojik kesit alma ve boyama hücreleri görselleştirmek ve matris oluşan kullanılabilir. 3D hidrojellerin dehidratasyon ve kesit için aşağıdaki protokol cam slaytlar kesitsel dilimler elde etmek için kullanılabilir: <ol class="lalpha"><li> Fiksasyon ve dehidratasyon <ol class="lroman"><li> PBS içinde örnek 3X durulayın. </li><li> 5 - 30 dakika için% 4 paraformaldehid Fix. </li><li> PBS içinde örnek 3X durulayın. </li><li> 25 EtOH örnek inkübe ° C aşağıdaki EtOH (v / v) su konsantrasyonları (sırayla), her 1 saat:% 50,% 70,% 95,% 95,% 100 (Bu noktada, örnekler 25 gece boyunca saklanabilir ° C). </li></ol></li><li> Takas ve infiltrasyon <ol class="lroman"><li> 1 saat 25 ° C, bir saat 65 ° C için% 100 Citrisolv transfer </li><li> Numunenin kesit maruz kaldığı bu tür bir Petri kabındaki bir jilet ile yarım örnekleri kesin. </li><li> 65 1 saat için Citrisolv / Mikro-cut Parafin 1:1 karışım transfer ° C. </li><li> 65 1 saat süreyle% 100 Micro-cut Parafin Transfer ° C. </li><li> 65 yaşında bir gecede% 100 Micro-cut Parafin Transfer ° C. </li><li> 65 az 1-2 saat süreyle% 100 Micro-cut Parafin Transfer ° C. </li></ol></li><li> Gömülmesi <ol class="lroman"><li> % 100 parafin ile peel-away kalıp pozisyon örnek. </li><li> Kalıp yatakta mum küçük bir miktar yerleştirin ve örnek iki yarısı kesit aşağı bakacak şekilde yerleştirin. </li><li> Üst filtre parça uygulayın <ol><li> Üst parça batığın ek balmumu ekleyin ve 10 dakika için sertleşmesine izin. </li></ol></li><li> 4 ° C buzdolabı sertleşmesine örnek bir gecede izin ekler aktarın. </li><li> Numune bölümü olabilired ertesi gün, genellikle piyasada mevcut Mikrotomlar kullanarak dilim başına 5-10 mikron kalınlığında. Genellikle peel-away kalıp mikrotom aşamada karşı dikey olarak monte edilir ve manuel kontroller bıçak ile örnek kesit kalınlığı, dilimleme makinesi ve hizalama ayarlamak için kullanılır. </li></ol></li><li> RNA Ekstraksiyon Gen ifadesi de (örneğin, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile) kantitatif olarak değerlendirilebilir. RNA ekstraksiyon, aşağıda verilen bir örnek, 3D hidrojeller için protokol daha basit 2B durumu oldukça farklı. <ol class="lroman"><li> Her 3D hidrojel için onaylı bir RNAse ücretsiz Eppendorf tüp etiket ve her bir tüpe 500 mcL Trizol ® reaktif ekleyin. </li><li> Net bir çözüm elde edilinceye kadar hidrojeller el öğütmek için bir havaneli (doku değirmeni) kullanın. Emin olun farklı öğütücüler, her durum için kullanılır. </li><li> Vorteks her 20 saniye için Eppendorf örnekleri homojenize. </li><li> Nükleoprotein kompleksleri tam ayrılma izni için, beş dakika boyunca oda sıcaklığında numune inkübe edin. </li><li> Cool 20 dakika buz örnekleri </li><li> 200 mcL (kisi ml Trizol) kloroform, her örnek ve vorteks ekleyin. </li><li> Beş dakika süreyle oda sıcaklığında numune inkübe edin. </li><li> 4 12,000 xg&#39;de santrifüjleyin ° C 15 dakika. </li><li> Yeni Eppendorf tüpleri (arayüzey bölgesi ve düşük kırmızı, fenol-kloroform faz kaçınarak) sulu faz (şeffaf üst tabaka) aktarın. RNA berrak sulu faza kalır. </li><li> RNA izolasyonu ve depolama için ortak teknikler kullanılabilir. </li><li> Aşağıdaki RNA ekstraksiyon, ters transkriptaz ve real-time PCR için ticari kitler mevcuttur sık sık bazı değişiklikler (Elisseff ve ark. Strehin ve ark.) Kullanılır. </li></ol></li></ol></li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Photopatterned hidrojeller ve jeller içinde hücre kapsülleme görselleştirme temsilcisi sonuçlar için Şekil 2-4 (yukarıdaki protokolleri başvurulan) bakın. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Genel Bakış 3D kapsülleme prosedürü. Diyagram adımları adım adım protokoller bölüm başlıkları karşılık. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 sıralı Michael-tipi ek radikal polimerizasyonu kullanarak Photopatterned hidrojel. (A), bir fotoğraf reaktif boya dahil ile kısmen çapraz hidrojel photopatterning şematik. (B) Daire veya (C) şerit asetat film maskesi hyaluronik asit hidrojeller desenli. Methacrylated rodamin (MeRho), sadece ışığa maruz jel bölgelerde kurulmuştur. Ölçek bar = 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 3D hidrojeller hücrelerin Görselleştirme. Kök hücreler, (a) ışık mikroskobu aracılığı ile görsel veya (b) canlı (yeşil Calcein AM) ve ölü (kırmızı, Ethidium homodimer-1) boyama 24 saat ışık ile çapraz bağlı hyaluronik asit hidrojel 1 milyon hücre / mL kapsülleme serbest radikal mekanizması başlattı. Ölçek bar = 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 3D hidrojeller hücrelerin Görselleştirme. hMSCs (Michael-tipi bir mekanizma yoluyla çapraz bağlı hyaluronik asit hidrojel 1 milyon hücre / mL kapsülleme aşağıdaki (a) canlı hücreler (Calcein AM) veya (b) hücresel aktin (rodamin Phalloidin) ve çekirdekler (DAPI) beş gün için boyanmış kolye yapışkan peptidler ve bifonksiyonel proteolitik parçalanabilir peptid crosslinkers kullanarak). Ölçek bar = 100 mm.

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li><li>Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Responsive+Synthetic+Hydrogels.">Cell-Responsive Synthetic Hydrogels.</a> Adv Mater. 15, 888-892 (2003).</li><li>Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Photoencapsulation+in+Hydrogels.">Cellular Photoencapsulation in Hydrogels.</a> Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).</li><li>Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+auricular+chondrocyte+expansion+on+neocartilage+formation+in+photocrosslinked+hyaluronic+acid+networks.">Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks.</a> Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).</li><li>Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microenvironments+for+controlled+stem+cell+differentiation.">Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Mode+Thiol-Acrylate+Photopolymerization+for+the+Synthesis+of+PEG-Peptide+Hydrogels.">Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels.</a> Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-responsive+hydrogel+for+encapsulation+of+vascular+cells.">Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells.</a> Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).</li><li>Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ECM+Production+by+Cells+Encapsulated+in+Hydrogels.">Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels.</a> Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).</li><li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels.">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li></ol>

Açıklanan protokoller cytocompatible bir şekilde hidrojel iskeleleri içinde hücrelerin saklanması için basit ve güçlü bir yöntemi temsil eder. Terminal farklılaşmış beri böyle teknikler, özellikle önemli olan ve kök hücreler, 2D karşı 3D mikroçevrelerde oldukça farklı davranış gösterirler. Bile tedavi yaklaşımları içeren malzemelerin implantasyon (örneğin, in situ radikal polimerizasyonu), hücre kapsülleme ve canlılığı ve farklılaşması için analizi için materyal geliştirme sürecinde yardımcı olabilir. Açıklanan ardışık süreç mekansal hidrojel ortamda işlemek için kullanılan ve dolayısıyla hücresel davranış (Khetan ve ark.) Olabilir. Genel olarak, açıklanan protokollerin en önemli unsur, kullanılan tüm çözümleri homojenliği. Özellikle, özel bakım, çapraz bağlayıcı bir çözüm aşağıdaki ek pipet tabanda hücreler eşit prepolimer çözüm dağıtılır ve çözüm iyice karıştırılır olduğunu sağlamak için alınmalıdır. Bunu sağlamak için başarısız hücreleri veya jel yapısı ve şişlik yerel farklılıklar topaklanma yol açabilir. Protokolleri encapsulating hücreler için prosedürü üzerine yoğunlaşılmıştır takdim ederken, kapsülleme genellikle 2D tohumlama için yazılmış analiz protokolleri bazı ayarlamalar gerekebilir da dikkat etmek önemlidir. Hidrojeller hücrelerin görselleştirilmesi ve değerlendirmek için bazı örnekler gösterilmiştir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.2 M Triethanolamine Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0449</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>1x, sterile liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead staining kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine Phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>R415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D9542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Citrisolv</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-143975</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-cut paraffin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>24202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizol reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.22 &mu;m pore size nylon syringe filters</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>09-719C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 mL disposable syringes</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>Cut syringes at consistent height for UV exposure</td>
</tr>
<tr>
<td>Wide orifice pipette tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>254 nm germicidal UV light source</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Built into most biological safety cabinets</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cellular encapsulation in 3d hydrogels for tissue engineering 

Hidrojeller içinde hücre 3D kapsülleme giderek daha önemli ve popüler kültür hücreleri ve doku mühendisliği yapılarının geliştirilmesi yönünde bir tekniği temsil eder. Bu ortam daha iyi doku gibi özellikleri ve 3D ortamı nedeniyle, standart doku kültürü ile karşılaştırıldığında, hücrelerin in vivo olarak görüyoruz ne taklit eder . Sentetik polimerik hidrojeller suda şişmiş ağları istikrarlı veya yeni doku kapsüllü hücreleri tarafından tevdi hidroliz veya proteoliz yoluyla aşağılamak için tasarlanmış olabilir. Poli (etilen glikol) ve hyaluronik asit gibi bu uygulamalar için bir çok çeşitli polimerler araştırılmıştır. En sık, polimer gibi metakrilat veya çeşitli mekanizmalar aracılığıyla crosslinking geçiren yetenekli akrilatlar gibi reaktif grupları ile işlevselleştirildiyse. Kapsüllü kök hücreler (. Burdick ve ark.) Farklılaşma da dahil olmak üzere uygulanabilirliği ve doğrudan hücre fenotipi geliştirmek için biyokimyasal ipuçlarının, fiziksel ya da askılı kovalent ortaklık yoluyla, örneğin son on yıl içinde çok ilerleme mühendislik bu mikroçevrelerde yapılmış oldu. Hücre 3D kapsülleme için aşağıdaki yöntemlerden cytocompatibility en üst düzeye çıkarmak ve hidrojel işleme adımların sayısını en aza indirmek için, bizim ve diğer laboratuvarlarda optimize edilmiştir. Aşağıdaki protokolleri (prosedürün bir örnek için bkz: Şekil 1), crosslinking geçiren yeteneğine sahip polimerler zaten elinde olduğunu varsayılır;, doku mühendisliği alanında uygulanan polimer kimyası mükemmel yorumlar başka bir yerde bulunabilir (Burdick ve ark.) ve bu yöntemlerin bir dizi polimer türleri ile uyumlu. Ayrıca, Michael tipi ek (Lutolf ark) ve serbest radikal (Elisseeff ve ark.) Mekanizmaları burada odaklanmış ışık başlatılan rapor crosslinking teknikleri sadece küçük bir bölümünü oluşturmaktadır. Reaktif grupların bir kısmı ilk ek crosslinking tarafından tüketilen ve radikal bir mekanizma tarafından takip edildiği Karma mod crosslinking, yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir kapsüllü hücreleri (Khetan ve ark. Salinas ve ark.) Fenotip yönetmek için başka bir paradigma.

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering at JoVE.com

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Biz, sentetik hidrojeller içinde hücreler 3 boyutlu (3D) kapsülleme için protokolleri mevcut. Kapsülleme işlemi kapsüllü hücre davranışlarını değerlendirmek için iki yaygın olarak kullanılan çapraz bağlanma yöntemleri (michael-tipi hafif başlatılan ek ve serbest radikal mekanizmaları) yanı sıra bir dizi teknik özetlenmiştir.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

cellular-encapsulation-in-3d-hydrogels-for-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

36.7K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. Biz, sentetik hidrojeller içinde hücreler 3 boyutlu (3D) kapsülleme için protokolleri mevcut. Kapsülleme işlemi kapsüllü hücre davranışlarını değerlendirmek için iki yaygın olarak kullanılan çapraz bağlanma yöntemleri (michael-tipi hafif başlatılan ek ve serbest radikal mekanizmaları) yanı sıra bir dizi teknik özetlenmiştir.

Video: Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Doku Mühendisliği Deneysel Yaklaşımlar

Biyoloji

Title Cell Encapsulation by Droplets

Droplets tarafından Başlığı Hücre Kapsülleme

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Doku Mühendisliği ve Hücre Kültürü için Lifli Polimer Yapı iskeleleri elektrospinning

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these models utilize reconstituted basement membrane derived from animals which contain a variable amount of growth factors and cytokines that can influence the growth of these cell culture models. Here, we describe in detail the preparation and use of PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel that is devoid of animal-derived material and pathogens to encapsulate and propagate the ovarian cancer cell line, OVCAR-5. We begin by describing how to prepare the PuraMatrix prior to use. Next, we demonstrate how to properly mix the PuraMatrix and cell suspension to encapsulate the cells in the hydrogel. Upon the addition of cell culture media or injection into a physiological environment, the peptide component of PuraMatrix rapidly self assembles into a 3D hydrogel that exhibits a nanometer scale fibrous structure with an average pore size of 5-200 nm1. In addition, we demonstrate how to propagate cultures grown in encapsulated PuraMatrix. When encapsulated in PuraMatrix, OVCAR-5 cells assemble into three dimensional acinar structures that more closely resemble the morphology of micrometastatic nodules observed in the clinic than monolayer in vitro models. Using confocal microscopy we illustrate the appearance of representative OVCAR-5 cells encapsulated in PuraMatrix on day 1, 3, 5, and 7 post plating. The use of PuraMatrix to culture cancer cells should improve our understanding of the disease and allow us to assess treatment response in more clinically predictive model systems.

This video demonstrates how to encapsulate and culture cancer cells in PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel.

Kanser Hücrelerinin PuraMatrix Kapsülleme

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Uygulamalarda Kantitatif Karşılaştırılması Cis</emTransgenik>-Regulatory Element (CRE) Etkinlikler Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik stimülasyonu

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojellerinin hazırlanışı

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...