Yazarlar Pittsburgh, Sağlık ödülü K01 AR062598 National Institutes ve hibe P30 DE030740 Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi mali destek kabul. Yazarlar ayrıca ImageJ makro ImageJ ve Michael Cammer geliştirmek için ICUE1 plazmid Dr. Jin Zhang, Wayne Rasband teşekkür ederim.

The authors have no conflicts to declare.

Bu çalışma FRET görüntüleme 3D hidrojeller hücresel sinyalizasyon analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Önceki çalışmalar hidrojeller 38 ile hücre dışı etkileşim, hidrojel yüzeylerde 35-37 numaralı seribaşı hücrelerin FRET görüntüleme gösterdi ve hidrojeller 39-41 sıkışıp moleküllerin iken, bu içinde gömülü hücrelerin FRET görüntüleme bazlı hücre içi analiz tanımlamak için ilk yayındır 3D hidrojeller. 3D 2D FRET görüntüleme çeviri yaparken iş birkaç uygulama sorunları çözer. İlk olarak, yüksek sayısal açıklık hedefleri yeterli emisyon sinyalini toplamak için FRET görüntüleme için gerekli, ama onlar alan derinliği sınırlamak vardır. Burada hücreler biraz bunu telafi etmek için cam yakınındaki bir odak düzlemi hücre sayısını arttırmak için santrifüjleme ile yerleşmeye izin verilir. İkinci olarak, 3D hidrojel iskeleleri analizi komplike görüntüleme sırasında görüş alanı boyunca kayabilir. hidrojeller Burada CoV bağlandıklarıerslip bu deney boyunca sabit olarak kalacak şekilde. hidrojeller hücre görselleştirme engelleyebilir çünkü 3D FRET için uygun hidrojel bileşimlerinin Üçüncüsü, seçim esastır. PC-jel ve TR-jel burada şeffaf hidrojeller kullanılmaktadır. Bununla birlikte, lamel civarındaki bir odak düzlemine santrifüj ile hücreler toplama hidrojel diffraction.The seçimi hidrojeller 42 üzerinde bir inceleme bulunabilir simüle edilmelidir mikro-koşullara bağlıdır daha yüksek olan hidrojeller görüntü hücreleri için kullanılabilir . Dördüncü olarak, alternatif bir hesaplama tek zincirli ICUE1 prob FRET oranı (yani, D QE = QE / cAem) analiz için gerekli resim kanal sayısını en aza indirmek için ve böylelikle photobleaching en aza indirmek için kullanılır. Hücre başına ortalama FRET oranı gerçek FRET oranının küçümsenmesi en aza indirmek için bir hücre içinde piksel başına oranlarının ortalaması olarak hesaplanır. Son olarak, bir lineer oranlı metrik analiz ve araçlartek zincirli bir ikili probları aktif fraksiyonu hesaplamak için tarif edilmektedir. Widefield mikroskopi kullanılarak başarılı FRET deneyler yürüten birçok kritik yönleri vardır. donanım açısından, kamera yeni bilimsel CMOS kamera ve geleneksel CCD daha uygundur elektron çarparak CCD bırakarak, küçük sinyal değişiklikleri gidermek için yeterli duyarlı olmalıdır. en iyi FRET oranı mekansal dağılımını analiz etmek için, kamera en az iki kez objektif (Nyquist kriteri) noktası yayıldı fonksiyonu uzaysal çözünürlüğü sahip olması gerekir. Bu göreve çift görüntüleme sistemleri daha az uygun hale getirir. Daha önemli fluorophores photobleaching en aza indirecek şekilde verilen FRET çifti için uygun bir pozlama ve görüntü elde etme oranını seçmektir. Bir azalmış alım hızı deneme süresi arttıkça tavsiye edilir. Hızlı filtre çarklarını kullanılması edinme oranı ve analiz ederken kaçının için FOVs sayısını artırırÇift görünümü ve taret filtre küpleri ile görüntü kaydı sorunlarını ing. Homojen olmayan aydınlatma alanı örnek otofloresansı ve kamera sistemi gürültü doğar eşiğe için düzeltme zorlaştırmaktadır. Bazı hidrojeller özellikle kollajen proteinleri ihtiva eden 43,44 derece otofloresan bulunmaktadır. FRET oranları arka plan düzeltme olmadan ihmal edilir. Burada sık sık görüntü (Şekil 3B, Adım 7.2) merkezi üzerinde epi-floresan aydınlatma ile konfigüre edilebilir nispeten düz aydınlatma alanında dayanan basit bir arka plan düzeltme yöntemi kullanır. Bu yöntem, bu nedenle bu aydınlatma alanında kişilerce ilgi hücreleri kısıtlar. Burada anlatılan arka plan düzeltme ikili sonda okumak dalga boylarında hücresel otofloresans için hesaba katmaz. Böyle bir durumda, etiketlenmemiş hücreleri (prob transfeksiyon) çıkartılır, aynı koşullar ve arka plan altında görüntülü olmalıdır. A metiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücrelerden IX kullanılabilir ve etiketlenmemiş hücreleri arka plan ROI için seçildi. tüm görüntü alanı üzerinde hücre analizi sağlamak Alternatif yöntemler hücreleri olmadan bir gölgeleme maskesi kullanımı, birden fazla arka plan ROI&#39;leri, ya da aynı örneklerini ve bir protokol istek üzerine mevcuttur. 3D FRET görüntülemeye özgü prob yanıt analit (Şekil 6) hidrojel geçirgenliği son derece duyarlıdır. Bu nedenle, aynı hidrojel bölgeleri tercihen geometrisi simetri noktasında Burada kullanılan şekilde iskele merkezi olarak, deneysel tedavi boyunca karşılaştırılır. Seçenek olarak ise, mikro-akışkan odalar / biyoreaktörler hızlı ve homojen bir analit çözelti 45 ile hidrojel perfüze edilmesi için kullanılabilir. Bir FRET sinyal hidrojelin otofloresans çok yüksek olduğunda (sinyal gürültü oranı çok düşük olduğu) tespit edilemeyebilir; Daha ince bir hidrojel veya farklı prob (farklı flüorofor) kullanılmalıdır.photocrosslinked hidrojellerin 3D FRET görüntüleme ile ilgili olarak, asgari ışınlama maruz kalma ve sonda fluorophores uyarma spektrumları dışında dalga boylarının kullanılması tavsiye edilir. LAP başka potansiyel hücresel hasara 31,46 en aza indirmek için 405 nm&#39;de bir görülebilir ışık kaynağı ile birlikte kullanılabilir. Bu sonda beyazlatma minimize Ancak, 365 nm radyasyon ile kullanarak LAP tavsiye edilir. zirve uyarma yatıyor nm 405 ise 365 nm, CFP donör uyarma spektrumunun kuyruk sonunda yatıyor. Seçenek olarak ise, prob sentezleme bir gün kurtarmak için izin verilebilir. İkili sondaların kullanılmasıyla ifade seviyeleri ve verici ve alıcı florofor moleküler difüzyon farklılık- larına karşı duyarlılığın sorunlarını en aza indirir. İkili-olmayan problar kullanılır, ancak SE yerine eksitasyon ve emisyon spektrumları spektral akmalarını için QE görüntüleme ve ek düzeltme ile (aşağı bakınız) olabilir. Ayrıca, düşük ticari kullanılabilirlik ve FRET probları tasarımı karmaşıklığıbir engel olabilir. Başarılı deneyler için en kritik faktör floresan sinyalleri doğru düzeltme ve analiz kalır. FRET oranı Alternatif bir hesaplama ışıkla ağartma minimize yanında birkaç ek nedenlerle kullanılır. Ikili tek zincirli probları için, sık bildirilen oran donör uyarma (söndürüldü emisyon, QE), yani altında donör emisyonuna donör uyarma (duyarlı emisyon, SE) altında alıcı emisyonu, oranı = SE / QE 25,47,48 FRET. SE / QE FRET verimliliği 21,22,47 değişikliklere doğrusal olmayan görecelidir. Yani oran probu (Ei) doğasında FRET verimliliği katlanarak doğrusal olmayan bir ilişki vardır (Donius, AE, Táboas, JM yayınlanmamış çalışma. (2015)), daha az yaklaşık% 15 oranında daha Ei oran en lineer. SE / QE da aktive sondalar (FAP, yani analit bağlayıcı prob fraksiyonu) fraksiyonu hafife. therefoyeniden, SE / QE analizi hantal bir denge doz tepkisi çalışması ve eğri fit gerektirir. Neyse ki, alıcı uyarma altında alıcı emisyon SE veya QE oranları (AEM) yani Ei ve FAP, açısından doğrusal, FRET oranları SE / AEM ve QE / AEM. SE / AEM genellikle ikili problar için kullanılan ve yalnızca (prob aktivitesi ve tam prob aktivitesi) uç nokta kalibrasyon gerektirir, ancak bazal hücresel sinyal bu zor yapar. Son nokta kalibrasyon ihtiyacını ortadan kaldırmak için, SE donör ve alıcı uyarma ve emisyon spektrumları spektral örtüşme (spektral boşaltma yoluyla) ve kombine prob fluorophores ve mikroskop kuantum verimi ve spektral duyarlılık (QS) için (CSE) düzeltilebilir görüntüleme sistemi. CSE dayalı düzeltilmiş SE FRET oranı, yani bir görüntü, E SE = CSE / AEM her pikselin içinde prob gözlenen FRET verimliliği tanımlar. Ticari ve özgür yazılım bu etkilerin SE düzeltmek için kullanılabilir veokuyucu yöntemleri 50 ayrıntılı bir açıklama için Chen ve Periasamy 2006 çalışmaları denir. Ancak, E SE hesaplanması zaman noktası (SE, QE, AEM) başına üç resim kanallarının yakalama gerektirir. Sadece iki görüntü kanallarının yakalama (QE ve AEM) gerektirir QE / cAem, - Bu nedenle, bu çalışmada biz de alternatif bir FRET oranı E QE = 1 kullanır. Bu kanallardan E QE hesaplanması sadece QS (cAem = AEM QS x) için AEM düzeltme gerektirir. QS = Dem / AEM kolayca Dem alıcı ağartılmış ile donör uyarma altında donör emisyonu bir kalibrasyon numunesi, iki görüntüleri kullanarak tahmin edilmektedir. Herhangi bir anda FAP prob Ei E SE veya E QE karşılaştırılarak hesaplanabilir. Sonuçta, FRET oranı seçimi (E QE = QE / cAem vs E SE = CSE / AEM) prob Çeşidi değerlendirilmesi ve en iyi sinyal ile kanallarda dayanmalıdır. İkisizamanla otofloresansı değişikliklerin hesaba yukarıda tarif edildiği gibi yaklaşırsa kare başına görüntü arka plan gürültü düzeltme bulunmaktadır. Bunlar genellikle tasarım ve mikroskop filtre yapılandırmasını soruşturma nedeniyle durum Dem uyarma spektrumu içine AEM uyarma ışık hiçbir örtüşme varsayalım. Tek zincirli probları birini kullanabilirsiniz ve seçim kamera gürültü en iyi sonda sinyali (parlaklık) ve SE ve QE kanallarda arka plan sinyali dayanır. ICUE1 prob ve burada kullanılan deneysel koşullar (hücre ve hidrojel tipleri) için, SE QE daha güçlü bir sinyal var. Çift zincirli Probes dolayı verici ve alıcı florofor arasında eşit olmayan moleküler dağılımına e se kullanımını gerektirir. Gibi ICUE1 olarak analit bağlanması üzerine FRET azalma biz E SE = 1, burada olduğu gibi verim analit bağlanması üzerine olumlu bir sinyal değişikliği sunmak &quot;ters&quot; olabilir FRET problar için - CSE / AEM veya E QE = QE / (AEM QS x). th analizie FAP FRET oranlarının uygun bir düzeltme ve Ei tahmin duyarlıdır. Bu QS için kullanılan aynı kalibrasyon numunesi ve geleneksel bir bitiş noktası ile FRET tahmin edilebilir Ei = 1- (QE görüntü alıcı photobleaching ve Dem görüntü ardından) 28, ama dikkat edilmelidir (/ Dem QE) en aza indirmek için verim deneyi verici kazara ağartma. QS arındırılmış AEM göre Dem tahmini, ikame edilmiş bir modifiye edilmiş versiyonu tarif yani Ei = 1 - (QE / (AEM) qS x). Alternatif olarak, Ei = CSE / AEM kullanılabilir. canlı hücrelerde Ei Tahmini tüm sondalar tam FRET tahrik olmasını gerektirir. Bu analit bağlanması üzerine FRET azalma gibi ICUE1 olarak problar için pratikte elde etmek zordur. Hücre lizatları ve saflaştırılmış analit ile Ei bir in vitro bazlı hesaplama iyi olmakla birlikte, bu işin kapsamı dışındadır. Burada hücrelerde cAMP azaltmak için 2 &#39;, 5&#39;-dideoksiadenozin kullanmanızı öneririz. Ancak, göreceli FAP b olabilirE sinyalizasyon taban seviyesinden türetilmiş bir Ei tahmini kullanılarak hesaplanmıştır. Bu nedenlerle, çalışmalar en sık agonist eklemeden önce sinyal temel sinyalini doyurur ikinci agonist ekledikten sonra alt sınır ve sinyal olan uç nokta kalibrasyon dayalı FRET oranını (burada yapıldığı gibi) ya da bir akraba FAP üst olduğunu rapor bağlı. Forskolin genellikle cAMP sinyali doyurulması için bir kontrol agonist olarak kullanılır. Alternatif olarak, cAMP analogu kullanılabilir örneğin 8-Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-siklik monofosfat olarak. deneysel tedaviler arasında sinyal yolundaki potansiyel değişiklikleri belirlemek için çalışmaların bitiminde kullanılan pozitif kontroller tavsiye edilir. hücre başına ortalama sinyal yanıtı hesaplanması çeşitli faktörlere göz önüne alınmasını gerektirir. İlk olarak, ortalama FRET oranı, bir hücre içinde, her pikselin oranlarının ortalaması olarak hesaplanmalıdır, yani, (Σ (QE/cAem)) / (piksel sayısı) yerine RABir hücrenin ortalama QE ve AEM, yani, (ΣQE) / (ΣcAem) arasında bölüm. arka plan gürültü düşük olduğu için ikinci dikkatli maskeleme gerektirmez rağmen, ciddi, gerçek ortalama FRET oranını göz ardı ediyor. Ancak, piksel oranları kayan nokta hesaplama ve İB&#39;leri tanımlamak ve hücre dışına arka plan gürültü üretilen sahte oranları dahil önlemek için hücre alanının dikkatli ikili maskeleme gerektirir. Tüm hücre alanı hücre şekline öngerilme sonuçları önlemek için ölçülebilir olmalıdır. maskeleme hücre şekli ve göç değişikliklere bağlı olarak zamanla yeniden gerekebilir. dışlama kriterleri QE ve hücresel seviyelerinin altına düşmesi ve yakın plan düzeyleri AEM sinyallerden piksel oranlarını kaldırmak için tanımlanan Alternatif olarak, hücrenin daha ROI büyük kullanılabilir. açıklanan analiz yöntemleri ayrıntılı özel yazılım / eklentileri olmadan FRET analizi için bu çalışmada kullanılan temel adımlar. Mikroskop üreticileri ve diğer satıcılar add-on modülü satmakOtomatik oranlı metrik destekleyen ve analiz FRET onların mikroskop yazılımı için s. Aynı şekilde, kamu malı ImageJ yazılım gibi RiFRET olarak parçacık ve FRET analizi için kullanılabilecek birkaç eklentileri vardır. Bir 2D görüntü kullanıldığı için İkincisi, piksel tabanlı ortalama FRET oranı 3D hücresel yapının gerçek ortalama oranını göz ardı ediyor. 2D sinyalleri temsil eden ve Z ekseni boyunca ortalama. Canlı hücrelerde FRET oranlarının 3D mekansal dağılımı hesaplanması yüksek hızlı 3D görüntüleme olmadan mümkün değildir (örn., Kullanarak disk konfokal mikroskopi iplik). Bu 2D ve 3D kültürleri hem de bir sorun, ancak uçağın dışında var olan hücresel yapının daha fazlası gibi 3D büyük bir etkiye sahiptir. Bu tür plazma zarı EPAC1 prob PM-ICUE gibi hücresel yapılar, lokalize problar için büyük bir endişe kaynağıdır. Spiering et al. 2013 önerileri oranı hesaplamaları 24 hücre kalınlığı etkileri düzeltmek için. AEM dağılımının analizi için kullanılabilirSonda ayarlanmış hücre ve görüntüleme uçağın bölgelerinde birikir algılamak. Bu aynı zamanda, FRET oranlarının dağılımını yorumlamak ve sahte sonuçlarını ortadan kaldırmak için yardımcı olacaktır, örneğin., (Düşük AEM bölge düşük prob konsantrasyonuna sahip olacak ve prob doygunluk ve yüksek FRET oranını gösterebilir yani) prob doygunluğu belirlenmesi. Üçüncü olarak, farklı bir FRET bazal seviyeleri, Transfeksiyon etkinliğindeki farklılık gösterir Deney grupları arasında ifade veya bazal sinyal prob olabilir. &quot;Bağıl Analizi&quot; (Adım 10.1.1) varsa zamanla FRET oranında sürüklenme temizlenmesine yardımcı olur. Bu örnekler arasındaki tepkilerin nispi büyüklük karşılaştırılmasını kolaylaştırır, ancak referans numunesi için tepki (kontrol arsa düz bir çizgidir) zaman-ders karşılaştırma engellemektedir. &quot;Mutlak Analizi&quot; (Adım 10.1.2) örneklerin arasında yanıtın oranı karşılaştırılmasını kolaylaştırır, ama her satırı bir dissim tarafından ölçekli çünkü yanıtın büyüklüğü karşılaştırılmasını engellemektedirIlar sabiti. Çalışmalar genellikle zaman içinde FRET oranında sürüklenme düzeltmek için başlangıçtaki bir lineer regresyon kullanın. tarif 3D FRET yöntemi imal ve diğer prob ve görüntüleme yöntemleri uygulanabilir hücre yüklü 3D hidrojeller, zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için yararlı ve pratik yoludur. yukarıda tartışıldığı gibi tek zincirli ikili sondalar yanında diğer FRET sistemi, yoğunluk tabanlı sinyallerin daha karmaşık düzeltme yapılması gerekir. Alternatif olarak, FRET (FLIM-FRET) floresans süresi görüntüleme sensörü verici emisyon ömrü bir değişiklik ile FRET verimliliği hesaplamak için kullanılabilir. Yoğunluk tabanlı FRET aksine, Flim-FRET arka plan gürültüsü, spektral kanaması-through, kuantum verimliliği ve dedektör spektral duyarlılık 2 duyarsız. Ancak, Flim sistemler, pahalı, karmaşık ve nadir olan ve tek üs çürüme ile fluorophores ve hiçbir Flim 49 run-off ile iyi çalışır. tarif edilen yöntem aynı zamanda mo ile kullanılabilecektirgelişmiş mikroskop platformları yeniden (örn., FRET TIRF, floresan anizotropi ve spektral korelasyon FRET). yüksek hızlı konfokal ve multiphoton mikroskobu ile 3D görüntüleme için bu yöntemi uygulamak sinyal yanıt alt hücresel dağılımı analizi kolaylaştırmak ve analiz sinyal doğruluğunu artıracaktır. Bu 3D FRET yöntemi simüle 3D hücresel mikroçevrelerde gelişmiş hücre biyolojisi çalışmaları sağlayacaktır. Bu nedenle, hali hazırda, farmakoloji ve hücreler arası sinyal okuyan ve lamine hidrojel bazlı microtissues ilaç tepkisi tarama içeren rejeneratif tıp ihtiyaçlarına uygulanabilir.

Hücresel sinyal karmaşık ve farmakoloji, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp gibi bir çok alana ilişkin netice hem de. Faydalı araştırma araçları hücre biyolojisi anlayışımızı ilerletmek için ve doku rejenerasyonu için optimal malzemeler geliştirmek için gereklidir. Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme reseptör aktivasyonu, moleküler yapısındaki ve canlı hücrelerde supramoleküler etkileşimler (örneğin., Protein / DNA kompleksi oluşması) analizi sağlayan önemli bir araçtır. FRET floroforlar 1 ila radyatif olmayan enerji transferi türüdür. Bir verici florofor ve alıcı florofor arasındaki mesafenin altıncı gücüne ters orantılı olan bir verimliliğe sahiptir. (- 10 nm tipik olarak 1) 2 Bu nedenle, nanometre ölçeğinde iki farklı moleküller arasındaki ya da bir molekülün bölgeler arasında mekansal mesafe hakkında bilgi verebilir. donör ve alıcı fluorophores farklı m olabilirolecule türleri donör yüksek enerji emisyonu (kısa dalga boyu) sahip olduğu (hetero-FRET), ya da aynı tip (homo-FRET). FRET Görüntüleme sabit veya canlı hücreler üzerinde yapılabilir, ancak yüksek hızlı konfokal sistemleri kullanılamaz olduğunda genel olarak sabit hücreler yüksek uzaysal çözünürlükte moleküler etkileşimlerin görüntüleme için kullanılır. Canlı hücreler tepki 3 sinyalizasyon gerçek zamanlı hücre içi olarak inhibe veya fiksasyon değişmiş etkileşimleri ve süreçleri incelemek için kullanılır. istihdam Canlı hücre çalışmaları nedeniyle sadelik ve alt arka plan (düzlem hücre dışına hiçbir emisyon) bir parçası görüntüleme kullanacağım iki boyutlu (2D) hücresel kültürleri FRET. Bununla birlikte, 2B kültürleri de fizyolojik mikro ve üç boyutlu (3D) kültür 4,5 kıyasla birçok hücresel prosesleri değiştirebilir. Örneğin, hücre dışı matris etkileşimlerine hücre ve hücre yerli hücre ölçüde EAS giden 2B kültür içinde değiştirilirily hücre morfolojisi ve polarite 6 değişiklikleri gözlemledi. Bu iskelet parçaları 7,8 ve hücre şekli ve hücre iskeleti yapısı güçlü mekansal kültür ortamında 9 düzenlenir bağlamak için membran mikro (örn., Kaveolanın ve lipid sallar) ve reseptör sinyal kuvvetli kısmen kültür ortamı tarafından düzenlenir. Mechanotransduction sadece 3D matriks tarafından etkilenmiş, ancak daha karmaşık ikincil yükleme koşulları 2D kültürleri 10 oranla 3D ortamlarda doğurduğu değildir. Son olarak, 3D matrislerin geçirgenliği difüzyon azalmış ve 2B kültürlerine kıyasla sinyal molekülleri hücrenin artan bağlama ile, genel olarak, kültür ortamı daha azdır. 3D kültürlerle bir yapıştırıcı, kimyasal ve mekanik ipuçları ile ilgili fizyolojik daha benzer bir mikro oluşturmak ve gözlemlemek mümkün değildir. Hücre etkileşimleri hücre teşvik edilebilir ve yapışkan özellikleri W kontrol edilebilir3D malzemenin 11-13 yapısı, kompozisyonu ve mimari (desenleme) i. Malzemenin mekanik özellikleri de aynı şekilde, bileşim ve yapı 14,15 ile ayarlanabilir. Hidrojeller hücreleri Kültürleme bu nedenle izin aksi de-ayırt etme olur birincil hücre veya konvansiyonel teknikler kullanılarak fenotip değişim, örneğin üzerine çalışmalar FRET., Eklem kıkırdağının hücreleri. Bu durumda, bir yöntem olup, canlı 3D kültürlerde FRET tahlilleri sağlamak için gereklidir. Onlar optik şeffaf ve mikro kontrol etmek ve hücresel ipuçları sağlamak için uygun olabilir çünkü hidrojel iskeleleri 3D FRET tabanlı çalışmalar için idealdir. Doğal polimerlerden yapılan Hidrojeller jelatin ve fibrin 16 de dahil olmak üzere on, hücre kültürü kullanılmıştır. Hücresel mikro üzerinde daha fazla kontrole Bu polimerlerin kimyasal değişiklik ile ve sentetik polimerler 17,18 kullanımı ile elde edilebilir. hydrMekanik sertliği Ögel ve geçirgenlik polimerik bileşiminin değiştirilmesi ile kontrol edilebilir ve boyut (polimer ve çapraz bağlama yoğunluğunu) 19,20 örgü. Bundan başka, hidrojeller, büyüme faktörleri ve hücre ligandlann eklenmesi vasıtasıyla biyoaktif yapılabilir. Çünkü bu olasılıklar, biosensörleme, ilaç dağıtım ve doku mühendisliği uygulamaları için hidrojellerin geliştirme araştırma 21 çok aktif bir alandır. Hidrojellerin 3D baskı da mikro-dokuların imalatı için geliştirme çalışmaları ve 15 -organs edilir. Bu nedenle, hidrojeller hücrelerin FRET görüntüleme fizyolojik hücre davranışını tahmin etmek için bir araç olarak yararlı, aynı zamanda çalışma ve mühendislik doku büyümesini optimize etmek için, bir araç olarak değil sadece. İkili rasyometrik FRET probları sinyal iletimine eğitim çok yararlıdır ve hidrojel kültürlerde kullanılabilir. yayınlanan floresan kısmi listesi ve sondalar FRET, Hücre Göç Consortium web sitesine bakın <sup&gt; 22. En yaygın prob tipi bir tanıma eleman (lar) (analit hassas bölge) ile ilişkili veya bağlantılı iki farklı flüorofor içerir. Bu bölgeler fluorophores ve bu nedenle FRET büyüklük (ya daha yüksek ya da daha düşük) arasındaki mesafeyi değiştirir (bir iyon veya molekül bölgenin enzimatik bölünme bağlanması, örn.) Analitin saptanması üzerine bir yapısal değişim, ilişkiyi, ve ayrılmayı geçmesi 23. Daha az yaygın ama kullanışlı prob tipi FRET büyüklüğünü değiştirir iki fluorophores spektral örtüşme, bir analit duyarlı değişim dayanır. &quot;Tek zincirli&quot; rasyometrik problar tek bir molekül üzerinde bağlanmış bir flüorofor çifti kullanmaktadır. &quot;Çift zincirli&quot; Problar farklı moleküller üzerinde florofor çiftleri kullanan, ancak sentezleme aynı ekspresyon kaseti 24&#39;e bağlanabilir. Tek fluorofor ifade ile çalışmalar (örn., Floresan füzyon proteinleri), çalışmalar oranlı metrik aksineFRET Probes transfeksiyon verimliliği ya da hücre canlılığında kontrol etmek için, çift transfeksiyon gerektirmez. Asgari eşik (hassas konsantrasyon) 23,25 üzerinde sentezlendiğinde oranlı metrik FRET probları transfeksiyon verimi nispeten duyarsızdır. Onlar uyarım kaynağı dalgalanmaları ve diğer hücre içi çevre faktörleri (örn., PH, iyonlar) çok uzun hem fluorophores benzer duyarlı olarak duyarsızdır. Floresan ve biyolüminesens promotör-muhabir 26,27 yapıları aksine ek olarak, tepki, transkripsiyonel gecikmeye tabi değildir. Oranlı metrik FRET probları kolay ve sık sık geleneksel widefield Epifloresans mikroskop sistemleri kullanılmaktadır. Widefield mikroskoplar çünkü sistem maliyeti, fluorofor ağartma ve yeterli zamansal çözünürlüğe sahip sinyal değişikliklerinin yakalanması ilişkin endişelerin canlı hücre görüntüleme için çizgi tarama konfokal sistemleri tercih edilir. Buna ek olarak, tek bir hücre Analhücrelerin büyük bir nüfus üzerinde Salman kararı görünümünün birden alanlar üzerinde bir motorlu sahne ve görüntü yakalama ile mümkündür. Widefield mikroskopi hetero-FRET prob sinyallerinin yoğunluğu bazlı analizini gerektirir. Yoğunluk analizi diğer FRET yöntemler gibi karmaşık donanım gerektirmez rağmen, daha alım sonrası çalışma fluorofor davranışları ve mikroskop / görüntüleme sistemi konfigürasyonları 28 etkilerini düzeltmek için gereklidir. Bir florofor yakalanan emisyon yoğunluğu uyarım enerji fonksiyonu floroforu kuantum verimi ve kombine filtre ve kamera / detektör spektral duyarlılık ve doğrusallık 2&#39;dir. Bu verici ve alıcı için farklı olabilir ve kantitatif analiz için kalibrasyon gerektirir. Buna ek olarak, alıcı emisyonu görüntüleme (donör ikaz ışığı ile alıcısı uyarma ve kanama-through donör emisyonunun akseptör emisyon spektrumları içine) fluorophores spektral örtüşme etkilenir 2.4 Tek zincirli çift zincirli &quot;prob bir hücre 25,28 boyunca farklı stoichiometries var olabilir ise flüoroforların.&quot; &quot;Probları flüoroforlar ise, kendi flüoroforlar nano ekimolar, çünkü iç normalleştirilir&quot; tek zincir &quot; problar içindeki parlaklık (ekstinksiyon katsayısı ve kuantum verimi fonksiyonu), doğrusal olmayan, detektörün hassasiyetindeki etkileri eşiğe ve 23 gereklidir bağlanmış kuantum verimi / detektör duyarlılığı için küçük ve sadece düzeltilmesidir vardır. Bu nedenle &quot;tek zincirli&quot; oranlı metrik FRET probları en kolay widefield mikroskopi 24 uygulanmaktadır. Bu kağıt, geleneksel geniş açılı epifluorescent mikroskop kullanarak 3D hidrojel kültürlerde canlı hücrelerin FRET görüntüleme gerçekleştirmek için basit bir yöntem açıklanır. Kolayca zaten 2D FRET deneyler, hem de Inter ile ilgilenen laboratuarlar yürüten laboratuarları tarafından kabul edilebilirmicrotissues hücresel sinyal. Burada siklik adenozin monofosfat (cAMP) foto-çapraz içinde canlı kondrositlerde seviyeleri (PC-jel, polietilen glikol dimetakrilat) ve thermoresponsive (TR-jel, Matrigel) hidrojellerinin arasında FRET görüntüleme göre ölçüm yöntemini göstermektedir. Bir rasyometrik FRET prob forskolin, cAMP ATP dönüşümünü katalize adenilat siklaz için bir kimyasal agonist yanıt olarak cAMP seviyelerini tespit etmek için EPAC1 (ICUE1) göre kullanılmaktadır. cAMP G-protein kenetli reseptör sinyalini aracılık başlıca ikinci haberciler biridir ve doğrudan cAMP (EPACs) tarafından aktive aşağı değişim proteinleri dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin, aktive eder. flüoroforlar cAMP FRET bir azalma ile sonuçlanan EPAC alanına bağlanması üzerine birbirinden ayrılır. 3D hidrojeller hücre hidrojel malzemelerin hazırlanması, ICUE1 probuyla birlikte hücre transfeksiyon ve gömme burada açıklanmıştır. 3D FRET Deney prosedürü ve gerekli görüntü analizihücre başına sonda etkinliği açıklanmıştır değerlendirmek. Biz de widefield mikroskopi kullanılarak 2D ve 3D FRET analizi doğasında sınırlamaları tartışmak. Bir daha fizyolojik bağlamda analiz sağlar ve daha az görüntü düzeltme ve kalibrasyon gerektirmeyen beri burada sunulan teknik mevcut 2D yöntemleri üzerinde bir gelişmedir. Büyük yardımcı hücresi ve transfeksiyon tercihleri ​​korunabilir ise birçok şeffaf malzemeler kullanılabilir gerçeğinde yatar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td>
			<td style="width:119px;">NC0162601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td>
			<td style="width:71px;">Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95904</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6514</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">440167</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">149470-5g</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC244280100</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC149670010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC199871000</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">190764</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sigmacote (siliconizing reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">SL2</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Toluene&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC36441-0010</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH3025601</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11058-021</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cellstripper (cell dissociation solution)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-056-CI</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Forskolin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td style="width:167px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipette Tips (10,200,1000 &#956;l)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Powder Free Examination Gloves</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-149-863B</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">01-213-100</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Biopsy punch (3 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">3332</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544C</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Precoated glass coverslips (epoxysilane)</td>
			<td style="width:71px;">Arrayit</td>
			<td style="width:119px;">CCSL</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12550D</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile vials (15 mL, 50 ml conical)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-70C, 14-959-49A</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish (6-well)</td>
			<td style="width:71px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351146</td>
			<td style="width:167px;">Disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epifluorescent Microscope with motorized stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Adjustable Specimen Holder for XY Stage</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">77011393</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MRD01605</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source &#38; wheel, Lambda emission filter system)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Sutter Instrument reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77016231, 77016088</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">CYF/YFP filter set</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Chroma Technology Corp)</td>
			<td style="width:119px;">77014928</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon (Hamamatsu reseller)</td>
			<td style="width:119px;">77054076</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab-equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MQS31100&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Prism (spreadsheet and graphing software)</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software, Inc</td>
			<td style="width:119px;">Version 6</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (&#955;=365 or 405)</td>
			<td style="width:71px;">OmniCure</td>
			<td style="width:119px;">S1000</td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pipette Aid&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DP-100</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:71px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Reichert Bright-Line 1475</td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vacuum desiccator chamber/degasser&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Chemical Fume Hood&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Oven</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Spatula</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Beaker</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Large/non-disposable lab equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fret imaging in three-dimensional hydrogels

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücre biyolojisi incelemek için güçlü bir araçtır. FRET kullanan Çalışmalar genellikle üç boyutlu (3D) hücresel mikro taklit değil iki boyutlu (2D) kültür, istihdam. 3D hidrojel ortamında hücrelerin geleneksel widefield Epifloresans mikroskopi kullanılarak söndürüldü emisyon FRET görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem sunulmuştur. Burada sonda aktivasyon aralığında lineer oranlarını verir rasyometrik FRET prob için bir analiz yöntemi tarif edilmektedir. intraselüler siklik adenosin monofosfat (cAMP) seviyesi ölçümü, EPAC1 aktivasyonu (ICUE1) ve hidrojel malzeme tipi, bu tarifnamede, bir foto-çapraz hidrojel (PC jel bağımlı sinyal cAMP farklılıkları tespit etme yeteneği için bir sonda kullanılarak forskolin stimülasyon altında kondrositlerde gösterilmiştir polietilen glikol dimetakrilat) ve thermoresponsive hidrojel (TR-jel). 2D FRET yöntemleri ile karşılaştırıldığında,Bu yöntem çok az ek çalışma gerektirir. Zaten 2D FRET görüntüleme kullanan laboratuvarlar kolayca 3D mikro-hücresel çalışmalar yapmak için bu yöntemi kabul edebilirsiniz. Bundan başka, işlenmiş 3D microtissues yüksek verimlilik gösteren ilaç tarama uygulanabilir. Buna ek olarak, bu tür anizotropi ölçümü ve floresans ömrü görüntüleme (FLIM) gibi ileri mikroskopi konfokal kullanarak platformlar, darbeli ya da modüle edilmiş aydınlatma ile FRET görüntülemenin diğer formları, uyumludur.

Tüm hidrojel ön hücreler, döküm kalıpları yukarıda tarif edildiği gibi hazırlandı. Hücre yüklü habercisi çözümleri PDMS kalıplara döküm ve sonra lamel yakın hücreleri hareketsiz ve üzülmek görüntüleme analizi (Şekil 1) kolaylaştırmak için foto-/ jelleşme önce santrifüj edildi. Ekli lamelleri ile hidrojellerin mikroskopik görüntüleme (Şekil 2) için hazırlanan PDMS görüntüleme kuyuları içinde yerleştirildi. Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi optik konfigürasyonlar ve görüntü elde parametreler belirlenmiştir. İkili-olmayan problar için gerekli olduğu gibi CFP YFP fluorofor çiftleri için dört FRET ilgili görüntü kanallarının Yakalama, altında (bakınız &quot;Optik Conf.&quot; Şekil 3&#39;te) gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmada sadece iki resim tek zincirli ikili ICUE1 prob, QE = &quot;CFP CFP&quot; ve AEM = &quot;YFP YFP&quot; (uyarma emisyon) için gereklidir. Çoklu FOVs (xy konumus) birçok hücre homojen aydınlatma alanı (Şekil 3B) içindeki ikamet ettiği seçilmiştir. zaman atlamalı kazanılmasından sonra, prob için sinyal veri ihraç edildi. ROI kanallı sinyallerin arka plan düzeltmesi ve hücre analizi için deney (Şekil 4) başlangıcından eşiklenir AEM görüntüleri kullanılarak tayin edildi. Hücreler ifade gibi hücre havuzu arasından seçildi yeterli (çok loş değil), ama çok yüksek değil (aşırı parlak) prob (Şekil 4B). Her edinilmesine piksel başına QE ve SE FRET oranları arka plan çıkarılır görüntü kanallarının floating-point bölümü kullanılarak hesaplandı. Hücre başına ortalama FRET oranı (yani, ROI başına) hesaplandı uyarım öncesinde bazal sinyaline normalize (yani, her zaman noktalarında çıkarılır bazal bir regresyon) ve standart hata olarak hata barları ile çizilen ortalama (SEM). QE ve CSE tabanlı FRET oranları de her ikisi deforskolin uyarılması (100 nM, Şekil 5) altındaki kondrositlerde artan cAMP aktivitesi korunmalıdır. QE sinyali nedeniyle hidrojellerin içinde gömülü kondrosit cAMP aktivitesi düşük bazal seviyeye düşük olduğundan QE FRET oranı CSE FRET oranından daha arka plan düzeltme daha duyarlı idi. Hem hidrojel türleri (TR-jel ve PC-jel) forskolin ilave bir artış, cAMP sinyal yanıtını gösteren zaman FRET oranında bir artış (Şekil 6), gösterdi. QE FRET oranı ile gösterildiği gibi, PC-jel hidrojeller kondrositlerin cAMP daha büyük bir değişiklik (gösterilmemiştir) ve cAMP (E QE daha yüksek bir taban seviyesini gösterir = E QE = TR-jel içinde 0.09 vs PC-jel içinde 0.19, ) temel çıkarılan resimde gösterildiği değil. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> Şekil 1: Photocrosslinked Hidrojel (PC-jel) Hücre Dağılımı </strong&gt; A: Hücre yüklü hidrojel habercisi lamel yakın bir odak düzleminde hücrelerin sayısını arttırmak için santrifüj edildi. B: Bu FOV hücrelerin sayısını artırır ve düzlem hücrelerin üzerinden arka plan sinyalinin en aza indirir. (Ölçek çubuğu = 200 mikron) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> Şekil 2: PDMS Bulaşık Hidrojel Hidrojel mikroskopik görüntülemesi ve analit uyarılması için bir lamel baz ile yüksek bir PDMS de (hidrojelin 10x hacim) içine yerleştirilmiştir. bu deneyde boyunca yerinde kalması için PC jel hidrojellerin şeffaf ve lamel bağlanmaktadır. PDMS ayrıca en ek olarak daha geniş bir biyopsi zımba kullanılarak hidrojel hacmi 10 kat daha fazla orta içeren daha büyük yapılabilmektedirhicker PDMS levha. (Ölçek çubuğu = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> Şekil 3: FRET Görüntüleme için Edinme Yapılandırma A: iktisap birden çok yerde görüntü yakalamak için her 7 saniyede yapılandırıldı. QE FRET oranı hesaplamasına sadece iki görüntü kanalları altında burada kullanılan ICUE1 probu (ikili tek zincirli prob), QE = &quot;OBP OBP&quot; ve AEM = &quot;YFP YFP&quot; (uyarma emisyon) için gerekli olan &quot;Optik Conf.&quot; mikroskop yazılım λ sekmesinde sütun. B: FOVs ( &quot;XY&quot; pozisyonlar) birçok hücre homojen aydınlatma alanı içinde ikamet ettiği seçilmiştir. Resmin altındaki arsa mavi boyunca aydınlatma yoğunluğu hattını oklu gösterirBu FOV merkezi aracılığıyla erişir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> Şekil 4: FRET Görüntüleme Analizi ROI Seçimi A: Hücrelerin serbest faiz (ROI) bir bölge her kanalda arka plan sinyali düzeltmek için seçildi. hücresiz hidrojel yerine bir resim hücre yoğunluğu veya geçiş yüksekse, ya da hücrelerin homojen bir aydınlatma alanı içinde yer olmadığında gölgelendirme maskesi kullanılmazsa geri çıkarma için de kullanılabilir. B: Hücre ROI görüntü eşikleme ve AEM kanalının ikili maskeleme kullanılarak seçildi. nedeniyle arka plan n üretilen hücre dışı oranlarının eklenmesi nedeniyle olumsuz hücre başına ortalama FRET oranının hesaplanmasını etkileyecek hücrelerden daha büyük bir ROI seçmeoise. Bu oran hafife olarak, hücre başına her kanalın ortalama kullanarak selüler FRET oranının hesaplanması önerilmemektedir. (Ölçek çubuğu = 50 um) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> Şekil 5: Thermoresponsive Hidrojel (TR-jel) içinde FRET Oranlarının Karşılaştırılması QE ve SE tabanlı FRET oranları Hem forskolin stimülasyon altında kondrositte artan cAMP aktivitesini algılar. Forskolin cAMP üretimini indükleyen bir adenil siklaz agonistidir. ICUE1 prob cAMP&#39;yi bağlandığında FRET azalır ve böylece QE FRET oranı (E QE = SQE / (SAEM QS x)) artar. Tersine, SE FRET oranı azalır ve böylece E SE = 1 olarak çizilir - CSE / SAEM. hidrojel gömülü kondrositlerde, QE FRET oranı düşüklüğü nedeniyle bazal cAMP etkinliği SE FRET oranından daha arka plan düzeltme QE sinyali düşük olduğundan daha duyarlıdır. Hata çubukları = SEM, n = 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> Şekil 6: Farklı Hidrojeller içinde FRET Oranının Karşılaştırılması Her iki hidrojel tipler kondrositler zaman içinde artış QE FRET oranı gösterdiği gibi, cAMP aktivitesi bir artış ile forskolin uyarılmaya yanıt verdi. Hidrojel tipi etkiler forskolin ve bazal hücre cAMP aktivitesi geçirgenlik farklılıkları dahil olmak üzere çeşitli etkileri vasıtasıyla hücresel yanıtı (E QE = E QE vs PC-jel içinde 0.19 = 0.09, TR-jel içinde, gösterilmemiştir). Hata çubukları = SEM, n TR-jel= 25, n PC-jel = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı hücre biyolojisi çalışmaları için güçlü bir araçtır. Burada alışılmış epifloresans mikroskopi kullanılarak fizyolojik üç boyutlu (3D) bir hidrojel mikro çevrelerinde FRET görüntüleme hücreleri için bir yöntem sunulmaktadır. Aktivasyon aralığında doğrusal oranlarını verir oranlı metrik FRET probları için bir analiz anlatılmıştır.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

fret-imaging-in-three-dimensional-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

13.0K Görüntüleme.  University of Pittsburgh.  Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı hücre biyolojisi çalışmaları için güçlü bir araçtır. Burada alışılmış epifloresans mikroskopi kullanılarak fizyolojik üç boyutlu (3D) bir hidrojel mikro çevrelerinde FRET görüntüleme hücreleri için bir yöntem sunulmaktadır. Aktivasyon aralığında doğrusal oranlarını verir oranlı metrik FRET probları için bir analiz anlatılmıştır. 

Video: FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Biyoloji

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Üç boyutlu Hücre ekimi için Chip-ölçekli Yapı iskeleleri mikroimalat

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

Proteolytically Bozulmuş Aljinat Hidrojeller ve Porcine Oosit Kapsülleme için Hidrofobik Mikrobiyoreaktörler

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

Üç Boyutlu Organoid ve Küresel Modellerin Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

Hepatositlerde Organeller Arası Temas Bölgelerinin Seri Kesitli Elektron Mikroskobu Kullanılarak Üç Boyutlu Karakterizasyonu

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...