Bu çalışma # DA15169 HEM hibe NIH tarafından finanse edildi

Usul Genel Bakış: Bu yaklaşımı kullanarak, hücre yüzey proteinleri kovalent (bkz. Şekil 1 kaçakçılığı kısıtlayıcı koşullar (düşük sıcaklık) altında bir Membran geçirgenliği olmayan, disülfit çiftli biyotinilasyon reaktifi (sulfo-NHS-SS-biotin) kullanarak ekstrasellüler lizin kalıntılarının biotin ile etiketlenir örnek olması için). Bir hücre kümesi kaçakçılığı izin şartlarına kaymıştır (37 ° C) ve biotinlenmiş proteinler içselleştirmek. Hücre 1) süresi = 0 toplam yüzey protein, ve 2) sıyırma kontrolü için kontrol olarak düşük ısıda tutulur. Içselleştirilmesi kısa bir süre sonra, hücreleri içselleştirilmesi durdurmak için düşük sıcaklık geri kaydırılır ve herhangi bir kalıntı yüzey biotin disülfit çiftli biotin parçalayarak indirgeyici bir ajan, hücreleri tedavi çıkardı. Biotinlenmiş proteinler hücre yüzeyinde ortaya çıkan ve içselleştirilmiş sıyırma adım korunur ve kalan tek biotinlenmiş proteinler olacaktır. Hücre parçalama, biotinlenmiş proteinler streptavidin afinite kromatografisi ile izole edilir ve ilgi protein kantitatif immunoblotting tarafından algılanır. Endositik oranını belirlemek için, içselleştirilmiş protein miktarı, süresi = 0 etiketli toplam yüzey kontrol etmek için karşılaştırılır. Biz başarıyla nöronal norepinefrin 1 ve dopamin 1-4 taşıyıcılar içselleştirilmesi hızını ölçmek için bu yaklaşımı kullandık. Detaylı Protokol: 1. Gün: <ol><li> 6 Gün 2 ~ 80% konfluent olacağı gibi iyi plakaları Levha hücreleri. Alternatif olarak, transfekte hücreleri kullanılıyor ise, içselleştirme oranı ölçülecek zaman, ~% 80 konfluent olacak şekilde bir yoğunlukta transfect. Hücrelerin kuvvetle yapışık değilse, doku kültürü eşya geniş yıkama adımları sırasında hücre kaybını önlemek için bir hücre adezyon substrat (örneğin poli-D-lisin) ile tedavi edilmelidir. </li><li> Her protein test için, bir plaka üzerinde plaka 2 kuyu toplam yüzey proteini (t = 0) ve sıyırma kontrolleri olarak kullanılabilir. Ikinci bir plaka üzerinde, test edilen her bir içselleştirme durum için iyi bir plaka (yani bazal endositik uyuşturucu tedavi oranı vs.) </li><li> 2. Gün kullanmak için belirtilen sıcaklıklarda aşağıdaki çözümleri ve mağaza hazırlayın: <ul><li> PBS 2 +: Fosfat 1.5 mM MgCl 2, 0.2 mM CaCl 2 (4 ° C) ile desteklenebilir (pH 7.4) tamponlu salin </li><li> Biyotinilasyon Çözüm Quench: PBS 2 + 100 mM glisin (4 ° C) ile takviye </li><li> NT tampon: 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA,% 0,2 BSA, 20 mM Tris, pH 8.6, (4 ° C) </li><li> RIPA tampon: 10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA,% 0.1 SDS,% 1.0 Triton X 100,% 1.0 sodyum deoksikolatın, (4 ° C) </li><li> Sulfo-NHS-SS-biotin stok solüsyonu: 200 mg / ml (-20 ° C), (DMSO) dimethylsülfoksit içinde çözülür </li><li> Tris (2-Carboxyethyl) fosfin hidroklorür (TCEP) stok solüsyonu: 500 mM H 2 O, (-20 ° C, ışığı engellemek için folyo kaplı) </li></ul></li></ol> 2. Gün: <ol><li> PBS 2 + 0.18g/ml glukoz ile desteklenmiş,% 0.2, IgG / proteaz-sığır serum albumin (PBS 2 + b / g / BSA). hazırlayın Pre-sıcak 37 ° C su banyosunda bu çözüm. </li><li> DMSO eritmek için tezgah üstünde sulfo-NHS-SS-biotin stok solüsyonu çözülme. Hemen önce, taze sulfo NHS-SS-biotin solüsyonu (2,5 mg / ml buz PBS 2 + 0.75 için yeterli ml / iyi) hazırlar. DMSO çözünür şiddetle Vortex çözüm. NHS-biotin reaktif sulu çözüm kolayca hidrolize olduğunu unutmayın. Bu nedenle, tüm çözümlerin kullanımı hemen önce hazırlanmış olmalıdır. </li><li> Biyotinilasyon: Yeri plakaları ve soğuk oda, bir buz banyosu, buz PBS 2 ile 3 x 2 ml durulayın . Plakalar biraz tam drenajı ve tampon çözelti çıkarılması için izin açılı olduğu belirli olun. 0.75 ml / her bir kuyunun taze sulfo-NHS-SS-biotin çözüm ekleyin. Inkübe x 15 &#39;, 4 ° C dinç sallayarak buz banyosu. Inkübasyon tamamlandıktan sonra, başka bir taze sulfo-NHS-SS-biotin çözüm hazırlayın. Taze çözüm ve inkübe x 15 &#39;, 4 ° C ile eski bir çözüm değiştirin. </li><li> Quenching ile reaksiyona ve hücre içi protein hücrelerinin parçalanmış bir biotinylate olmaz, böylece olmayan tüm tepki NHS biotin molekülleri söndürülür kritik. Isıl işlem çözümü ile hücre yıkayın ve 3 x 2 ml 2 ml quench çözüm x 15 &#39;, 4 ° C ile nazik sallayarak iki kez kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> İçselleştirme: ilaç tedavileri test ediliyorsa, uygun ilaç konsantrasyonu PBS 2 + b / g / BSA ekleyin. 4 ° C&#39;de kontrol plaka tutun ve içselleştirilmesi plaka soğuk oda çıkarmak. Önceden ısıtılmış PBS 2 ile 3 x 2 ml Yıkama + / g / BSA (+ / - drugs) ve aynı çözümleri (2 ml / iyi) bırakın. Önceden ısıtılmış çözümü ile plaka üzerinde bile sıcaklığını sağlamak için herhangi bir boş kuyu doldurun. 10 &#39;, 37 ° C inkübatör hücrelere aktarın. 37 sonuna kadar hemen önce ° C de inkübasyon, buz üzerinde sıyırma adım ve saklamak için kullanılan NT tampon taze 50 mM TCEP solüsyon hazırlanır. 1.0 ml / kuyu için yeterli miktarda hazırlayın. </li><li> Sıyırma: buz banyosu ve soğuk oda dönmek için hemen transfer plaka (lar). Hücrelerin hızlı bir şekilde buz gibi NT tampon, 3 ile yıkayın endositoz durdurmak için x 2 ml. Ayrıca NT tampon şerit kontrol kuyuları 3 x 2 ml yıkayın. Her kuyuya 1.0 ml taze sıyırma çözüm ekleyin. Nazik sallayarak, 15 &#39;, 4 ° C buz üzerinde inkübe edin. Taze sıyırma çözeltisi ile kuyu değiştirin ve buz üzerinde ek bir 15 &#39;, 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Lizis: sıyırma çözüm, 3 x 2 ml NT tampon maruz kalan tüm kuyuları yıkayın. Sonra tüm kuyuları (toplam kontrolleri de dahil olmak üzere) 3 x 2 ml PBS 2 + yıkayın. 300μl/well RIPA tampon taze proteaz inhibitörleri (1.0 mM PMSF, 1.0 mikrogram / ml her leupeptin, aprotinin ve pepstatin) içeren (veya uyumlu diğer lizis tamponu ilgi protein) Lyse. X 20 &#39;, 4 ° C sallayarak tarafından Lyse 18.000 xg, 10 &#39;, 4 ° C santrifüj mikrofuge&#39;de tüpler ve net hücresel enkaz Transfer </li><li> Protein konsantrasyonunun belirlenmesi: lizis koşulları (örneğin DC protein tayini, Bio-Rad) ile uyumlu bir protein testi standart bir BSA eğrisine göre lizatları protein konsantrasyonu belirlemek için kullanın. </li><li> Streptavidin afinite kromatografisi: Her bir örnek için eşdeğer miktarda protein mikrofuge&#39;de tüpleri hazırlayın . Her numune son hacmi 200μl getirmek için lizis tamponu ekleyin. Vortex streptavidin agaroz boncuk şiddetle hatta süspansiyon getirmek. 200μl ucu ile bir pipet kullanarak her bir tüpe, pipet boncuk kesti. Önerilen 20μl beads/50 mikrogram lizat. Bir tüp rotator gecede, 4 ° C inkübe edin. </li></ol> 3. Gün: <ol><li> Boncuk yıkama: Santrifüj örnekleri, 18.000 xg, 2 &#39;boncuk toplamak için. Aspiratör ile boncuk pelet yaklaşım dikkatli olmak, lizat kapalı aspire. Daha iyi kontrol için aspiratör ucunda plastik bir pipet kullanın. Her bir tüp 0.75 ml lizis tampon, boncuk yıkamak için vorteks ekleyin. Santrifüj örnekleri, 18.000 xg, 2 &#39;, boncuk ve tekrar aspirasyon toplamak ve iki kez (toplam üç yıkar) yıkama. Son yıkamadan sonra, boncuk pelet rahatsız etmeden, mümkün olduğunca tampon kadar aspire. Aspiratör doğru tüp Devrilme bu adımı ile yardımcı olur. </li><li> Örnek elution: Her bir tüp 20-25μl 2x Laemmli örnek tamponu (azaltarak) ekleyin . Indirgen solüsyon içerisinde izole proteinleri serbest tutunmaya, NHS-SS-biotin disülfit bağı olacak. Çoğu zarı proteinleri haşlanmış kümeleme için son derece savunmasız ve SDS-PAGE jeller yüklemeden önce ısıtılmış olmamalıdır. Bu deneylerin gerçekleştirmeden önce ilgi protein ısı duyarlılığı belirleyin. Protein / kaynama ısıtma tahammül edemiyorsanız, SDS-PAGE ile analiz etmek için önce bir rotator, 30 &#39;, oda sıcaklığında inkübe edin. Bu tutunmaya disülfit bağı için yeterli ve proteinler Zehir. </li><li> SDS-PAGE ve immunoblotting: SDS-PAGE ile ayrı protein vardır. Her bir örnek için, aşağıdaki sırayla örnekleri çalıştırmak için en kolay: toplam yüzey protein uygun antikor (zaman = 0), şerit, içselleştirme durumu # 1, Durum # 2, vb immunoblotting için membran Transfer ve leke çıkar. Doymuş piksel olduğunu belli, bir CCD kamera jel dokümantasyon sistemi kullanarak immunoreaktif bantları yakalayın. Jel analizi / dansitometri yazılımı kullanarak her bir bant yoğunluğu niceliğini. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Bir temsilci immunoblotting sonucu Şekil 2A gösterilmiştir. Içselleştirilmesi için önce toplam miktarın yüzey proteini olan &quot;toplam&quot; şeritli (T), en güçlü sinyali. &quot;Strip&quot; kontrolü (S) ideal boş, şerit deneme için etkin olduğunu göstermektedir yakın olmalıdır. &quot;Toplam&quot; sokağın &quot;strip&quot; sokağın yoğunluğunu karşılaştırarak şerit verimliliği hesaplanır (örneğin şerit ile paralel biotinlenmiş olan protein, ama ne 37 ° C ısınmış ne sıyırma çözüm maruz kalmıştır). Bunun için aşağıdaki formül kullanılır: [1 - (şerit / toplam)] * 100% Bu formül kullanılarak, Şekil 2 şerit,% 99.8 verimli oldu. Son olarak, içselleştirme kulvarda toplam (lar) (I) daha az yoğunluk bantları göreceksiniz. Örnek (Şekil 2), araç veya 10 sırasında 1 mikrona kadar phorbol miristat asetat (PMA) ile muamele edilen hücreler ilk içselleştirilmesi süre tedavi edildi &#39;içselleştirme ve dopamin taşıyıcı içselleştirilmesi oranları 10 ölçüldü. Içselleştirme oranı olarak hesaplanır.aşağıdaki gibidir: * 100 toplam / içselleştirilmiş Şekil 2B görüldüğü gibi araç-tedavi edilen koşullar altında,% 10.4 yüzey DAT 10 &#39;üzerinde içselleştirilmiş. PMA tedavi% 23.2, toplam yüzey DAT DAT içselleştirilmesi oranları arttı. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Protokolü resimde. Hücreleri 4 biotinlenmiş ° C yüzey nüfusunun özel etiket ve 37 kaydırılır ° C içselleştirilmesi başlatmak için. Içselleştirilmesi ardından, hücreler hızla endositik süreçleri ve kalan yüzey biotin durdurmak için soğutulmuş bir indirgen olan hücreler tedavi ayrılır. T = 0 yüzey ortaya çıktı ve içselleştirilmiş, sıyırma tedavi böylece onları koruyan kalır sadece biotinlenmiş proteinler. Biotinlenmiş proteinler streptavidin boncuklar ile toplu afinite kromatografisi ile izole edilir ve ilgi protein immunoblotting tarafından algılanır. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. PKC aktivasyon DAT endositik oranı artar. İçselleştirme tahlil. Stably DAT ifade PC12 hücreleri biotinlenmiş, 4 ° C &quot;Ayrıntılı Protokolü&quot; nde açıklandığı gibi. Hücreler hızla 37 kaynaştı ° C ± 1 mcM PMA ve inkübe 10 &#39;, 37 ° C Artık biotin azaltarak elimden, streptavidin afinite kromatografisi hücrelerinin parçalanmış ve biotinlenmiş proteinler izole edildi. (A) Temsilcisi immunoblotting toplam yüzey DAT gösteren t = 0 (T), şerit kontrolü (S) ve belirtilen koşullar altında içselleştirilmiş DAT (I). (B) Gruplar bir CCD kamera ile çekilen ve Miktar Veri yazılımı (Bio-Rad) ile ölçüldü. Veri% toplam DAT internalized/10 dakika olarak ifade edilir. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Örnek immunoblotting, fakir bir biotin şerit. İçselleştirme tahlil tasvir . Stably DAT ifade PC12 hücreleri biotinlenmiş, 4 ° C &quot;Ayrıntılı Protokolü&quot; nde açıklandığı gibi. Hücreler hızla 37 kaynaştı ° C ve inkübe 10 &#39;37 ° C. Artık biotin azaltarak elimden, streptavidin afinite kromatografisi hücrelerinin parçalanmış ve biotinlenmiş proteinler izole edildi. Immunoblotting toplam yüzey DAT t = 0 (T), şerit kontrol (S) ve içselleştirilmiş DAT (I). Kötü şerit verimlilik göstergesi görünür bant, şerit kontrol şeritte unutmayın.

<ol>
	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

Ortak sorunları: Bu deneylerde ortaya çıkan en sık karşılaşılan sorun, kötü şerit verimliliği . Şerit verimliliği sonuçları yorumlamak mümkün kritik. Şerit, son derece verimli olduğu sürece, içselleştirme şerit herhangi bir biotinlenmiş proteinler yüzeye içselleştirilmiş, aslında olduğu sonucuna varılması mümkün değildir. Şeritler ≥% 90 verimliliği en uygun olan ve şerit bu seviyenin altına düşerse herhangi bir sonuç atmak. Fakir bir şerit bir örnek Şekil 3&#39;te g...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

Plazma zarı proteinleri, reseptörler, iyon kanalları ve pompaları oluşan proteinlerin büyük bir, çeşitli grup. Faaliyet bu proteinlerin besin teslimat, hücresel heyecanlanma, kimyasal ve sinyalizasyon dahil olmak üzere önemli hücresel olayları, çeşitli sorumludur. Birçok plazma zarı proteinleri protein yüzey ekspresyonunu değiştirerek protein fonksiyonu modüle endositik kaçakçılığı, dinamik tarafından düzenlenir. Protein endositoz kolaylaştıracak mekanizmalar karmaşıktır ve birçok membran proteinlerinin tam olarak anlaşılmış değildir. Verilen bir protein endositik kaçakçılığı kontrol mekanizmaları tam olarak anlamak için, protein endositik oranı tam olarak ölçülebilir kritik öneme sahiptir. Birçok reseptörleri için doğrudan endositik hızı ölçümleri sıklıkla etiketli reseptör ligandlar kullanılarak elde edilir. Ancak, taşıyıcılar, pompalar ve iyon kanalları gibi birçok sınıflar, membran proteinlerinin, endositik hızını ölçmek için kullanılabilir uygun ligand var. Bu raporda, dopamin taşıyıcısı (DAT) endositik oranını ölçmek için kullandıkları bir geri dönüşümlü biyotinilasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, içselleştirme oranlarını ölçmek için basit bir yaklaşım sağlar ve kolay bir çoğu membran proteinlerinin kaçakçılığı çalışmaları için istihdam edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation at JoVE.com

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

measuring-plasma-membrane-protein-endocytic-rates-reversible

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Görüntüleme.  University of Massachusetts Medical School. Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Video: Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biyoloji

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

Di-8-ANEPPS ile İndüklenmiş Membran Gerilim Ölçme

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...