עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH # DA15169 אל שולי

נוהל סקירה: בגישה זו, משטח חלבוני התא מסומנים קוולנטית על זמין ליזין ושאריות תאית באמצעות impermeant קרום, דיסולפיד מצמידים מגיב biotinylation (sulfo-NHS-SS-ביוטין) בתנאים מגבילים סחר (כלומר בטמפרטורה נמוכה) עם ביוטין (ראה איור 1. להמחשה). קבוצה אחת של תאים מוסט לתנאי הסחר מתירנית (37 ° C) וחלבונים biotinylated להפנים. קבוצה אחרת של תאים נשמרים בטמפרטורה נמוכה כפקדי לחלבון 1) השטח הכולל בזמן = 0, ו 2) שליטה הפשטה. לאחר תקופה קצרה של הפנמה, התאים מועברים חזרה בטמפרטורה נמוכה כדי לעצור הפנמה, וכל ביוטין משטח שיורי הוא פשט על ידי טיפול בתאי עם סוכן צמצום, אשר cleaves ביוטין דיסולפיד מצמידים. חלבונים Biotinylated שנבעו תא השטח הופנמו מוגנים מפני הצעד הפשטה, ויהיה רק ​​חלבונים biotinylated שנותרו. בעקבות תמוגה התא, חלבונים biotinylated מבודדים על ידי streptavidin זיקה כרומטוגרפיה ואת החלבון של עניין הוא זוהה על ידי immunoblotting כמותי. כדי לקבוע את שיעור endocytic, בכמות החלבון הפנימו מושווה לשלוט על השטח הכולל שכותרתו בזמן = 0. השתמשנו בהצלחה בגישה זו כדי למדוד את קצב ההפנמה של נוראפינפרין ודופאמין העצבית 1 מובילי 1-4. פרוטוקול מפורט: יום 1: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים 6 צלחות גם כאלה שהם יהיו ומחוברות ~ 80% ביום 2. לחילופין, אם תאים transfected נמצאים בשימוש, transfect בצפיפות כזו שהם יהיו ומחוברות ~ 80% בזמן שיעור הפנמה תימדד. אם התאים אינם חסיד חזק, תרבות כלי רקמה יש לנהוג עם המצע תא הידבקות (למשל פולי-D-ליזין) כדי למנוע אובדן התא במהלך השלבים לשטוף נרחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל חלבון נבדק, 2 בארות צלחת על צלחת אחת לשמש חלבון את פני השטח הכולל (t = 0) בקרות הפשטה. על צלחת שנייה, צלחת אחת גם עבור כל תנאי הפנמה למבחן (כלומר שיעור endocytic הבסיס לעומת סמים מטופלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים ולאחסן בטמפרטורה המצוין לשימוש יום 2: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS 2 +: פוספט בופר (pH 7.4) בתוספת 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 0.2 מ&quot;מ CaCl 2, (4 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylation דובדבני פתרון: PBS 2 + בתוספת 100 מ&quot;מ גליצין, (4 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NT חיץ: 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.2% ארגון ה-BSA, 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.6, (4 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ripa חיץ: 10 mM טריס, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.1% SDS, 1.0% טריטון X 100, deoxycholate נתרן 1.0%, (4 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sulfo-NHS-SS-ביוטין פתרון המניות: להמיס dimethylsulfoxide (DMSO) עד 200 מ&quot;ג / מ&quot;ל, (-20 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריס (2-Carboxyethyl) phosphine (TCEP) הידרוכלוריד פתרון במלאי: 500 מ&quot;מ H 2 O (-20 ° C, מכוסה בנייר כסף כדי לחסום את האור) </li></ul></li></ol> יום 2: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBS 2 + בתוספת גלוקוז 0.18g/ml, 0.2% IgG / פרוטאז ללא שור בסרום אלבומין (PBS 2 + / g / BSA). טרום חם פתרון זה 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הפתרון sulfo-NHS-SS-ביוטין המניות על גבי הספסל כדי להמיס את DMSO. מיד לפני השימוש, להכין פתרון טרי sulfo-NHS-SS-ביוטין (2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל בקרח קר PBS 2 +, די 0.75 מ&quot;ל / טוב). הפתרון וורטקס במרץ solubilize DMSO. שים לב מגיב NHS-ביוטין הוא הידרוליזה בקלות בתמיסה מימית. לכן, כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים מיד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylation: מניחים על צלחות באמבט קרח בחדר קר ולשטוף 3 x 2 מ&quot;ל עם קרח קר PBS 2 +. הייה בטוח כי הצלחות הם בזווית מעט כדי לאפשר ניקוז מלא הסרת פתרון החיץ. הוסף 0.75 מ&quot;ל / גם הפתרון sulfo-NHS-SS-ביוטין טריים היטב כל אחד. דגירה x 15 &#39;, 4 ° C על באמבט קרח עם רעד נמרצת. לאחר דגירה תושלם, להכין פתרון אחר טרי sulfo-NHS-SS-ביוטין. החלף את הפתרון הישן עם פתרון טריים דגירה x 15 &#39;, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרווה: זה קריטי, כי כל מי שאינו מגיב NHS-ביוטין מולקולות הרווה, כך שהם לא יגיבו עם biotinylate חלבונים תאיים פעם את התאים הם lysed. שטפו תאים 3 x 2 מ&quot;ל עם פתרון מרווה ו דגירה פעמיים פתרון 2 מ&quot;ל להרוות x 15 &#39;, 4 ° C עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפנמה: אם טיפולים תרופתיים נבדקות, להוסיף ריכוז התרופה המתאימה PBS 2 + / g / BSA. שמור על צלחת מלאה ב 4 ° C ולהביא צלחת הפנמה מחוץ לחדר קר. לשטוף 3 x 2 מ&quot;ל עם טרום חימם PBS 2 + / g / BSA (+ / - drUGS) ולהשאיר בפתרונות אותו (2 מ&quot;ל / טוב). מלא את כל בארות ריק עם פתרון מראש על מנת להבטיח חימם אפילו הטמפרטורה על פני הצלחת. העברת התאים 37 ° C חממה 10 &#39;. בסמוך לפני סיום 37 ° C הדגירה, להכין TCEP טרי פתרון 50 מ&quot;מ חיץ NT לשמש צעד חנות להפשיט על הקרח. הכינו כמות מספקת של 1.0 מ&quot;ל / היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלילת: מיד הצלחת להעביר (ים) באמבט קרח לחזור לחדר קר. לשטוף במהירות תאים עם קרח קר NT חיץ, 3 x 2 מ&quot;ל להפסיק אנדוציטוזה. כמו כן לשטוף את רצועת השליטה בארות 3 x 2 מ&quot;ל עם חיץ NT. הוסף 1.0 מ&quot;ל פתרון הפשטת טריים היטב כל אחד. לדגור על הקרח, 15 &#39;, 4 ° C עם רעד עדין. החלף בארות עם פתרון הפשטת טריים דגירה נוסף 15 &#39;, 4 ° C על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמוגה: לשטוף את כל הבארות נחשפו לפתרון הפשטה, 3 x 2 ml NT חיץ. ואז לשטוף את כל בארות (כולל בקרות סה&quot;כ) עם 3 x 2 מ&quot;ל PBS 2 +. Lyse ב 300μl/well Ripa חיץ (או חיץ אחר תמוגה תואם לחלבון ריבית) המכיל מעכבי פרוטאז טריים (1.0 מ&quot;מ PMSF, 1.0 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​כל leupeptin, aprotinin ו pepstatin). Lyse ידי ניעור x 20 &#39;, 4 ° C. העברה צינורות microfuge ופסולת הסלולר ברור ידי centrifuging 18,000 XG, 10 &#39;, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון: השתמש assay חלבון תואם התנאים תמוגה שלך (לדוגמה DC assay חלבון, Bio-Rad) כדי לקבוע את הריכוז של חלבון lysates לעומת עקומת BSA סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streptavidin זיקה כרומטוגרפיה: הכנת צינורות microfuge עם כמויות שוות ערך חלבון עבור כל דגימה. הוסף חוצץ תמוגה להביא את הנפח הסופי של כל דגימה כדי 200μl. וורטקס agarose חרוזים streptavidin נמרצות להביא להשעיית אפילו. שימוש pipettor 200μl עם קצה לחתוך, חרוזים פיפטה לתוך צינור אחד. מומלץ 20μl beads/50 lysate מיקרוגרם. דגירה לילה, 4 ° C על הכתף צינור. </li></ol> יום 3: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה ביד: דגימות צנטריפוגה, 18,000 XG, 2 &quot;לאסוף חרוזים. לשאוב את lysate, נזהר לא להתקרב חרוז גלולה עם aspirator. השתמש קצה פיפטה פלסטיק על קצה aspirator על שליטה טובה יותר. הוסף 0.75 תמוגה מ&quot;ל חיץ צינור אחד, והמערבולת לשטוף חרוזים. צנטריפוגה דגימות, 18,000 XG, 2 &quot;לאסוף חרוזים השאיפה לחזור ושטיפת פעמיים (שלוש שוטפת בסך הכל). לאחר לשטוף הסופי, לשאוב כמה שיותר למאגר ככל האפשר מבלי להפריע גלולה חרוז. תשר צינור לעבר aspirator מסייעת עם הצעד הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elution לדוגמא: הוספת 20-25μl 2x חיץ Laemmli דגימה (הקטנת) על צינור אחד. הסוכן הפחתת לדבוק יהיה הקשר NHS-SS-ביוטין דיסולפיד, משחררים את החלבונים מבודדים לתוך תמיסה. חלבונים בממברנה רוב פגיע מאוד צבירה כאשר מבושל, ולא צריך להיות מחומם לפני העמסה על ג&#39;לים עבור עמוד SDS. קביעת רגישות לחום של חלבון העניין שלך לפני ביצוע הניסויים האלה. אם החלבון לא יכול לסבול חימום רותחים /, דגירה על הכתף, 30 &#39;, בטמפרטורת החדר לפני ניתוח על ידי-SDS. זה מספיק כדי האג&quot;ח דיסולפיד לדבוק ו elute את החלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS-PAGE ו immunoblotting: חלבונים נפרדת על ידי-SDS. עבור כל מדגם, היא הקלה ביותר להפעיל את הדגימות לפי הסדר הבא: השטח הכולל (זמן = 0), רצועה, מצב הפנמה # 1, מצב 2, וכו &#39;העברה קרום עבור immunoblotting ואת כתם עם נוגדן מתאים לחלבון שלך של עניין. לכידת להקות immunoreactive באמצעות מצלמת CCD-תיעוד מערכת ג&#39;ל, להיות בטוח שאין פיקסלים רוויים. לכמת כל צפיפות הלהקה באמצעות ניתוח / צפיפות תוכנה ג&#39;ל. </li></ol> נציג תוצאות: התוצאה immunoblot נציג מוצג באיור 2A. האות החזק ביותר נמצא במסלול &quot;סך הכל&quot; (T), שהוא הסכום הכולל של חלבון פני השטח לפני הפנמה. &quot;רצועה&quot; שליטה (S) רצוי קרוב ריק, אשר מוכיח כי הרצועה היתה יעילה לצורך הניסוי. יעילות רצועת מחושב על ידי השוואת צפיפות של נתיב &quot;רצועה&quot; לזה של מסלול &quot;סך הכל&quot; (חלבון כגון שהיה biotinylated במקביל עם רצועה, אבל לא היה מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ולא חשופים פתרון הפשטה). הנוסחה הבאה משמשת: [1 - (רצועה / סה&quot;כ)] * 100% שימוש בנוסחה זו, רצועת באיור 2 היה 99.8% יעיל. לבסוף, תוכלו לראות להקות של עוצמה פחותה מאשר סך בנתיב הפנמה (ים) (I). בדוגמה (איור 2), בתאים שטופלו טופלו רכב או 1μM אצטט myristate phorbol (PMA) במהלך 10 &#39;שיעורי הפנמה הפנמה דופמין טרנספורטר נמדדו 10&#39; תקופת ההפנמה הראשונית. שיעור הפנמה מחושבכדלקמן: הפנימו / סה&quot;כ * 100 כפי שניתן לראות באיור 2B, משטח DAT 10.4% הפנימו מעל 10 &#39;תחת הרכב שטופלו תנאים. PMA טיפול מוגבר שיעורי DAT הפנמה עד 23.2% משטח הכולל של DAT. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תאים איור פרוטוקול. Biotinylated הם ב 4 ° C עד התווית באופן בלעדי את האוכלוסייה פני השטח, והם עברו 37 ° C ליזום הפנמה. בעקבות הפנמה, תאים מקורר במהירות כדי לעצור תהליכים endocytic ו ביוטין משטח שיורי הוא פשט על ידי טיפול בתאי עם סוכן צמצום. רק חלבונים biotinylated שנותרו הם אלו שעלו מן השטח בזמן t = 0 ו הופנמו, ובכך להגן עליהם מפני הטיפול הפשטה. חלבונים Biotinylated מבודדים על ידי אצווה זיקה כרומטוגרפיה עם חרוזים streptavidin ואת החלבון של עניין הוא זוהה על ידי immunoblotting. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הפעלת PKC מגביר את קצב DAT endocytic. Assay הפנמה. PC12 התאים ביציבות להביע DAT היו biotinylated, 4 ° C כמתואר &quot;פרוטוקול מפורט&quot;. תאים הם חיממו במהירות 37 ° C ± 1 מיקרומטר PMA וטופחו 10 &#39;, 37 ° C. ביוטין שיורית הופשט ידי הקטנת התאים היו lysed וחלבונים biotinylated בודדו ע&quot;י כרומטוגרפיה זיקה streptavidin. (א) נציג immunoblot מראה DAT השטח הכולל ב t = 0 (ט), רצועה שליטה (S), ו DAT הפנימו (אני) בתנאים המצוין. (ב) להקות נתפסו עם מצלמת CCD ו לכמת עם כמות נתונים תוכנה (Bio-Rad). הנתונים כפי שבאה לידי ביטוי% מסך דק internalized/10 DAT. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Immunoblot דוגמה המתארת ​​רצועת עניים ביוטין. הפנמה assay. PC12 התאים ביציבות להביע DAT היו biotinylated, 4 ° C כמתואר &quot;פרוטוקול מפורט&quot;. תאים הם חיממו במהירות 37 ° C ו מודגרות 10 &#39;, 37 ° C. ביוטין שיורית הופשט ידי הקטנת התאים היו lysed וחלבונים biotinylated בודדו ע&quot;י כרומטוגרפיה זיקה streptavidin. Immunoblot מראה DAT השטח הכולל ב t = 0 (ט), רצועה שליטה (S), ו הפנימו DAT (אני). הערה הלהקה גלוי בנתיב לשלוט ברצועה, מעיד על יעילות רצועת עניים.

<ol>
	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

בעיות נפוצות: הבעיה הנפוצה ביותר שעולה בניסויים אלה הוא יעילות רצועת עניים. את היעילות של הרצועה הוא קריטי להיות מסוגל לפרש את התוצאות. אם הרצועה היתה היעילה ביותר, לא ניתן להסיק כי כל החלבונים biotinylated בסמטאות הפנמה היו, למעשה, הפנימו מפני השטח. רצועות ≥ יעילות 90% ה?...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

חלבונים פלזמה הממברנה הם קבוצה גדולה, מגוונת של חלבונים מורכבת של קולטנים, תעלות יונים, מובילי ומשאבות. פעילות של חלבונים אלה אחראי למגוון של אירועים הסלולר מפתח, כולל אספקת חומרי מזון, רגישות הסלולר, ואותות כימיים. רבים קרום חלבונים פלזמה מוסדרים באופן דינמי על ידי סחר endocytic, אשר מודולציה תפקוד החלבון על ידי שינוי פני השטח ביטוי חלבון. המנגנונים המאפשרים אנדוציטוזה חלבונים מורכבים אינם מובנים במלואם עבור חלבונים בממברנה רבים. כדי להבין את המנגנונים ששולטים בסחר endocytic של חלבון מסוים, זה קריטי, כי שיעור endocytic של חלבון להימדד בדיוק. עבור קולטנים רבים, ישיר מדידות קצב endocytic מושגות לעתים קרובות ניצול ligands קולטן שכותרתו. עם זאת, עבור שיעורים רבים של חלבונים בממברנה, כגון מובילי, משאבות תעלות יונים, אין ליגנד נוח כי ניתן להשתמש כדי למדוד את קצב endocytic. בדו&quot;ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה biotinylation הפיך שאנו מעסיקים כדי למדוד את טרנספורטר דופאמין (DAT) שיעור endocytic. שיטה זו מספקת גישה פשוטה למדידת שיעורי הפנמה, והוא יכול בקלות להיות מועסק ללימודי סחר של חלבונים בממברנה ביותר.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation at JoVE.com

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

measuring-plasma-membrane-protein-endocytic-rates-reversible

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  University of Massachusetts Medical School. אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

Video: Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video