وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح # DA15169 من HEM

إجراء لمحة عامة : باستخدام هذا النهج ، وصفت تساهميا بروتينات سطح الخلية مع البيوتين على بقايا يسين المتاحة خارج الخلية باستخدام impermeant الغشاء ، ثاني كبريتيد ، بالإضافة كاشف biotinylation (سلفو - NHS - SS - البيوتين) تحت شروط تقييدية الاتجار (أي درجة حرارة منخفضة) (انظر الشكل 1 من أجل التوضيح). هو تحول مجموعة واحدة من الخلايا لشروط متساهلة الاتجار (37 درجة مئوية) واستيعاب البروتينات biotinylated. تبقى مجموعة أخرى من الخلايا في درجة حرارة منخفضة تصل إلى ضوابط ل1) سطح البروتين الكلي في الوقت = 0 ، و 2) السيطرة تجريد. بعد فترة قصيرة من استيعاب ، وتحول الخلايا مرة أخرى إلى درجة حرارة منخفضة لوقف استيعاب ، وتجريد أي البيوتين سطح المتبقية قبالة عن طريق علاج الخلايا مع وكيل الحد ، والتي يشق على البيوتين ، بالإضافة ثاني كبريتيد. محمية Biotinylated البروتينات التي نشأت من سطح الخلية والمنضوية تم تجريد من الخطوة ، وسوف يكون فقط biotinylated البروتينات التي لا تزال قائمة. بعد انحلال الخلايا ، يتم عزل البروتينات التي biotinylated streptavidin تقارب اللوني ويتم الكشف عن بروتين الاهتمام من جانب immunoblotting الكمي. لتحديد معدل التقامي ، تتم مقارنة كمية البروتين المنضوية لمراقبة سطح مجموع المسمى في الوقت = 0. وقد استخدمنا هذا النهج بنجاح لقياس معدل استيعاب لبافراز الدوبامين العصبية (1) ونقل 1-4. مفصل البروتوكول : اليوم 1 : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في 6 لوحات من هذا القبيل جيدا أنها لن تكون متكدسة ~ 80 ٪ في يوم 2. بدلا من ذلك ، إذا كنت تستخدم الخلايا transfected ، transfect في الكثافة بحيث أنها سوف تكون متكدسة ~ 80 ٪ في ذلك الوقت وسوف يقاس معدل الاستيعاب. إذا الخلايا ليست ملتصقة بقوة ، ينبغي أن يعامل النسيج وير الثقافة مع خلية التصاق الركيزة (مثل بولي - D - يسين) لمنع فقدان الخلية أثناء الخطوات يغسل واسعة النطاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليجري اختبار كل من البروتين ، لاستخدامها لوحة 2 الآبار على واحد مثل لوحة سطح البروتين الكلي (T = 0) والضوابط تجريد. على طبق من الثانية ، لوحة بئر واحدة لكل شرط استيعاب يجري اختبارها (أي معدل التقامي القاعدية مقابل المخدرات المعاملة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية وتخزينها في درجات الحرارة وأشارت لاستخدامها في يوم 2 : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS 2 + : الفوسفات مخزنة المالحة (الرقم الهيدروجيني 7.4) تستكمل مع 1.5 ملم MgCl 2 ، 0.2 ملم CaCl 2 ، (4 درجات مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylation ارو الحل : 2 + PBS تستكمل مع جليكاين 100 ملم ، (4 درجات مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NT العازلة : 150 مم كلوريد الصوديوم ، EDTA 1.0 ملم ، 0.2 ٪ BSA ، 20 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.6 (4 درجات مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RIPA العازلة : 10 مم تريس ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، EDTA 1.0 ملم ، 0.1 ٪ SDS ، 1.0 ٪ تريتون X 100 ، 1.0 ٪ deoxycholate الصوديوم (4 درجات مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلفو - NHS - SS - البيوتين حل المخزون : تذوب في dimethylsulfoxide (DMSO) إلى 200 ملغم / لتر ، (-20 درجة مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تريس هيدروكلوريد الفوسفين (2 - Carboxyethyl) (TCEP) حل الأسهم : 500 ملم في H 2 O ، (-20 درجة مئوية ، وغطت في احباط لحجب الضوء) </li></ul></li></ol> يوم 2 : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد برنامج تلفزيوني 2 + تستكمل مع الجلوكوز 0.18g/ml ، 0.2 ٪ مفتش / البروتيني خالية من ألبومين المصل البقري (PBS 2 + / ز / BSA). دافئ قبل هذا الحل إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد من محلول المخزون سلفو - NHS - SS - البيوتين في أعلى المقعد لإذابة DMSO. مباشرة قبل استخدامها ، وإعداد الطازجة سلفو - NHS - SS - البيوتين الحل (2.5 ملغ / مل في الجليد الباردة PBS 2 + ، مما يكفي ل0.75 مل / جيد). دوامة الحل بقوة لsolubilize في DMSO. علما بأن كاشف NHS - البيوتين محملئا بسهولة في محلول مائي. ولذلك ، ينبغي إعداد كل الحلول مباشرة قبل الاستعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylation : لوحات على مكان حمام الجليد في غرفة باردة وشطف 3 × 2 مل مع الثلج الباردة PBS 2 +. تكون على يقين من أن لوحات الزاوية قليلا للسماح لتصريف المياه وإزالة كاملة من الحل العازلة. إضافة 0.75 مل / جيد من الحل سلفو - NHS - SS - البيوتين جديدة لكل بئر. احتضان × 15 ، 4 درجات مئوية على حمام الجليد مع اهتزاز قوي. بعد اكتمال الحضانة ، وإعداد أخرى جديدة سلفو - NHS - SS - البيوتين الحل. حل محل القديم مع الحل الطازجة واحتضان س &#39;15 ، 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تروي : ومن الأهمية بمكان أن يتم تطفئ كل رد فعل غير NHS - البيوتين الجزيئات ، بحيث أنها لن تتفاعل مع البروتينات داخل الخلايا وbiotinylate بمجرد lysed الخلايا. غسل الخلايا 3 × 2 مل مع الحل تسقية واحتضان مرتين في 2 مل حل يشفي × 15 ، 4 درجات مئوية مع الهز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> داخليا : إذا كان يجري اختبار علاجات دوائية ، إضافة إلى تركيز الدواء المناسب PBS 2 + / ز / جيش صرب البوسنة. إبقاء لوحة التحكم في درجة مئوية (4) وجلب صفيحة الداخلي للخروج من الغرفة الباردة. تغسل 3 × 2 مل مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت 2 + / ز / جيش صرب البوسنة (+ / -- د.UGS) ويترك في نفس الحلول (2 مل / جيد). ملء أي آبار فارغة مع مرحلة ما قبل حل تحسنت لضمان درجة الحرارة حتى عبر لوحة. نقل الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10. مباشرة قبل نهاية الحضانة 37 درجة مئوية ، وإعداد الطازجة حل TCEP 50 ملم في المخزن NT لاستخدامها في خطوة تجريد وتخزينها على الجليد. إعداد كمية تكفي ل1.0 مل / أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجريد : لوحة وعلى الفور نقل (ق) للحمام الجليد والعودة إلى غرفة باردة. غسل الخلايا بسرعة مع Windows NT العازلة الجليد الباردة ، 3 × 2 مل لوقف الإلتقام. غسل أيضا مراقبة الشريط الآبار 3 × 2 مل مع العازلة NT. إضافة 1.0 مل حل جديد لتجريد كل بئر. احتضان على الجليد ، 15 ، 4 درجات مئوية مع الهز لطيف. استبدال الآبار مع الحل تجريد الطازجة واحتضان إضافي 15 &#39;، و 4 درجات مئوية على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحلل : اغسل جميع الآبار التي تعرضت للنهب حل ، 3 × 2 مل NT العازلة. ثم تغسل جميع الآبار (بما في ذلك الضوابط الكلية) مع 3 × 2 2 PBS مل +. ليز في 300μl/well RIPA العازلة (أو غيرها من العازلة التي تتلاءم مع تحلل البروتين من الفائدة) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني الطازجة (1.0 ملم PMSF ، 1.0 ميكروغرام / مل كل leupeptin ، وأبروتينين pepstatin). ليز التي تهز × 20 ، 4 درجات مئوية. لأنابيب نقل microfuge والحطام الخلوية واضح من جانب الطرد المركزي XG 18000 ، 10 ، 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز بروتين تقرير : استخدام البروتين مقايسة متوافقة مع الظروف تحلل الخاص (مثل فحص البروتين العاصمة ، بيو راد) لتحديد تركيز البروتين من lysates بالمقارنة مع منحنى BSA القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streptavidin التقارب اللوني : إعداد أنابيب microfuge مع كميات مكافئة من البروتين لكل عينة. إضافة العازلة تحلل ليصل حجم النهائي لكل عينة ل200μl. دوامة من الخرز agarose streptavidin بقوة لوضع تعليق حتى. باستخدام pipettor 200μl مع طرف قطع والخرز ماصة في كل أنبوب. أوصت 20μl lysate beads/50 ميكروغرام. يحضن بين عشية وضحاها ، 4 درجات مئوية على محور دوار الأنبوب. </li></ol> يوم 3 : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حبة الغسيل : عينات من أجهزة الطرد المركزي ، 18000 XG ، 2 &#39;لجمع الخرز. نضح قبالة lysate ، والحرص على عدم الاقتراب من حبة بيليه مع الشافطة. استخدام غيض ماصة بلاستيكية على نهاية الشافطة للتحكم بشكل أفضل. إضافة 0.75 مل العازلة تحلل كل أنبوب ، ودوامة لغسل الخرز. عينات من أجهزة الطرد المركزي ، 18000 XG ، 2 &#39;لجمع الخرز والطموح وتكرار الغسيل مرتين (ثلاث غسلات في المجموع). بعد غسل النهائي ، نضح قدر من العازلة ممكن من دون إزعاج بيليه حبة. البقشيش الأنبوب نحو الشافطة يساعد في هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العينة : إضافة 20 25μl عينة Laemmli 2X العازلة (الحد) لكل أنبوب. وكيل وسوف يلتصق خفض السندات ثاني كبريتيد NHS - SS - البيوتين ، والإفراج عن البروتينات المعزولة في الحل. معظم البروتينات الغشاء عرضة لتجميع عند المغلي ، وينبغي ألا يكون ساخنا قبل تحميلها على المواد الهلامية للSDS - PAGE. تحديد حساسية للحرارة من البروتين الخاص بك من الفائدة قبل إجراء هذه التجارب. إذا كان البروتين لا يمكن ان تتسامح التدفئة الغليان / ، على احتضان المدورة ، 30 &#39;، ودرجة حرارة الغرفة قبل تحليل بواسطة SDS - PAGE. هذه هي كافية ليلتصق ثاني كبريتيد السندات وأزل البروتينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS - PAGE وimmunoblotting : البروتينات منفصلة بواسطة SDS - PAGE. لكل عينة ، فمن الأسهل لتشغيل العينات وفقا للترتيب التالي : السطح الكلي (الوقت = 0) ، قطاع غزة ، شرط استيعاب # 1 ، الحالة رقم 2 ، وما إلى ذلك نقل إلى الغشاء عن وصمة عار immunoblotting مع الأجسام المضادة المناسبة لبروتين الخاص من الفائدة. القبض على عصابات مناعيا باستخدام وثائق اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا هلام النظام ، موقنا أنه لا توجد خلية المشبعة. قياس كثافة الموجات باستخدام كل هلام التحليل / كثافة البرامج. </li></ol> ممثل النتائج : ويرد نتيجة طخة مناعية ممثل في الشكل 2A. أقوى إشارة في حارة &quot;الكل&quot; (T) ، وهو المبلغ الإجمالي للبروتين السطح الداخلي قبل. ينبغي أن &quot;الشريط&quot; السيطرة (S) من الناحية المثالية على مقربة من فارغة ، مما يدل على أن القطاع على درجة من الكفاءة للتجربة. ويتم احتساب كفاءة قطاع بمقارنة كثافة حارة &quot;الشريط&quot; الى ان من حارة &quot;الكل&quot; (مثل البروتين الذي biotinylated بالتوازي مع قطاع غزة ، ولكن ليس إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية ولا يتعرضون للتجريد الحل). يتم استخدام الصيغة التالية : [1 -- (شريط / المجموع)] * 100 ٪ باستخدام هذه الصيغة ، وكان الشريط في الشكل 2 99.8 ٪ فعالة. أخيرا ، سوف ترى عصابات أقل كثافة من المجموع في الممر الداخلي (ق) (I). &#39;تم قياس معدلات نقل الداخلي واستيعاب الدوبامين عن 10&#39; في المثال (الشكل 2) ، وعولج الخلايا المعالجة إما مع مركبة أو 1μM خلات myristate phorbol (PMA) خلال الفترة من 10 تدخيل الأولي. ويتم احتساب معدل استيعاب مايلي : المنضوية / مجموع * 100 كما رأينا في الشكل 2B ، 10.4 ٪ DAT سطح المنضوية أكثر من 10 &#39;تحت سيارة المعاملة شروطه. زيادة معدلات استيعاب PMA العلاج DAT إلى 23.2 ٪ من إجمالي مساحة DAT. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. وbiotinylated بروتوكول التوضيح. خلايا في 4 درجات مئوية فقط لتسمية السكان السطح ، وتحولت إلى 37 درجة مئوية إلى الشروع في استيعاب. بعد استيعاب ، والمبردة بسرعة لوقف عمليات الخلايا التقامي المتبقية والبيوتين السطح هو تجريده من خلال معالجة الخلايا مع وكيل الحد. البروتينات فقط biotinylated التي تبقى هي تلك التي نشأت من السطح في ر = 0 والمنضوية كانت ، الأمر الذي يحميهم من العلاج تجريد. يتم عزل البروتينات التي Biotinylated دفعة اللوني تقارب مع حبات streptavidin ويتم الكشف عن بروتين الاهتمام من جانب immunoblotting. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. PKC التنشيط يزيد من معدل DAT التقامي. مقايسة التطبع. وأعرب عن الخلايا PC12 biotinylated ستابلي DAT ، 4 درجات مئوية كما هو موضح في &quot;بروتوكول مفصلة&quot;. وقد تحسنت بسرعة الخلايا إلى 37 درجة مئوية ± 1 ميكرومتر سلطة النقد الفلسطينية وحضنت &#39;10 و 37 درجة مئوية. جردت البيوتين المتبقية عن طريق خفض ، وlysed الخلايا والبروتينات biotinylated كانت معزولة من قبل streptavidin التقارب اللوني. (أ) الممثل طخة مناعية تظهر السطح في مجموع DAT ر = 0 (T) وقطاع التحكم (S) ، والمنضوية DAT (I) في ظل الظروف المشار اليها. (ب) تم القبض على عصابات مع كاميرا CCD وكميا مع الكمية البيانات البرمجيات (بيو راد). يتم التعبير عن البيانات و٪ مين مجموع internalized/10 DAT. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. طخة مناعية سبيل المثال يصور الشريط البيوتين الفقراء. مقايسة التطبع. وأعرب عن الخلايا PC12 biotinylated ستابلي DAT ، 4 درجات مئوية كما هو موضح في &quot;بروتوكول مفصلة&quot;. وقد تحسنت بسرعة الخلايا إلى 37 درجة مئوية ، وحضنت &#39;10 و 37 درجة مئوية. جردت البيوتين المتبقية عن طريق خفض ، وlysed الخلايا والبروتينات biotinylated كانت معزولة من قبل streptavidin التقارب اللوني. لطخة مناعية يظهر السطح في مجموع DAT ر = 0 (T) وقطاع التحكم (S) ، والمنضوية DAT (I). علما الفرقة واضحة في الشريط حارة السيطرة ، مما يدل على كفاءة القطاع الفقير.

<ol>
	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

المشاكل الشائعة : المشكلة الأكثر شيوعا التي تنشأ في هذه التجارب هو ضعف كفاءة القطاع. كفاءة قطاع حاسم في أن تكون قادرة على تفسير النتائج. إلا إذا كان الشريط كفاءة عالية ، فإنه ليس من الممكن أن نستنتج أن أي البروتينات biotinylated في الممرات استيعاب كانت ، في الواقع ، المن?...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

بروتينات غشاء البلازما هي كبيرة ، مجموعة متنوعة من البروتينات تتكون من المستقبلات ، وقنوات ايون وشركات النقل والمضخات. نشاط هذه البروتينات هي المسؤولة عن مجموعة متنوعة من الأحداث الخلوية الأساسية ، بما في ذلك تسليم المواد الغذائية ، واستثارة الخلوية ، وإشارات كيميائية. ويتم تنظيم العديد من البروتينات بشكل حيوي غشاء البلازما من الاتجار التقامي ، الذي ينظم وظيفة البروتين البروتين التعبير عن طريق تغيير السطح. الآليات التي تسهل الإلتقام البروتين معقدة وغير مفهومة تماما عن بروتينات غشاء كثيرة. لكي نفهم تماما الآليات التي تتحكم في الاتجار التقامي من بروتين معين ، فمن الأهمية بمكان أن يتم قياسها بدقة نسبة البروتين التقامي ق. لمستقبلات عديدة ، كثيرا ما يتم تحقيق معدل القياسات المباشرة التقامي باستخدام مستقبلات يغاندس المسمى. ومع ذلك ، لفئات كثيرة من البروتينات الغشاء ، مثل النقل ، ومضخات وقنوات أيون ، ليس هناك يجند مريحة والتي يمكن استخدامها لقياس معدل التقامي. في هذا التقرير ، ونحن تصف طريقة biotinylation عكسها التي نستخدمها لقياس نقل الدوبامين (DAT) معدل التقامي. هذا الأسلوب يوفر نهجا واضحة لقياس معدلات الاستيعاب ، ويمكن استخدامها بسهولة لدراسات الاتجار معظم البروتينات الغشاء.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation at JoVE.com

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

الإلتقام ينظم ينظم مستويات التعبير سطح الخلية لمعظم البروتينات الغشاء. هنا نستخدم اختزال والكواشف غشاء biotinylation impermeant لقياس معدل التقامي للنقل الدوبامين (DAT) ، وهو بروتين الغشاء polytopic. الأسلوب يسهل نهج مباشرة لقياس معدل التقامي معظم البروتينات غشاء البلازما.

قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

measuring-plasma-membrane-protein-endocytic-rates-reversible

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  University of Massachusetts Medical School. الإلتقام ينظم ينظم مستويات التعبير سطح الخلية لمعظم البروتينات الغشاء. هنا نستخدم اختزال والكواشف غشاء biotinylation impermeant لقياس معدل التقامي للنقل الدوبامين (DAT) ، وهو بروتين الغشاء polytopic. الأسلوب يسهل نهج مباشرة لقياس معدل التقامي معظم البروتينات غشاء البلازما.

Video: Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

قياس الفولتية المستحثة الأغشية مع ثنائي ANEPPS - 8

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

التصوير البلازما غشاء التشويهات مع pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

النقل غشاء عمليات تحليلها بواسطة النظام ثقب النانو رقاقة الموازي عالية في قرار بروتين واحد

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

تحديد التقسيم غشاء البلازما للبروتينات المرتبطة محيطيا

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...