Biz, ABD Ulusal Sağlık hibe R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050 R01HL081273 ve R01EB007279 ve Amerikan Kalp Birliği hibe 0855772D Enstitüsü&#39;nün desteğiyle kabul etmek istiyorum.

1. Geniş bir sıçan kortikal damarsal pO2 görüntüle görüntüleme alanında <ol><li> Rats (250 g -350 g), başlangıçta izofluran ile anestezi ve femoral arter ve damar, kalp hızı, kan basıncı ve kan gazları yanı sıra intravenöz infüzyon için izlemek için kateterize. Vücut sıcaklığı ± 0.1 ° C 37 korunur Trakeotomi yapılır ve sıçanlarda hava ve oksijen karışımı ile havalandırılan. </li><li> Kan gazları ölçmek için kan örnekleri her 30-45 dakikada bir alınır ve ventilasyon ve anestezi, kan gazları normal fizyolojik aralığında tutmak için ayarlanır. </li><li> Parietal kemik boyutu 4 mm x 4 mm kapalı bir kafa pencere görüntüleme için hazırlanmıştır. Kemik ve dura kaldırılır ve kraniyal pencere% 1.5 agaroz ile doldurulur ve bir mikroskop lamel ile mühürlenir. Frontal kemik bir ek 1 mm 2 burr hole KCl (~ 10 ul, 1 M) intrakortikal mikroenjeksiyon CSD ikna etmek için kullanılır. Kortikal vaskülatürü herhangi bir zarar vermemek için çok dikkatli alınmalıdır. Aşırı ısı, mekanik basınç veya hipoksi kısa bir süre interstisyel boşluğa damar, kan beyin bariyerini ve boya neden kaçak tehlikeye atabilir. </li><li> Kafatası pencere içinde optik opak malzemeden bir maske yerleştirilir. Maske amacı kenarlarından dura maddenin doku içine sızan boya gelen fosforesans sinyal emmek için. Interstisyel alan boya ölçümü bozabilir çok parlak fosforesans kaynağıdır. Interstisyel uzayda boya artan parlaklığı düşük oksijen basıncı ve düşük su verme oranı ile çevre boya birikmesi sonucu. Deneyde, damarsal hasar nedenle, deneysel veriler bu durumda reddedilir parlak fosforesans lekeler, görünümünü kolayca tanınır. </li><li> Ameliyatın tamamlanmasından sonra, izofluran kesilmeli ve anestezi alphachloralose (50 mg / kg intravenöz bolus 40 mg / (kg saat) infüzyon takip) geçti. </li><li> Hayvan ventilatör bir arabası, kan basıncı ve sıcaklık monitörü ile aktarılır. Oda havası nefes alırken, hayvan görüntüleme kurulum hızlı bir şekilde taşınır ve uygun hava ve oksijen karışımı ile debimetre yatışma. </li><li> Hayvan tutan stereotaksik çerçeve amaç altına yerleştirilir. Kafatası penceresi hedefi altında görüş alanı merkezli ve odak düzlemine paralel olarak konumlandırılmış. </li><li> Darbeli lazer açık ve minimum darbe enerji ayarlanır. Optik ışın demeti 10 mJ / cm 2 den fazla olmayacak şekilde ayarlanır darbe enerji ölçüm ve numune teslim darbe enerji doğru yönlendirilir. Kraniyal pencerede merkezli ışın iss, ~ 60 derece ve lazer iss eğik insidansı açı ile kapalıdır. </li><li> Hayvanın tüm fizyolojik parametreleri normal fizyolojik aralığında kadar kan gazı ölçümleri ve havalandırma ve anestezi ayarlamalar yapılmaktadır. </li><li> Varsayarsak, bu kan hacmi fosforesans prob Oxyphor R3 uygun bir miktar prob 4 x 10 -5 M kan konsantrasyonu elde etmek için 1 ml serum fizyolojik içinde çözülür, vücut ağırlığının yaklaşık% 7. Prob çözüm femoral ven yoluyla enjekte edilir. </li><li> 1 M potasyum klorür çözeltisi hazırlanır ve frontal kemik çapak delikten ~ 1 ul CSD ikna etmek için şırınga ile enjekte edilir. </li><li> Lazer açık ve görüntüleme KCl çözeltisi enjeksiyonundan hemen sonra başladı. Fosforesans Görüntüleme ~ 10 dakika boyunca yapılır. </li><li> Başka bir kan gazı ölçümü, hayvanın fizyolojik parametreler normal sınırlarda olduğunu doğrulamak için yapılır. </li><li> Fosforesans yaşamlarda, doğrusal olmayan kare uydurma Matlab istatistiksel ağırlık kullanarak tek bir üstel bozulma takarak tüm pikseller için elde edilir. Fosforesans yaşamlarda Stern Volmer gibi ampirik bir ilişki (vide infra) kullanarak pO2 değerleri dönüştürülür. </li></ol> 2. Yüksek çözünürlüklü iki foton bir fare kortikal mikro vasküler yapılarda pO2 görüntüleme <ol><li> Isofluorene ve femoral arter, kalp hızı, kan basıncı ve kan gazları, aynı zamanda boya yönetim olarak izlemek için kateterize fareler anestezi. Vücut ısısı 37 korunur ± 0.1 ° C ve hayvanlar hava ve oksijen karışımı kendiliğinden nefes. </li><li> Kranial pencere başlangıçta David Kleinfeld ve Winfried Denk tarafından geliştirilen tekniğe göre hazırlanmıştır. Interstisyel boşluğa boya sızıntısını önlemek için vaskülatürü herhangi bir zarar görmesini önlemek için iyi bir bakım alınmalıdır. </li><li> Birkaç kan gazları ölçmek için kan örnekleri bir bütün hazırlık prosedürü sırasında alınır ve kan gazı tutmak için havalandırma ve anestezi ayarlanırnormal fizyolojik aralığında es. </li><li> Hayvan görüntüleme kurulum taşınır. Hayvan tutan bir değiştirilmiş stereotaksik çerçeve amaç altına yerleştirilir. Kafatası pencere Olympus 4X hedefi altında görüş alanı merkezli ve odak düzlemine paralel olarak konumlandırılmış. </li><li> Kraniyal penceresinin bir görüntü göz mercekleri ile dijital kamera ile çekilen ve 4X objektif Olympus 20X objektif (NA = 0.95) ile değiştirilir. </li><li> Hayvanın tüm fizyolojik parametreleri normal bir fizyolojik aralığında kadar kan gazı ölçümleri ve havalandırma ve anestezi ayarlamalar yapılmaktadır. </li><li> Varsayarsak, bu kan hacminin vücut ağırlığının yaklaşık% 7, uygun bir miktarda fosforesans prob PtP-C343, 0.2 mL ~ 15 prob mcM kan konsantrasyonu elde etmek için tuzlu su içinde çözülür. Prob çözüm femoral arter yoluyla enjekte edilir. </li><li> Her pikselin boya uyarma ve emisyon koleksiyonu için istenilen zaman aralıklarında ayarlayarak deney başlayın. </li><li> Mevcut derinlikte damar yapısını görüntüler fosforesans yoğunluğu çürüme yavaş bir 2-boyutlu raster tarama bir anket tarama edinin. Amacı kraniyal pencerede dik taşınır (Z ekseni) ve fosforesans yoğunluğu yavaş 2D anket taramaları görüntü düzlemi mikrodamarlar bulmak için en az 840 nm lazer gücünü kullanarak alınır. </li><li> Her görüntüleme derinliği, bu derinlikte fosforesans anket tarama dayalı, damar içinde bir dizi puan seçilir ve her noktada fosforesans bozunur kayıt önceden tanımlanmış bir ortalama sayısı için tekrarlanır. </li><li> İstenen ortalama miktarı, ölçüm aralığı ve Deneme süresini ayarlayın ve ölçüm başlar. pO 2 ölçüm, deney süresince, seçilen noktada belirtilen ölçüm aralığı elde edilir . </li><li> Ölçümleri sırasında, yazılım galvanometre tarama ayna konumunu değiştirerek seçilen yerlere uyarma lazer yeniden yönlendirir. Galvanometre tarayıcılar, elektro optik modülatör, ve tüm diğer ekipman kontrolü LabView özel yapılmış yazılım tarafından yapılmaktadır. </li><li> Fosforesans yaşamlarda Matlab doğrusal olmayan kare uydurma kullanarak tek bir üstel bozulma uygun seçilen tüm noktalar için elde edilir. Fosforesans yaşamlarda Stern Volmer gibi ampirik bir ilişki (vide infra) kullanarak pO2 değerleri dönüştürülür. </li><li> Kortikal çeşitli derinliklerde veri topladıktan sonra, görüntüleme mikrovasküler yapının vasküler içine dekstran-konjuge floresein boya enjekte edilir. </li><li> Damarsal yapısal görüntüleri dört-kanallı dedektörü yeşil bir kanal kullanılarak FITC floresanı iki foton görüntüleme gerçekleştirerek bir yığın alın. </li><li> Araştırma Hayvan Bakım Massachusetts General Hospital Alt Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 bu rakamın sol tarafında Panel (a), oksijen basıncı bakış görüntü CSD dalga gelmeden önce geniş bir alanda görüntüler . Sağ tarafta Paneli (b), panel üzerinde işaretlenmiş ilgi bölge içinde CSD yayılımı sırasında ortalama oksijen basıncı (a), zamansal evrimi gösterir. Şekil 2 (AVI film): Bu film CSD dalga yayılması sırasında tüm kafa penceresinde oksijen basıncı zamansal evrim gösterir. Ölçeği bar oksijen basıncı milimetre cıva gösterir. <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 görüntülü damarsal yığını 3D projeksiyon. Gri tonları, hacimsel bir gemi maske temsil yapısal görüntü göre oluşturulur. Ölçülen pO 2 değerleri, renk kodlu . Ölçek çubuğu 200 mikrometre. Nature Publishing Group izni ile yayımlanmaktadır. 7

<ol>
	<li>Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y., Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+occlusion+to+surface+and+deep+vessels+in+neocortex+via+linear+and+nonlinear+optical+absorption,+Animal+Models+of+Acute+Neurological+Injuries.">Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries.</a> Contemporary Neuroscience Series. , (2007).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Phosphorescent+Probes+for+Oxygen+Imaging+in+Biological+Systems.">Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a> Applied Materials &#38; Interfaces. , (2009).</li><li>Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+microscopy+by+two-photon-excited+phosphorescence.">Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence.</a> Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).</li><li>Sakad&#382;i&#263;, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+cerebral+partial+pressure+of+oxygen+and+blood+flow+during+functional+activation+and+cortical+spreading+depression.">Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression.</a> Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).</li><li>Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+monitoring+of+oxygen+tension+in+cortical+microvessels+with+confocal+microscopy.">Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy.</a> Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).</li><li>Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat Methods. 7, 755-759 (2010).</li></ol>

Biz fosforesans oksijen bağımlı ısıl işlem dayalı kortikal mikrodolaşımını pO2 ölçüm iki uygulama göstermiştir. CCD görüntüleme dayalı ilk yöntem 2-foton mikroskopi dayalı kortikal mikrodolaşımını oksijen kısmi basıncı ölçme, pO2 bakış izleme geniş bir alan sağlarken, kapiller çözünürlüğü sağlar ve derinlemesine görüntüleme sağlar. Her iki yöntem de yüksek hız ve yüksek sinyal-gürültü ölçümleri sağlar. Buna ek olarak, pO2 fosforesans ömrü ölçümü, genellikle...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycopyrrolate</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Regent Inc.</td>
<td>NDC 0517-4605-25</td>
<td>Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lidocaine HCL</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc.</td>
<td>NDC 0409-4277-01</td>
<td>Used as the local anesthesia during surgeries.</td>
</tr>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Reagent</td>
<td>Baxter Healthcare Corp.</td>
<td>NDC 10019-360-40</td>
<td>Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alpha Chloralose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0128</td>
<td>Used as a general anesthesia during experiments with rats.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein isothio-cyanate&#x2013;dextran</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>FD2000S</td>
<td>Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cerebral blood oxygenation measurement based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence

Serebral kan ve doku oksijenasyonu uzaysal özelliklerinin izlenmesi nöro-metabolik-vasküler ilişkinin daha iyi anlaşılması için çok önemlidir. PO2 bakış daha geniş alanlarda daha yüksek uzaysal ve / veya zamansal çözünürlük ile eş zamanlı olarak izlenmesi ile yeni pO2 ölçüm yöntemlerinin geliştirilmesi, normal beyin işleyişi daha iyi kavramanızı sağlayacak gibi nörovasküler hastalıkların tanı ve tedavisi üzerinde önemli bir etkiye sahip olacak inme, Alzheimer hastalığı ve kafa travması. Optik görüntüleme yöntemleri, optik spektrum görünür ve yakın kızılötesi aralığında hemoglobin emilimi dayalı yüksek uzaysal çözünürlük ve pO2 kantitatif görüntüleme sağlamak için büyük bir potansiyel göstermiştir. Ancak, serebral kan oksijenlenme multispektral ölçümü son derece saçılma beyin dokusu ile foton göç dayanmaktadır. Tahmin ve deney sırasında dinamik değişikliklere doku optik parametreleri, modelleme, genellikle kan oksijenlenme doğru tahmini için gereklidir. Öte yandan, fosforesans oksijen bağımlı ısıl işlem dayalı kısmi oksijen basıncı (pO2) tahmini doku optik parametreleri değişiklikler önemli ölçüde etkilenen ve pO2 mutlak bir ölçü sağlar olmamalıdır. Oksijen duyarlı boyalar kullanan Deneysel sistemleri yanı sıra fizyolojik pO2 aralığı doğru oksijen görüntüleme yeteneğine sahip güçlü bir teknoloji olduğunu fosforesans su verme gösteren, doku kültürleri oksijen içeriğini izlemek için perfüze doku in vivo çalışmalarda gösterilmiştir. Burada nasıl fosforesans ömrü görüntüleme dayalı kortikal damarsal ölçümü pO2 gerçekleştirmek için iki farklı görüntüleme yöntemleri ile ortaya koymaktadır. Ilk gösteride bir sıçan kortikal yüzeyde pO2 görüntüle görüntüleme geniş alan mevcut. Bu görüntüleme yöntemi, nispeten basit bir CCD kamera ve darbeli bir yeşil lazer dayalı deney düzeneği vardır. Oxyphor R3 boya fosforesans ömrü dayalı kortikal yayılan depresyon izlenmesi bir örnek sunuldu. Ikinci gösteri yüksek çözünürlüklü iki foton bir fare kortikal mikro vasküler yapılarda pO2 görüntüleme sunuyoruz. Deney düzeneği, femtosecond lazer, elektro-optik modülatör ve foton sayma fotoğraf çarpan tüp ile özel bir dahili 2-foton mikroskop içerir. Biz PtP-C343 boya ile gelişmiş bir roman 2-foton ikaz kesiti kullanarak, kılcal damarlar da dahil olmak üzere kortikal mikrodolaşımını pO2 heterojenite görüntüleme bir örnek sunuyoruz. Ilgili makaleyi görüntülemek için buraya tıklayın <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=1731">Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence at JoVE.com

Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Biz fosforesans oksijen bağımlı ısıl işlem dayalı serebral vasküler yapılarda kısmi oksijen basıncı (pO2) ölçmek için deneysel bir prosedür mevcut. Hayvan hazırlama ve görüntüleme yöntemleri pO2 görüntüle CCD tabanlı görüntüleme büyük alan sıçanlarda ve farelerde pO2 2-foton uyarma bazlı görüntüleme için özetlenen.

Fosforesans Oksijen bağımlı Quenching dayanarak Serebral Kan oksijenasyon Ölçüm

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
...

cerebral-blood-oxygenation-measurement-based-on-oxygen-dependent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. Biz fosforesans oksijen bağımlı ısıl işlem dayalı serebral vasküler yapılarda kısmi oksijen basıncı (pO2) ölçmek için deneysel bir prosedür mevcut. Hayvan hazırlama ve görüntüleme yöntemleri pO2 görüntüle CCD tabanlı görüntüleme büyük alan sıçanlarda ve farelerde pO2 2-foton uyarma bazlı görüntüleme için özetlenen.

Video: Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Nörobilim

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Microcoil stenoz ile hafif intrauterin hipoperfüzyon fare modeli

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it is thought that dysregulation of protein synthesis in the nervous system may be a core phenotype in some developmental disorders. Accurate measurement of rates of cerebral protein synthesis in animal models is important for understanding these disorders. The method that we have developed was designed to be applied to the study of awake, behaving animals. It is a quantitative autoradiographic method, so it can yield rates in all regions of the brain simultaneously. The method is based on the use of a tracer amino acid, L-[1-14C]-leucine, and a kinetic model of the behavior of L-leucine in the brain. We chose L-[1-14C]-leucine as the tracer because it does not lead to extraneous labeled metabolic products. It is either incorporated into protein or rapidly metabolized to yield 14CO2 which is diluted in a large pool of unlabeled CO2 in the brain. The method and the model also allow for the contribution of unlabeled leucine derived from tissue proteolysis to the tissue precursor pool for protein synthesis. The method has the spatial resolution to determine protein synthesis rates in cell and neuropil layers, as well as hypothalamic and cranial nerve nuclei. To obtain reliable and reproducible quantitative data, it is important to adhere to procedural details. Here we present the detailed procedures of the quantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine method for the determination of regional rates of protein synthesis in vivo.

Protein synthesis is&#160;a critical biological process for cells. In brain, it is required for adaptive changes. Measurement of rates of protein synthesis in the intact brain requires careful methodological considerations. Here we present the L-[1-14C]-leucine quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo.

Serebral protein sentezi In vivo bölgesel oranlarının belirlenmesi için nicel Autoradiographic yöntemi

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Serebral arterler patlama kaynaklı Neurotrauma etkilerini basınçlı kemirgen orta

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts are typically counted to evaluate itch induced by pruritogens. However, previous reports have shown that algesic substances also induce scratching behaviors in a mouse neck injection model, which is the most common test used for scratching behaviors. This finding makes it difficult to study itch in mice. &#160;In contrast, capsaicin, a common algogen, reduced scratching behaviors in some neck injection experiments. Therefore, the effect of pain on scratching behaviors remains unclear. It is thus necessary to develop a method to concurrently investigate itch and pain sensation using behavioral tests. Here, a cheek injection model is introduced which can be used to simultaneously measure pain- and itch-related behaviors. In this model, pruritogens induce scratching behaviors while algesic substances induce wiping behaviors. Using this model, lysophosphatidic acid (LPA), an itch mediator found in cholestatic patients with itch, is shown to exclusively induce itch but not pain. However, in mouse models, LPA has been reported to be both a pruritogen and an algogen. Investigation into the effects of LPA in a mouse cheek injection model showed that LPA only induced scratching, but not wiping behaviors. This indicates that LPA acts as a pruritogen similarly in mice and humans, and demonstrates the utility of a cheek injection model for itch research.

Typically, the mouse neck injection model is used for evaluate pruritogen-induced scratch behaviors. However, the model provides information only on itch, not pain. Here, a cheek injection model is introduced in mice which can be used to simultaneously measure pain and itch-related behaviors.

Ağrı ve Kaşıntıya Bağlı Davranışların Eşzamanlı Ölçümü İçin Yanak Enjeksiyon Modeli

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Serebral Kan Akışının ve Elektrik Alanlarının Haritalanması: Farelerde Elektrot Yerleştirme

Placement of Extracranial Stimulating Electrodes and Measurement of Cerebral Blood Flow and Intracranial Electrical Fields in Anesthetized Mice

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and variations in the substrate supply to the brain. This paper describes a protocol for measuring CBF responses to transcranial alternating current stimulation (tACS). Dose-response curves are estimated both from the CBF change occurring with tACS (mA) and from the intracranial electric field (mV/mm). We estimate the intracranial electrical field based on the different amplitudes measured by glass microelectrodes within each side of the brain. In this paper, we describe the experimental setup, which involves using either bilateral laser Doppler (LD) probes or laser speckle imaging (LSI) to measure the CBF; as a result, this setup requires anesthesia for the electrode placement and stability. We present a correlation between the CBF response and the current as a function of age, showing a significantly larger response at higher currents (1.5 mA and 2.0 mA) in young control animals (12-14 weeks) compared to older animals (28-32 weeks) (p &lt; 0.005 difference). We also demonstrate a significant CBF response at electrical field strengths &lt;5 mV/mm, which is an important consideration for eventual human studies. These CBF responses are also strongly influenced by the use of anesthesia compared to awake animals, the respiration control (i.e., intubated vs. spontaneous breathing), systemic factors (i.e., CO2), and local conduction within the blood vessels, which is mediated by pericytes and endothelial cells. Likewise, more detailed imaging/recording techniques may limit the field size from the entire brain to only a small region. We describe the use of extracranial electrodes for applying tACS stimulation, including both homemade and commercial electrode designs for rodents, the concurrent measurement of the CBF and intracranial electrical field using bilateral glass DC recording electrodes, and the imaging approaches. We are currently applying these techniques to implement a closed-loop format for augmenting the CBF in animal models of Alzheimer's disease and stroke.

Yazar Spotlight: Alzheimer Modelinde Serebral Kan Akışını İyileştirmek için Stimülasyona Dayalı Yaklaşım 

We describe a protocol for assessing dose-response curves for extracranial stimulation in terms of brain electrical field measurements and a relevant biomarker-cerebral blood flow. Since this protocol involves invasive electrode placement into the brain, general anesthesia is needed, with spontaneous breathing preferred rather than controlled respirations.

Anestezi Uygulanmış Farelerde Ekstrakraniyal Uyarıcı Elektrotların Yerleştirilmesi ve Serebral Kan Akımı ve İntrakraniyal Elektrik Alanlarının Ölçülmesi

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and ...