Yazarlar fotoğraf ve sesli-over video post-prodüksiyon için Dana Kamalidenova, Morgan Autexier ve Roch Chopier, video ve animasyonlar yapılmış yanı sıra Florian Beck teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Olympus tarafından desteklenen ve HFSPO (Kariyer Geliştirme Ödülü), ANR (Program Jeunes Chercheurs ve Program Blanc Nörobilim), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM ve La Pitié Salpêtrière hastane (Translasyonel araştırma hibeleri tarafından desteklenen JS NR sözleşme), Fransız Araştırma Bakanlığı ve Deutsche Forschungsgemeinschaft doktora sonrası burslar gelen YUKARI ve doktora okul &quot;Yaşam Bilim Frontiers&quot; dan, Paris Diderot Üniversitesi, Bettencourt Schuller vakıf ve FRM (Fondation pour la Recherche MEDICALE) doktora bursu

1. Yapay Beyin Omurilik Sıvısı ve intrasellüler Çözüm hazırlanması <ol><li> Deney başlamadan önce, bir yama kelepçe kayıtları yanı sıra, hipokampus hazırlanması için suni serebrospinal sıvı (ACSF) için dahili çözelti hazırlamak gerekmektedir. Bir bardak gazlama cihazı (mikro filtre mum, Robu Almanya) ve doku grid (cibinlik veya naylon sıkı); Siz ayrıca cerrahi makas ve ince iris makas, iki spatula ve forseps (Güzel bilimi araçları) oluşan bir diseksiyon seti gerekir hem de yapıştırıcı (Uhu Dent). Elektrofizyoloji dilim yama kurulum yapılandırma Finkel &amp; Bookman, 2001 1 tarafından tanımlanmıştır. </li><li> Iç çözelti için, (mM olarak) çözülür: 105 K-glukonat, 30 KCl, deiyonize su içinde 10 HEPES, 0.3 EGTA (nihai hacim olarak% 70-80). 4 ° C&#39;ye kadar soğutulur ve çözelti (mM olarak) eklenir: 4 ATP-Mg, 0.3 mM Tris-GTP ve 10 fosfokreatin. KOH ve dolgu u ile 7.4 &#39;e pH ayarlamason hacim için deiyonize su ile s. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Bu çözüm (gözenek boyutu 0,2 mikron) filtreleyin. Aliquoted çözüm 3-4 hafta dayanır - 20 ° C Bir deney gün için, iç solüsyonu ~ 1 ml gereklidir. </li><li> Aksi belirtilmediği sürece, CA1 bölgesinde hipokampusta hazırlanması ve hücre kayıtları için kullanılan ACSF, (mM cinsinden) şunları içerir: 119 NaCl, 2,5 KCl, 2.5 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1 NaH 2 PO 4, 26.2 NaHCO 3 ve 11 glikoz. Carbogen (% 95 O2 ve% 5 CO2) ile - en az 10 dakika (7.4 pH ~ 7.3) deiyonize su (Ozmolarite ~ 320 mOsm) oksijen ve bu çözelti, bu tuzlar çözülür. Her deneme için çözelti en az 1 litre hazırlayın. Özellikle dikkat hipokampus bölgesinde CA3 deney yapmak için kullanılacak hipokampal doku hazırlanması için dikkat edilmelidir. Nitekim, bu bölgede faaliyet ve sonraki nöronal ölüme epileptiform eğilimli. Böylece synapt87 NaCl, 2,5 KCl, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 1 NaH 2 PO 4: içeren buz gibi soğuk sükroz içinde çözelti hipokampus Diseksiyon (mM olarak) gerçekleştirerek ik aktivitesinin büyük kesit hazırlanması sırasında azaltılması gerekir, ve bu sağlanır , 25 NaHCO 3, 10 Glikoz ve 75 Sakkaroz. Bu çözelti, düşük sodyum, düşük kalsiyum ve magnezyum yüksek konsantrasyonlarda kombinasyon kitlesel böylece spontan aktivite ve hücre ölüm en aza indirerek, presinaptik ateşleme ve serbest bırakma olasılığını yanı sıra, postsinaptik NMDA reseptör etkinliği azaltır. CA3 bölge hücre kayıtları için kullanılan hazırlandıktan sonra hippokampal dilimler polisinaptik aktivitesi en aza indirmek için 4 mM CaCl2, 4 MgSO4 içeren, modifiye ACSF ile perfüze edilir. </li></ol> 2. Akut Hipokampal Dilim Hazırlama <ol><li> Sürekli ile oksijenleme iken, ~ 300 dilimleme oda için ACSF ml &#39;de 4 ° C&#39; de hazırlanması için aşağı serincarbogen. Ayrıca carbogen (Şema Şekil 1) ile oksijenli bir dilim depolanması için oda sıcaklığında (RT) de ACSF küçük bir beher hazırlayın. </li><li> Kafesin içine eklenir 1 ml izofluran ile ıslatılmış küçük bir kağıt havlu ile bir başlık altında fare uyuştur. </li><li> Fare derinden uyuşturulduktan sonra, kafasını kesti ve buz oksijenli ACSF ile küçük bir tabak içine doğrudan ekleyin. Küçük bir makas ile kafa derisi çıkarın ve sonraki adımlar için doku üzerine kafa aktarın. Gösterilen ve Şekil 1 &#39;de tarif edildiği gibi, hipokampus incelemek için başlat. </li><li> Buz düşük hızda (3 mikron / sn) ve 70 Hz titreşim frekansı 300-400 mikron kalınlığında enine dilimler kesin ACSF oksijenli ve bir depolama odasına aktarabilirsiniz. En az 1 saat önce kayıt için RT dilimleri dinlendirin. CA3 deney için dilimleri 34 ° C &#39;de 25 dakika tutulur ve oda sıcaklığında en az 30 dakika, dilimleme işlem kurtarılır. </li></ol&gt; 3. Uyarılmış astroglial Akımlar ve Nöronal Saha Potansiyellerinin Çift Kayıt Biz burada bir ekstrasellüler elektrot kullanarak afference stimülasyonu ile sinaps aktivasyonu ile indüklenen Astroglial ve nöronal yanıtlar, yani yanıtları Synaptically-uyarılmış kaydetmek nasıl açıklar. <ol><li> Sürekli uyarıcı yanıt izole etmek için 100 uM picrotoxin (GABA A antagonisti) içeren, oksijenli ACSF (1.5-2 ml / dk, RT) ile kayıt oda serpmek. Bir poli-L-lizin (1.5 ila 3 mg / ml) kaplanmış lamel üzerine bir dilim aktarın, iyi bir yapışma elde etmek için dilim sıvı emmek ve dilim üzerinde ASCF bir damla ilave edin. Kayıt odasına lamel yerleştirin. Picrotoxin tarafından inhibitör iletim Kuşatması, epileptiform aktivite uyarılmış olayların ölçümü bozar nöronal nüfus yani spontan, senkron pişirim, neden olabilir. Böylece, epileptiform aktivite önlemek için, bir yapmakCA1 ve CA3 bölgeler arasında düz bir kesim (sadece yüzey) Schaffer kollateral (Şekil 2a içinde gösterildiği gibi) aracılığıyla yayılma önlemek için kullanılır. </li><li> Stratum radiatum astrositler kendi küçük soma boyut (~ 10 mikron) ve stellat süreci kurulca tespit edilebilir. En az 20-30 mikron dilim yüzeyinin altında bir hücre seçin. Uyaran izolasyon kutusuna bağlı ve banyo (sadece cam pipet etrafında ikinci gümüş tel sarma ile) topraklanmış gümüş tel üzerinde bir cam stimülasyon elektrod (ucu direnci MΩ ~ 1) monte edin. Schaffer kollateral bölge içine uyarım elektrot yerleştirin, uzak olarak seçilmiş astrosit 200-300 um arasında bir mesafe Şekil 2A&#39;da gösterildiği. Amplifikatörün headstage bağlı klorlu bir gümüş tel üzerine alan kayıt elektrodu (MΩ ~ 2-5) monte edin. Her iki elektrot ACSF ile daha önce doldurulur. Harici com devre I = 0 mod, multiclamp olarak seçinmand giriş ve ~ 50 um uzağa tabaka radiatum bölgesi (Şekil 2A) içine astrosit ikinci elektrot yerleştirin. Kazanç 2 ila 10 ve 2 kHz Bessel filtre ile filtre ile yanıtları kaydedin. Beyin dilim içine Elektrik akım enjeksiyon presinaptik terminallerde çevreleyen Schaffer teminat akson ve sonraki verici sürümü aksiyon potansiyelleri tetikler bu proje postsinaptik CA1 piramidal nöronlar. Yayımlanan vericileri küçük bir negatif potansiyel olarak ekstraselüler ölçülebilir postsinaptik iyonotropik reseptörleri aracılığıyla hücre içine bir pozitif yük akışı, tetikleyecektir. Inhibitör transmisyon farmakolojik olarak bloke edilir iken bu alan eksitatör postsinaptik potansiyeller (fEPSP), aynı anda etkin bir grup nöron faaliyeti entegre. Bir fEPSP uyandırmak için bazı test darbeleri (0,1 msn süreli) uygulayın; stimülasyon elektrod bazı konumlandırılması fEPSP artırmak için yardımcı olabilir. Tipik CA1 stratum radiatum fEPSP Şekil 2B&#39;de gösterilmiştir. Konumlandırma ve tepki dalga ile ilgili daha fazla detay Yuan ve ark bulunabilir. 2003 2. Sağlıklı bir hipokampal dilim fEPSP genlik genellikle lif voleybolu genliği olarak iki kat daha fazla büyük olmalıdır. FEPSP genliği veya eğimi doğru ölçümü için, uyarılmış yanıtı polisinaptik aktivitesi olarak (çok yoğun tepki olarak algılanabilir) sinaptik aktivite hipereksitabilite için bir işaret olabilir elektriksel stimülasyon, bağımsız belirtir monosinaptik olmalıdır. Şekil 3C de gösterildiği gibi, hipokampusun CA3 bölge içinde gerçekleştirilen deneyler için, uyarma ve kayıt pipet konumlandırılır. Açıkça bir kaç saniye için mossy lif kuvvetle kolaylaştırıcı katkılar, paired-pulse stimülasyonu (50 msn strok arası aralık) ve 1 Hz stimülasyon tanımlamak için kitlesel fEPSP responses.At sonuna uyarılmış başlangıçta düşük genlik geliştirmek için uygulanırDeney, DCGIV bir mGluR2 / 3 reseptör antagonisti, daha doğrusu mossy lif girişleri teşvik olduğunu doğrulamak için yıkanabilir arasında. Bu antagonisti Uygulama mGluR2 / 3 reseptörleri, yosunlu lif boutons engelleyecek presinaptik sürüm yüksek ifadesi nedeniyle ~% 90 oranında fEPSP azaltmak gerekir. </li><li> Filtre iç çözümü ile bir yama pipet (MΩ ~ 2-5) doldurun ve ikinci headstage bağlı bir klorlu gümüş tel üzerine monte, pipet tutucu boru ile bağlı bir şırınga ile pozitif basınç uygulayın. Sürekli 10 mV 20 msan testi darbe uygulamak ve hücre yüzeyine ulaşması ve membran bir saptırma görünür olana kadar doku içine pipet hareket ettirin. Ofset pipet Sıfıra, pozitif basınç, kaldırma ve membran kelepçe - 80 mV. Bir gigaseal (en az 1 GΩ) (birkaç saniyeden uzun sürmemelidir) ulaşılana kadar bekleyin. Bazı negatif basınç Nazik uygulaması ag ulaşmak için yardımcı olabilirigaseal. Hücresine Kır negatif basınç, kısa bir uygulama ile elde veya multiclamp içinde zap fonksiyonu kullanılarak edilir. FEPSP ve gerilim kelepçe yılında Astroglial yanıt (-; frekansı 0.1 Hz, bessel filtresi 2 kHz, kazanç 10 80 mV Vhold) uyarılmış Schaffer teminat eşzamanlı kaydı başlatın. Bitişik piramidal hücreler tarafından üretilen fEPSPs yansıtan, hızlı geçici dışa akım göreceksiniz ilk: Astroglial Geçerli cevap iki fazlıdır. Bu yavaş yavaş artan ve çürüyen içe akım (nöronal yanıtlar sona ermesinden sonra devam eden birkaç saniye (&gt; 10 sn)) tarafından takip edilmektedir. Bu akım depolarize postsinaptik terminalleri çevredeki yayınlanmasının ardından, astrositler içine potasyum girişini kaynaklanmaktadır. Presinaptik glutamat salınımını tetiklediği akımı aynı anda aktive hızlı geçici glutamat taşıyıcısı (GLT), potasyum akım tarafından maskelenir. Astrosit yanı sıra, yama erişim direnç tutma potansiyel mo olmalıdırDeney boyunca nitored ve kayıt koşullarda değişiklikler nedeniyle astroglial cevapları arasında yanlış izlenmesi önlemek için, ~% 20 daha fazla değişiklik olmamalı. Ilk tutma potansiyeli&gt; -70 mV Sadece astrositler sağlıklı hücreleri incelemek için araştırılmalıdır. </li><li> Uyarılmış astrositik membran depolarizasyon kaydetmek amacıyla gerilim akım kelepçe geçin. FEPSP tamamen bloke olur ve GLT genlik bir platoya ulaşmıştır kadar iyonotropik glutamat reseptör blokeri kynurenic asit (5 mM) perfüzyon glial glutamat taşıyıcısı (GLT) akımı izole edin. Açıkça GLT akım belirlemek için, spesifik antagonist DL-treo-β-Benzyloxyaspartatic asit (DL-TBOA, 200 uM) de geçerlidir. Farklı sinaptik güçte nöronal ve astroglial yanıtlarını kaydetmek ve paired pulse stimülasyon yanıtlarını araştırmak için iki yakın aralıklı uyaranlara (50 milisaniye aralığı) uygulamak için 5 kata kadar 2 kat stimülasyon gücünü artırın. Seri r Kararlılığıglial hücre esistance ve membran potansiyeli kayıt boyunca izlenmelidir. </li><li> Gap-kavşak ölçüde Astroglial ağları aracılığı görselleştirmek için, boya kaplin deneyler, böyle sulforhodamine-B gibi düşük moleküler boyalar (&lt;1.5 kDa), pasif difüzyon etkinleştirmek için, herhangi bir akım enjeksiyonu olmadan, akım pensi modunda yapılmalıdır gap junction kanalları aracılığıyla. Çevreleyen doku içine boya taşkınlığın en aza indirmek için, doku girerken sadece zaman pozitif basınç yama pipet ile uygulanmalı ve yama kısa sürede ulaşılmalıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Finkel, A., Bookman, R., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6+The+electrophysiology+setup.">Chapter 6 The electrophysiology setup.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Yuan, Y. A., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elelctrophysiological+studies+of+neurotoxicants+on+central+synaptic+transmission+in+acutely+isolated+brain+slices.">Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2003).</li><li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes.">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li><li>Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+monitored+with+astrocyte+transporter+currents+during+LTP.">Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP.</a> Neuron. 21, 425-433 (1998).</li><li>Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+glutamate+release+during+LTP+with+glial+transporter+currents.">Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents.</a> Neuron. 21, 435-441 (1998).</li><li>Pannasch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+networks+scale+synaptic+activity+and+plasticity.">Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).</li><li>Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-evoked+increases+in+extracellular+potassium+modulate+presynaptic+excitability+in+the+CA1+region+of+the+hippocampus.">Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus.</a> J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).</li><li>Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+buffering+during+slow+and+paroxysmal+sleep+oscillations+in+cortical+networks+of+glial+cells+in+vivo.">Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).</li><li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transporters+buffer+synaptically+released+glutamate+on+a+submillisecond+time+scale.">Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).</li><li>Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+glutamate+clearance+and+synaptic+efficacy+by+glial+coverage+of+neurons.">Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons.</a> Science. 292, 923-926 (2001).</li><li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+contribution+to+glutamate+uptake+at+Schaffer+collateral-commissural+synapses+in+the+hippocampus.">Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).</li><li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+uptake.">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li><li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes:+transmitter+uptake+gets+faster+during+development.">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).</li><li>Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+transporter+regulate+glutamate+clearance,+NMDA+receptor+activation,+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus.">Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).</li><li>Davie, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+patch-clamp+recording.">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature. 1, 1235-1247 (2006).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses.">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li><li>Castro, M. A. D. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Ca2++detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes.">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nature. 14, 1276-1284 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature. 13, 759-766 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Synaptically-indüklenen nöronal ve glial cevapların Çift kayıt Astroglial özelliklerinde değişiklikler ilişkili öncesi ve postsinaptik faaliyetlerinde çevrimiçi değişiklikleri incelemek için kullanışlı bir yöntemdir. Synaptically-uyarılmış glial membran depolarizasyon ekstraselüler potasyum presinaptik aksiyon potansiyeli ateşlemesini nedeniyle kısmen artış 8, ama çoğunlukla postsinaptik depolarizasyon 7 doğrudan bir ölçüsüdür. Glial membran potansiyeli dinamik Dolayısıyla kayıt presinaptik uyarılabilir modifikasyonları, postsinaptik aktivitesi, hücre dışı ortamda hacim ve potasyum tamponlama kapasiteleri 6, 8 araştırmak için kullanılabilir. Astroglial glutamat taşıyıcısı güncel sürümü olasılığı 3 kısa vadeli değişiklikler, 5, 9 izlemek mümkün presinaptik glutamat salınımını duyarlı bir önlemdir. Bu ayrıca farklı sinapslarda ya da farklı gelişimsel st fonksiyonel sinaps-glia etkileşimleri karakterize etmek için kullanılır10 yaş. Bu GLTs derece ısıya duyarlı 11 ve Na +, K + ve H +12 elektrokimyasal gradyanı ile tahrik olduğu vurgulanmalıdır. Böylece GLT akımın genliği ve kinetiği çok seçilmiş deneysel koşullara bağlıdır. Buna ek olarak, kaydedilen GLT akım türetilen glutamat astroglial açıklık gerçek zaman süreci kısmen örtülü olduğu bilinmektedir. Bu, bu tür 13 kinetikleri deforme astrositlerin elektrotonik özelliklerini veya asenkron verici salınımlı faktörlerle GLT akımın filtre kaynaklanmaktadır. Filtreleme mekanizmasını geçici özelliklerini çıkarmak yöntemleri geliştirilmiş ve recenly 6,13,14 yaptığı gibi, fizyolojik veya patolojik durumlarda gerçek glutamat boşluk zaman süreci sağlamak için kullanılabilir. Buna ek olarak, astroglial zar depolarizasyon eş zamanlı kayıt, mevcut kelepçe içinde, INSIG sağlayabilirekstraselüler potasyum Transientlerin olası değişiklikler içine hts. Tek astrositler ~ 100 farklı nöron 100.000 sinapsların kadar başvurun, ve bu nedenle entegre yapmak ve yerel nöral ağların aktivitesini modüle. astrosit tekniği kullanılarak burada sunulan, yani kayıt elektrofizyolojik tam hücreli yanıtları bazal sinaptik aktivite içgörüler kazanmak için, bir Astrositlerde, soma düzeyde yama klemp kayıtları tespit akımlar çoğunlukla hücre soma kaynaklanan izin akılda tutmalı veya proksimal süreçler. Reseptörleri ve çoklu ince süreçlerinde meydana gelen kanalların güçlü aktivasyonu hücre soma yayılmasını akımlar üretebilir Gerçekten, soma tespit akımları yalnızca kısmen ince distal süreçleri kaynaklanır. Böylece sinaptik bölmeleri kapsayan bireysel küçük Astroglial süreçlerinde bazal reseptör ve kanal aktivitesi pek algılanabilir. Bu, kısmen sınırlı dolayı tükürdü olduğuin situ astrosit tam hücre yama klemp kayıtları ile membran akım ve gerilimin ial ve temporal kontrolü. Bununla birlikte, küçük bir miktarda astrositik süreçlerin yüzey soma ve ana süreçlerin diyafram alanı tarafından çok fazla olduğu not edilmelidir. Buna ek olarak, bu perisynaptic astroglial microdomains muhtemel neuroglial iletişim ve sinaptik düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır işlevsel olarak uygun reseptörler ve kanallar içerir. Burada sunulan teknik bu nedenle afference uyarımı esnasında özellikle meydana gelen, nöronal topluluklar ikinci senkron aktivite astrositik entegrasyonu incelemek için oldukça yararlıdır. Bu bazal spontan aktivite sırasında oluşan bireysel sinapslar ve bitişik ince astrositik süreçler arasındaki diyalogu incelemek için kullanılmamalıdır. Bazal sinaptik aktivite ile indüklenen yerel Astroglial cevapları incelemek için alternatif bir yöntem ince süreçlerden yama klemp kayıtları gerçekleştirmek için olduğu gibi d olurdudentritler 15 biridir. Yama bu güzel Astroglial süreçleri büyük olasılıkla kendi küçük boyutu nedeniyle zor olmasına rağmen, muhtemelen Astroglial microdomains ve bireysel sinapslar arasındaki daha samimi iletişim çözülmeye sürdürmeye bir cadde. Elektriksel gürültü yama klemp kayıtları ortalama 3-5 pA ulaşılıncaya beri Ancak, bireysel ince Astroglial işlemler sonucu büyük olasılıkla küçük bir elektrofizyolojik Astroglial yanıtları, eşik algılama altında olabilir. Nöroaktif maddelerin astrositik membran reseptörleri veya taşıyıcıları aktivasyonu intraselüler kalsiyum transientler tetikleyebilir beri sinaptik aktivite Astroglial yanıtları okumak için başka bir yöntem, kalsiyum görüntüleme olduğunu. Ancak, kalsiyum göstergeleri ile astrositlerde toplu yükleme de çoğunlukla bedensel aktivite 16 yansıtıyor olabilir. Elektrofizyoloji ve kalsiyum görüntüleme kombinasyonu da ya b kendiliğinden oluşan veya tetiklenen, ince Astroglial süreçlerden küçük kalsiyum sinyallerini veriry az sinaptik stimülasyon 17, 18. Ancak, bir düşük afinitesi göstergeleri algılama seviyesinin altında işe yarayabilecek ise yüksek afinite kalsiyum göstergeleri, kalsiyum tamponlar, inhibe önemli kalsiyum sinyal yolakları gibi hareket olabileceğini akılda tutmak gerekir. Son olarak, aynı zamanda tam hücreli patch-klemp sırasında hücre içi sinyal moleküllerinin arınma circumvents ince astrositik süreçlerinde kalsiyum olaylar, çalışma zarif ve non-invaziv tekniği Astrositlerde ifade edilebilen bir membran hedefli kalsiyum sensör kullanarak oluşur in situ, hem de in vivo 19&#39;da olduğu gibi. Tüm-hücre yama klemp kanal ve reseptör aktivasyonu üzerine tetiklenen tüm farklı iyonik akımların hakkında kantitatif bilgi sağlar, oysa Ancak, kalsiyum görüntüleme sadece bir sinyalleşme birçok yer almaktadır molekülü, ancak tüm hücresel aktiviteleri hakkında bilgi sağlayabilir. Nöronlar ve astrosit nedenle eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtlarneuroglial iyonik sinyalizasyon ve rolünü beynin bilgi işleme dinamikleri çevrimiçi çözülmeye benzersiz ve güçlü bir yöntemdir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Picrotoxin </td><td> Sigma </td><td> P1675 </td><td> DMSO içinde çözülür </td></tr><tr><td> Kynurenic Asit </td><td> Tocris </td><td> 0223 </td><td> 34 çözünmesi ° C karıştırma veya sonikasyon </td></tr><tr><td> DL-TBOA </td><td> Tocris </td><td> 1223 </td><td> DCG IV Tocris 0975 </td></tr></tbody></table>

dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices

Astrositler onlar entegre nerede, nöronlar üçlü sinapslar ile birlikte oluşturmak ve nöronal aktivitesini modüle. Nitekim, astrositler kendi iyon kanalları ve nörotransmitter reseptörlerinin aktivasyonu yoluyla nöronal girdilerin hissedebilir ve gliotransmitters faaliyet bağımlı salınımı ile kısmen işlem bilgileri. Ayrıca, astrositler glutamat için ana alım sistemi oluşturan, potasyum mekansal tamponlama katkıda yanı GABA izni olarak. Bu hücreler bu nedenle sürekli sinaptik etkinliği izlemek ve Synaptically-glutamat salınımının değişiklikler, GABA ve ekstraselüler potasyum seviyeleri için böylece hassas göstergeleridir. Ayrıca, Astroglial alımı faaliyet veya tamponlama kapasitesi değişiklikler nöronal fonksiyonları üzerinde ciddi etkileri olabilir ve fizyopatolojik durumlarda veya nakavt fareler karakterize ederken göz ardı olabilir. Nöronal ve astroglial faaliyetlerinin Çift kayıt nedenle değişiklikler incelemek için önemli bir yöntem olduğunuSinaptik gücü Astroglial alımı ve tamponlama kapasiteleri değişiklikleri eşlik eden ilişkilidir. Burada hipokampal dilim, nasıl stratum radiatum astrositler tespit etmek ve nasıl eşzamanlı nöronal ve astroglial elektrofizyolojik yanıtları kaydetmek için nasıl hazırlanacağını açıklar. Ayrıca, biz farmakolojik Synaptically-uyarılmış Astroglial akımlar izole etmek nasıl açıklar.

Hipokampusun CA1 bölgesinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve nöronal yanıtlar bir temsilcisi, eş zamanlı kayıt (fEPSPs) Şekil 2 AB &#39;de gösterilmiştir. Uyarılmış Astroglial akımı bifazik, yani bu geçici bir dışa akım ve (Şekil 2B) (&gt; 10 sn), yavaşça çürüyen içe akımı oluşur. Dışa akımı uyarılmış fEPSP yansıtır ve kynurenic asit (koyu gri iz, Şekil 2B) 3 tarafından iyonotropik glutamat reseptörlerinin inhibisyonu sonra bloke edilir. Aynı zamanda ana temsil bilinmektedir postsinaptik iyonotropik glutamat reseptör aktivitesini inhibe kynurenic asit (Şekil 2B ve Şekil 2C 1) 3-6, tarafından kaldırılmıştır beri yavaş içe akım çoğunluğu, astrosit aşağıdaki postsinaptik depolarizasyon içine potasyum girişini yansıtır potasyum serbest bırakma 7 kaynağı (% 80). Kalan hızla bir yükselend çürüyen içe akım GLT antagonisti DL-TBOA (açık gri iz, Şekil 2B ve Şekil 2C 2) tarafından inhibe edilir. Kynurenic asit (koyu gri eser) olarak akım dan TBOA (açık gri iz) içinde geriye kalan yavaş akım post-hoc çıkarma akımı saf astroglial glutamat taşıyıcı (siyah iz), ve izolasyon olarak Şekil 2C&#39;de 2&#39;de gösterildiği izin verir. Kalıcı yavaş kynurenic asit mevcut çürüme ve TBOA (açık gri iz, Şekil 2B ve Şekil 2C 2) TTX (veriler gösterilmemiştir) tarafından engellendi, ve büyük olasılıkla ekstraselüler K birikimi yansıtan + presinaptik afferent pişirim 3 sırasında serbest bırakılabilir. Schaffer kollateral orta tek uyarılması aynı hücre (Şekil 2B) kaydedilen küçük uyarılmış depolarizasyon nazaran göreceli olarak büyük bir Synaptically ile uyarılan astroglial akıma neden olmaktadır. Bu nedeniyleastrositlerde düşük membran direnci. Synaptically-uyarılmış Astroglial membran potansiyeli dinamiklerinin Kaydı, Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, yerel ekstraselüler potasyum düzeyleri 8 doğrudan bir ölçüsüdür. Yatan nöronal aktivite uyarılmış Astroglial yanıtların Normalizasyon, farklı deneylerin doğrudan karşılaştırma gibi son 6 gösterildiği sağlar. Toplam Synaptically ile uyarılan akım astroglial doğrusal fEPSP artış (Şekil 2E) aşağıdaki gibi astroglial akımlar ayrıca, çok güvenilir bir şekilde eksitasyon iletiminde değişiklik izleyebilir. Onlar göstermek yana astroglial akımlar da, kısa vadeli sinaptik plastisite yansıtacak, nöronlar gibi, paired-pulse kolaylaştırma (Şekil 2F). Bir CA1 piramidal hücre ve bir astrosit eşleştirilmiş tüm-hücre kaydı, bir depolarize darbe yanıt olarak gösterge nöron aksiyon potansiyelleri, çünkü her iki hücre tipi çok farklı davranış göstermektedir elektrofizyolojikkomşu astrosit (Şekil 3A-B) sessiz iken. Bununla birlikte, Schaffer kollateral orta uyarılması aynı anda CA1 piramidal hücre ve bitişik astrosit (Şekil 3B 2) içinde bir hızlı dışa doğru ve içe doğru akımlar içinde yavaş bir hızlı uyarıcı potansiyel posynaptic uyandırabilir. Şekil 3C &#39;de gösterildiği gibi Synaptically ile uyarılan nöronal astroglial ve çift kayıt cevaplar arasında, aynı zamanda, hipokampusun CA3 alanında kaydedilmiştir. Nitekim, CA3 yosunlu liflerinin tek uyarılması bazal koşullarda Astrositlerde hızlı küçük dışa ve içe yavaş akımlar (Şekil 3B 1) ile ilişkili yerel fEPSPs olarak kaydedilen çok küçük nöronal tepkiler çağrıştırıyor. Sadece orta Astroglial yanıt (Şekil 3D 2) artırırken aksine, birkaç saniye için CA3 yosunlu liflerinin 1 Hz stimülasyon şiddetle fEPSP artırmaktadır. Enine dilimlerin hazırlamak için 1. Hippocampus izolasyon Şekil. Beyin teşrih için orta hat (a) boyunca kafatası kesti. Koku ampul (b) düzeyinde ve daha sonra beyincik (c) seviyesinde bir koronal kesim olun. Dikkatlice bir forseps (d) yardımıyla kafatası kaldırmak, bir bıçak (e) ile iki hemisfer ayırın ve soğuk oksijenli ACSF (f) içine küçük bir kaşık üzerine aktarabilirsiniz. ~ 5 dakika dengelenme sonra yukarı medial yüzeyi (g) kuru doku üzerinde bir yarımkürede yerleştirin. Iki kaşık yardımı ile diensefalon (hj) çıkarın. Kesik çizgi (k) &#39;da gösterildiği gibi, hipokampus, şu anda görülebilir. Beyaz yapı (lm) olarak görünür, fimbriyalarına başlayarak, bir kaşık ile hipokampus dışarı teşrih. Soğuk ACSF geri hipokampus aktarın. Küçük agaroz-blok, Alveus tarafı konumu iki hipokampi yukarı ve ventral hippocamp hazırlayınbize agar blok kenarına bakacak ve agar (n) için bir iyi tutunmasını sağlar uzağa dikkatlice sıvı ıslatın. Tutkal hipokampus karın kısmı (o) üzerine agar kümesine bağlanır. <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2highres.jpg"/> Şekil 2. Hipokampus CA1 bölgesinde-Synaptically uyarılmış Simultane nöronal ve astroglial yanıtları. A) astrositik akımları kaydetmek için Schaffer teminatlar (SC), yama pipet elektrot, etkinleştirmek için uyarıcı elektrot düzenlemesi gösteren hipokampal dilim ve ekstraselüler elektrot, Şema hipokampal SC uyarılması tarafından uyarılmış, fEPSP kaydetmek için CA1 alanı. B) fEPSPs eşzamanlı kayıtları (üst panel) ve uyarılmış Synaptically presenc SC uyarılmasıyla astrositik akımları (alt panel) Temsilcisi izleriFarmakolojik ilaçlar e. Yanıtları ilk GABA eksitatör yanıtları yalıtmak için bir reseptör blokeri (picrotoxin, 100 uM, siyah izleri) varlığında kaydedilir. Bir iyonotropik glutamat reseptör blokeri (kynurenic asit, 5 mM, koyu gri izleri) daha sonraki uygulama, astrositik geçerli yanıt bir küçük ve hızlı geçici bileşeni, maskesini düşürüp fEPSP ve uzun ömürlü Astroglial akımının büyük bir kısmı inhibe Bir glutamat taşıyıcı engelleyicisi (TBOA, 200 uM, açık gri izleri) duyarlı. Ölçek çubuğu, fEPSP 0,1 mV, astrositik mevcut 15 pA, 10 msn. C 1). Toplam akım dan kynurenic asit (2) içinde kalan akım bileşeninin çıkarılması ile B (alt panel, siyah trace) &#39;de gösterildiği uyarılmış yanıt, izole edilebilir akım astroglial potasyum (1-2), numune izleme ( 1). Ölçek çubuğu, 20 pA, 1 sn. TBOA i çıkarılması ile elde edilen akım glutamat taşıyıcı (2-3), C 2) Örnek izkynurenic asit (2) &#39;den akım nsensitive yavaş bileşen (3). Ölçek çubuğu, 2.5 pA, 25 msn. D) bir içeriye doğru akım numune izleri voltaj-kelepçe (alt panel) ve SC uyarım ile bir astrosit indüklenen akım kelepçe (üst panel) içinde kaydedilen karşılık gelen membran depolarizasyon kaydedildi. Ölçek çubuğu, 1,5 mV, voltaj-klemp 5 pA, 1 sn akım kelepçe. E) presinaptik elyaf mermileri (giriş) ve (çıkış) toplam astroglial akımı arasındaki ilişkiyi gösteren girdi-çıktı eğrileri SC uyarım (n = 6) yanıt olarak eş zamanlı olarak kaydedilir. Nöronal fEPSP lineer olarak artan lif yaylım ile Astroglial akım artar. F) nöronal yanıt (fEPSP) ve astrositik akım Örnek izleri, 40 milisaniye strok arası aralıklarda eşleştirilmiş-nabız uyarılması için gösterilmiştir. Synaptically-uyarılmış Astroglial güncel sergiler, nöronlar, paired-pulse kolaylaştırma gibi. Ölçek çubuğu, 0,1 mV, 5 pA, 20 msn. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3highres.jpg"/> Şekil 3,. Hipokampusun CA1 ve CA3 alanlarda Synaptically ile uyarılan nöronal ve astroglial yanıtları Çift kayıtları. A) sulforhodamine-B (kırmızı,% 0.1) ve tüm-hücre yama klemp tekniği kullanılarak, floresein dekstran (yeşil,% 0.1) ile dolu bir astrosit enjekte bir CA1 piramidal hücre Rekonstrüksiyonu. Ölçek çubuğu, 10 mikron. B 1) CA1 piramidal hücre ve bitişik bir astrosit akım-kelepçe kaydedilen membran potansiyelleri aynı anda tam hücre kayıtları Temsilcisi izleri. Nöronal aksiyon potansiyeli ateşlemesini (siyah iz), akım darbesi depolarizan 20 pA enjeksiyonu ile uyarılmış, bitişik astrosit (gri iz) hiç tepki uyandırır. Ölçek çubuğu, 20 mV, 10 pA, 100 msn. Akım-cisim bir CA1 piramidal hücre çift tam hücre kayıtları B 2) Numune izlerip ve picrotoxin (100 uM) varlığında, SC uyarıldıktan sonra voltaj-kelepçe komşu bir astrosit. SC stimülasyon (gri iz) küçük ve uzun ömürlü astrositik akımı ile ilişkili bir eksitatör postsinaptik potansiyel (EPSP, siyah iz) çağrıştırıyor. Ölçek çubuğu, 5 mV, 10 pA, 100 msn. C) hipokampal dilim Scheme yosunlu lifler, yama pipet elektrot (gri), astrositik akımları kaydetmek ve ekstraselüler elektrot, etkinleştirmek için, dentat girus (DG) ve CA3 alanlarda uyarıcı elektrot düzenlenmesinde betimleyen CA3 yosunlu liflerinin uyarılması tarafından uyarılmış rekor fEPSP. CA3 fEPSPs eşleştirilmiş kayıtları (üst panel, D 1 ve D2 olarak siyah izleri) ve astrositik tüm-hücre tepkileri (alt panel, D 1 ve D2 olarak gri izleri) CA3 yosunlu tek uyarılması ve D, E) Örnek izleri 0.02 Hz (içerlek yakınlaştırma) (D 1) veya 1 Hz stimülasyon frekansı (D 2) lifleri. D Ölçeği bar <sub&gt; 1 ve D 2, 0,2 mV, 15 pA, zaman: D 1 1 saniye; D 2 100 msn. Inset ölçek çubuğu, 0,1 mV, 100 msn.

Watch this Scientific Journal Video about Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices at JoVE.com

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik hazırlanması<em&gt; Stratum radiatum</em&gt; Schaffer kollateral uyarımı esnasında tarif edilmektedir. Astroglial ve potasyum glutamat taşıyıcı akımlarının farmakolojik izolasyon gösterilmiştir.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

dual-electrophysiological-recordings-synaptically-evoked-astroglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.2K Görüntüleme.  Collège de France. İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik hazırlanması Stratum radiatum Schaffer kollateral uyarımı esnasında tarif edilmektedir. Astroglial ve potasyum glutamat taşıyıcı akımlarının farmakolojik izolasyon gösterilmiştir.

Video: Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). These gonadotropins are essential for the regulation of reproductive function. The GnRH-containing neurons are distributed diffusely throughout the hypothalamus and project to the median eminence where they release GnRH from their axon terminals into the hypophysiotropic portal system (1). In the portal capillaries, GnRH travels to the anterior pituitary gland to stimulate release of gonadotropins into systemic circulation. GnRH release is not continuous but rather occurs in episodic pulses. It is well established that the intermittent manner of GnRH release is essential for reproduction (2, 3).
Coordination of activity of multiple GnRH neurons probably underlies GnRH pulses. Total peptide content in GnRH neurons is approximately 1.0 pg/cell (4), of which 30% likely comprises the releasable pool. Levels of GnRH during a pulse (5, 6), suggest multiple GnRH neurons are probably involved in neurosecretion. Likewise, single unit activity extracted from hypothalamic multi-unit recordings during LH release indicates changes in activity of multiple neurons (7). The electrodes with recorded activity during LH pulses are associated with either GnRH somata or fibers (8). Therefore, at least some of this activity arises from GnRH neurons.
The mechanisms that result in synchronized firing in hypothalamic GnRH neurons are unknown. Elucidating the mechanisms that coordinate firing in GnRH neurons is a complex problem. First, the GnRH neurons are relatively few in number. In rodents, there are 800-2500 GnRH neurons. It is not clear that all GnRH neurons are involved in episodic GnRH release. Moreover, GnRH neurons are diffusely distributed (1). This has complicated our understanding of coordination of firing and has made many technical approaches intractable. We have optimized loose cell-attached recordings in current-clamp mode for the direct detection of action potentials and developed a recording approach that allows for simultaneous recordings from pairs of GnRH neurons.

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Activity in neuronal systems often requires synchronous action potential discharges from neurons within a specific population. For example, pulses of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) likely require coordinated activity between GnRH neurons. We present our methodological approach for reliably obtaining simultaneous electrophysiological recordings from the diffusely distributed GnRH neurons.

Çift Somatik Kayıtlar Gonadotropin-Releasing Hipotalamik Dilimleri Yeşil Floresan Protein (GFP) Belirlenmiş Hormon (GnRH) Nöronlar

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Nörobilim

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Kemirgenler gelen akut Hipokampal Dilimleri kullanarak Synaptic Etiketleme / yakalama ve Çapraz yakalama İncelenmesi

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Akut<emIn vivo</em&gt; Anestezi Uygulanan Sıçanlarda Hiperdirect Pathway&#39;den Lokal Alan Potansiyellerinin Elektrofizyolojik Kayıtları ve Çoklu Ünite Aktivitesi

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Elektrofizyolojik Kayıtlar için Akut İnsan Hipokampal Dilimlerinin Hazırlanması

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler