Beyin protein sentezinin bölgesel oranlarının ölçümü, beynin gelişim ve nöroplastisite sırasında meydana gelen uzun süreli değişikliklere tepkisini izleyebilir. Yöntemimiz ölçümlerin tamamen niceliksel olması ve uyanık davranan hayvanda üretilmesi gibi avantajlara sahiptir. Kantitatif otoradyografik teknik tüm beyin bölgelerinde aynı anda ölçümlere izin verir.
Prosedürü gösteren Anita Torossian, benim laboratuvarımda bir bakalorya sonrası adam, ve Tianjian Huang, bizim hayvan cerrahı. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi ameliyat için hazırlık ile bu işlem başlayın. Ameliyat aşamasında bir kez, femoral arter ve ven ortaya orta hatta doğru sol uyluk rostrally üst medial kısmından bir santimetrelik kesi yapmak için cerrahi makas kullanın.
Kesiğin her iki tarafında cerrahi deri kancaları ile gevşek deri geri çekin. Cilt kancalarını ameliyat aşamasına kaydederek sabitleyin. Yeterli nemi korumak için maruz kalan bölgeye %0,9 sodyum klorür uygulayın.
Femoral arter ve ven küçük bir bölümü etrafında bağ dokusu ayıran, künt diseksiyon için forceps kullanın. Arter ve damarı dikkatlice ayırın. Şimdi kesi en lateral noktada hem femoral ven ve arter altında emilebilir dikiş iplik forseps kullanın.
Dikişatını yarıya doğru çekin ki uçları eşit bilsin. Kasık için daha proksimal bir noktada, sadece femoral ven altında ikinci bir dikiş iplik için forceps kullanın. Yavaşça kan akışını kısıtlamak için kullanılacak bir yarım düğüm kravat.
A ve iplik b arasındaki bir noktada, sadece femoral ven altında üçüncü bir dikiş iplik için forceps kullanın. Yavaşça kan akışını kısıtlamak için kullanılacak tam bir düğüm kravat. Damarı yırtmamaya dikkat et.
Kan akışını kısıtlamak için b ipliğini yavaşça çekiştirin. Kan kısıtlamasını korumak için b iplikçiklerini yavaşça römorkörlemek için hemostat kullanın. Şimdi, PE borunun kesik olmayan ucunu 32 kalibrelik bir iğneye ve heparinize salinle dolu bir milimetreşile bağlayın.
Hava kabarcıklarını temizlemek için kateteri temizle. Mikro makas ile femoral ven sınırlı alanda küçük bir delik kesin ve dikkatle iplikçik B.Once yerleştirilen doğru kızartılmış PE sekiz boru açılı ucunu takın, iplikçik B gerginliği bırakın ve ven daha fazla kateter kılavuzu. Kateteri içeren damarın etrafındaki B ipliğini sıkın.
İplik C kullanarak, kateter etrafında ek bir düğüm kravat. Bu düğümün femoral arteri yakalamadığından emin ol. Kateterin aynı prosedürü kullanarak sol femoral artere PE 10 kateter takmadan önce düzgün implante edilmiş olduğundan emin olmak için kısmen kan ile tüp doldurmak için şırınga varil üzerinde yavaşça geri çekin.
Femoral ven ve arter kateterleri emniyete alındıktan sonra, a ipliğini her iki kateterin etrafında bir düğüme bağlayın. Tüm aşırı dikişleri kestikten ve deri kancalarını çıkardıktan sonra, pıhtılaşmayı önlemek için arteriyel kateteri heparinize salinile yıkayın. Bir mühür oluşturmak için her iki kateter in uçlarını cauterize.
Fareyi yatkın konuma getirin ve boyun tabanında küçük bir kesi yapın ve maruz kalan bölgeye tuzlu su uygulayın. Boyun kesisinden femoral kesiye kadar içi boş bir metal çubuk yerleştirin. Yılan içi boş çubuk ve boyun kesi dışarı kateterler.
İçi boş çubuğu çıkardıktan sonra, femoral kesiyi dikişle kapatın ve ardından ameliyat sonrası analjezi. Yılan 30 santimetre esnek içi boş tüp ile bahar tether yapmak için deri altında bahar tether düğmesini dikiş önce cerrahi sonrası analjezi takip. Kurtarma döneminde fareyi barındırmak için fareyi döner bir montaj ve kol ile açık bir silindirik kap içine taşıyın.
Fareyi sıcak tutmak için kabın altına bir el ısıtıcı yerleştirin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi örnekler alarak farenin denemenin başlangıcında normal bir fizyolojik durumda olduğundan emin olun. İzleyiciyi intravenöz olarak yönetmek için, bir kola bağlı C 14 etiketli lösin izleyicisini tutan bir şırınga ve diğer kola bağlı venöz hattı yıkamak için 100 ila 200 mikrolitre steril salin içeren bir şırınga kullanın.
Y-konektörü venöz çizgiye bağlayın. Aynı anda bir durdurma saati başlatarak, tracer enjekte ederek ve zamanlanmış arteriyel kan örnekleri toplayarak çalışma başlatın. Enjeksiyondan hemen sonra venöz hattı tuzlu suyla yıkayın.
Deneyin ilk iki dakikası boyunca aynı şekilde kan örneklerini bir'den 7'ye sürekli olarak toplayın. Yedi örnek topladıktan sonra, kalan her örnek önce ölü uzay kanı 30 mikrolitre toplamak. Sekizden 14'e kadar olan örnekler sırasıyla üç, beş, 10, 15, 30, 45 ve 60 dakika olarak toplanır.
Deney sırasında bir noktada, metin protokolünde ayrıntılı olarak tritiated lösin ve norleucine içeren iç standartlar için üç tüp süreci. Plazma lösin konsantrasyonlarını ölçmek için, bir sodyum katyon değişim sütunve post kolon ortoktaldehit ve flourometric algılama ile bir HPLC sistemi kullanın. Lösin eğrisinin altındaki alan örnekteki lösin konsantrasyonu ile orantılıdır.
Örneklerdeki lösin konsantrasyonlarını ölçmek için standartlarla karşılaştırmayı kullanın. Daha sonra plazma örneklerinde dakikada trityum ve C 14 parçalanmalarını ölçmek için sıvı bir sintillasyon sayacı kullanın. Dolaşımdan C 14 etiketli lösin ve arteriyel plazmadaki spesifik aktivitesinin zaman dilimini oluşturmak için bu konsantrasyonları kullanın.
Grafikten, arteriyel plazmadaki lösin spesifik aktivitesi etiketli entegre C 14'ün hesaplamasını. Kantitatif otoradyografi yapmak için, kalınlıkta 20 mikron beyin kesitleri hazırlayın. Eksi 20 santigrat derecede bir kriyostat yoluyla kesit beyin.
Jelatin kaplı slaytlar üzerinde çözülme montaj bölümleri. Slaytların fiksasyonundan sonra, slaytları daha önce kalibre edilmiş C 14 etiketli metil metakrilat standartları yla birlikte x-ray film kasetinde düzenleyin. Karanlık bir odada ve güvenli ışık altında, x-ray film bir parça yerleştirin, yanlar ve standartlar üzerinde emülsiyon tarafı aşağı.
Kaseti kapatın ve siyah bir soyunma çantasına koyun. Üreticileritalimata göre film geliştirmek. Arka plan düzensiz olabileceğinden ve niceliği etkileyebileceğinden otomatik film geliştirme önerilmez.
Filmdeki kalibre edilmiş standartlar kümesinin optik yoğunluk değerlerine göre optik yoğunluk ve doku C 14 konsantrasyonuna karşı bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Bu verileri polinom denklemine sığdırın. Ya ikinci ya da üçüncü derece polinom denklemi çok iyi uyuyor.
Belirli beyin bölgelerini analiz etmek için, bir beyin atlası ile karşılaştırıldığında altı ila sekiz bölümde ilgi veya RoI bölgesini bulmak. Tüm bölümlerdeki bir YG içindeki piksellerin optik yoğunluğunu kaydedin. Kalibrasyon eğrisine bağlı olarak, her pikseldeki C 14 konsantrasyonundaki dokuyu hesapla.
Son olarak, gyon ortalama doku C 14 konsantrasyonu zaman t ve lamba etiketsiz ve etiketli lösin arteriyel plazma konsantrasyonlarının oranlarının integralinde serebral protein sentezinin bölgesel oranlarını hesaplamak. Plazmadan gelen doku öncü havuzundaki lösin fraksiyonu. Burada gösterilen bir araç tedavi hayvan anisomisin ile tedavi edilen bir hayvan ile karşılaştırıldığında temsili görüntüler, protein sentezinin bir inhibitörü.
Protein sentezi oranları görüntüdeki karanlık düzeyi ile orantılıdır. Anisomisin büyük ölçüde bu yöntemin özgüllüğünü gösteren beyin protein sentezi ölçülen oranlarını azaltır. Burada, sayısallaştırılmış otoradyogramlar hipokampus ve hipotalamus düzeyinde uyanık davranan bir fare gösterilir.
Karanlık bölgelerde serebral protein sentezinin daha yüksek bölgesel oranları vardır. Burada gösterilen dorsal hipokampus düzeyinde uyanık davranan kontrol farebir sayısallaştırılmış otoradyogram. Serebral protein sentezi oranları renk çubuğuna göre görüntülerde renk kaplıdır.
Bu prosedürü denerken, ölçümler sırasında hayvanların normal fizyolojik durumda olduğundan emin olmak önemlidir. Metodolojimiz, Fragile X sendromu gibi nörogelişimsel bozukluklarda protein sentezinin düzensizliğini göstermiştir. Aynı zamanda dejeneratif değişiklikler ve Alzheimer hastalığı gibi koşullar için yararlı bir belirteç olabilir.
Protein sentezi yöntemi, protein sentezindeki değişiklikleri belirli proteinlerdeki bölgesel değişikliklerle ilişkilendirmek için alternatif kesitlerde immün histokimya ile birlikte kullanılabilir. Özetle, kantitatif otoradyografik L-1 C 14 lösin yöntemi in vivo protein sentezinin bölgesel oranlarının doğru belirlenmesi için idealdir. Doğruluk ve in vivo koşullara uygulanabilirliği açısından önemli avantajlar sunar.
