Biz Dr. Yijun Song ve üyeleri, tavsiye ve yardım için Johns Hopkins Üniversitesi Biyoloji Bölümü Hattar Kuruvilla Zhao tri-lab teşekkür ederim. NIH hibe DC007395 ve DC009946 tarafından desteklenir.

Bölüm 1. EOG kayıt kurulum Kayıt cihazları, kayıt elektrodu, referans elektrodu, hava teslim tüp numune aşama, ve diseksiyon mikroskobu, bir Faraday kafesi içinde bir hava masaya demirlemiş oluşur. Mikromanipülatörler, Elektrotların yerleştirilmesi ve hava teslim tüp kullanılır. Sürekli bir hava akımı, hava teslimat tüp aracılığıyla ve örnek üzerinden geçirmeden önce nemi eklemek için distile su ile kabarmış. Sylgard 6-8 mm derinliğe kadar dolu bir 60 mm kültür çanak örnek için bir montaj yüzeyi olarak kullanılır. Bir kuyu ve bir kanal elektrikle modifiye Ringer solüsyonu ile numune referans elektrot bağlamak için bir araç sağlamak için montaj çanak Sylgard oyulmuştur. Kayıt elektrot ve referans elektrot bir amplifikatöre bağlı. Amplifikatör gelen sinyaller bir bilgisayar sonra sayısallaştırıcı gönderilen ve. Axograph veya pClamp Yazılım stimülasyon protokolü kontrol etmek için sinyal kayıt ve yanıtları sonraki analiz için kullanılabilir. Amplifikatör sonra bağlı bir osiloskop kayıt elektrot yerleştirerek elektrik potansiyeli gerçek zamanlı izleme ve EOG kayıtları sırasında uygun olabilir. Odorant uyaranlara teslimi sinyal alımı için kullanılan aynı bilgisayara bağlı bir Picospritzer tarafından kontrol edilir. Picospritzer hava basıncı 10 psi ayarlanır. Tek bir hava tankı ve regülatör hava masa ve Picospritzer her iki hava besleme için kullanılabilir. Ikinci bir hava tankı ve regülatör, bu daha düşük bir basınç ve hava akımı büyük miktarda gerektirdiği gibi, nemlendirilmiş hava akışı için hava sağlamak için kullanılır. Hemen önce bir odorant uyaran teslim Picospritzer çıkışı bir odorant şişe bağlanır. Odorant şişesi sonra hava teslim tüpüne bağlı. Bölüm 2: elektrotlar hazırlanması Kayıt elektrot çekti cam kapiller modifiye Ringer çözeltisi (135 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM CaCl 2, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM Hepes, pH 7.4, filtre steril) ile dolu bir chlorided gümüş tel. Referans elektrot, chlorided gümüş tel. <ol><li> Elektrot tutucu içine gümüş tel yükleyin. Kayıt elektrodu için, 1-2 santimetre tel elektrot tutucu ucundan dışarı çıkmalıdır. Daha fazla tel referans elektrot için bırakılabilir. </li><li> AgCl kat gümüş tel eklemek için 0,1 M NaCl tel konumu ve elektrot tutucu bir 1,5-9 V DC güç kaynağının pozitif terminaline bağlayın. Elektriksel güç kaynağı negatif terminaline 0,1 M NaCl çözeltisi bağlı olmalıdır. 10 dakika boyunca devam chloriding reaksiyon izin verin. Kayıt ve referans elektrot arasındaki herhangi bir statik yükü eşitlemek için, kısaca kayıt cihazları bunları yüklemeden önce elektrotlar birbirine dokunacak. </li><li> Bir bardak, bir mikropipet çektirmenin kullanarak kapiller çekin. Kapiller ucunda açılış çapı 5-10 mikron civarında olmalıdır. </li><li> Kılcal künt ucu, gümüş tel ~ 2 cm daha uzun, böylece skoru ve koparak bir elmas kalem kullanın. Yangın lehçe bütan meşale ile kesme ucu. </li><li> Modifiye Ringer solüsyonu% 0.5 &#39;lik agaroz eritin. Elektrodun ucu bir transfer pipet kullanarak içine küçük bir miktar erimiş agaroz çözüm çekin. </li><li> Şekilde modifiye Ringer solüsyonu (bu amaç için yararlı ısıtılır ve uzun ince bir sonu var çekti bir şırınga) ile yaklaşık 1 / 2 çekti kılcal doldurun. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için yavaşça kılcal fiske. Kullanılmak üzere hazır olana kadar dolu elektrot alt modifiye Ringer çözüm küçük bir miktar ile bir kavanozda saklayın. Bir doku örneği hazırlanmış ve kayıt için hazır sonra, kayıt elektrot teli üzerinde bir dolu kılcal yükleyin. </li></ol> Bölüm 3: odorant çözümler hazırlanması Koku amil asetat ve heptaldehyde büyük tepkiler uyandırmak ve böylece EOG uyarıcılar olarak iyi seçimler. <ol><li> Mikrosantrifüj tüplerde, dimetil sülfoksit (DMSO) odorant dilüsyonları bir dizi hazırlamak. Bir doz-yanıt eğrisi için bir başlangıç ​​noktası olarak, 5 M 5 ila 10 kat dilüsyonlarının hazırlamak x 10 -6 M. Solüsyondan her gün yapın. </li><li> Ayrıca silikon tıpa ile 2 gram şişelerde 4.9 mL su ile DMSO 100 mcL seyreltilmiş hisse karıştırılarak suda 50 kat koku sulandırmak. Çözümleri, en az 30 dakika şişelerde muvazene edelim. Her şişe koku maddesi buhar konsantrasyonu bilinmeyen olduğunu unutmayın, ancak sıvı faz koku konsantrasyonu bir fonksiyonu olarak değişecektir. </li><li> P silikon tıpa ile iki adet 18 gauge iğne takınrovide giriş ve çıkış portları. Şişe kullanımda değilken portlar takılmalıdır. </li></ol> Bölüm 4: EOG ve analiz veri kaydetme <ol><li> Kurban dekapitasyon tarafından takip CO 2 ötenazi veya anestezik doz aşımı bir fare. Kafatası örten deri çıkarın ve sagittally orta hat boyunca baş iki eşit parçaya böler. </li><li> Montaj çanak, başın bir yarısında, iç tarafa monte edin. Konkalar maruz septum dikkatlice çıkarın. </li><li> Doku ile kayıt aşamasında monte edilmiş çanak yerleştirin. Konkalar kayıt konumu mikroskop altında merkezli olduğu için, sahne aynı hizaya getirin. </li><li> Konka yüzey nemlendirilmiş hava hava tankı üzerine çevirin. Pozisyon hava teslim tüp böylece kayıt yerden yaklaşık 10 mm uzaklıkta. Akış hızı ~ 600 ml / dak. </li><li> Low-pass filtre, 1 kHz ve 100X kazandıracağı DC modu (AC amplifikasyon EOG sinyali eserler neden olacaktır) amplifikatör ayarlayın. </li><li> Mikromanipülatörler Mount kayıt ve referans elektrotlar. </li><li> Montaj çanak kuyuya referans elektrot Alt ve doku elektrikle bağlı olduğu gibi modifiye Ringer solüsyonu ile kapatın. </li><li> Konka IIb veya III yüzeyine kayıt elektrot dikkatlice düşük. Elektrot ancak olfaktör epitelin yüzeyine dokunmayın! Elektrot epitel ile temas söz konusu olduğunda (örneğin bir elektrik devresi tamamlar) düz bir taban osiloskop görünecektir. </li><li> Odorant şişe hava teslim tüp yan bağlantı noktasına takın. </li><li> Bilgisayarda, bir stimülasyon protokolü başlatın. Veri elde etmek için örnekleme oranı, 2 kHz veya daha yüksek olmalıdır. Yazılım bir koku darbe tetikleyebilir ve kayıt başlayacaktır. </li><li> Tipik bir stimülasyon protokolü 100 msn bakliyat 1 sn aralığı ile ayrılmış eşleştirilmiş 100-msn süre tek darbe, ya da 10 saniye sürekli darbe olabilir. </li><li> Protokolleri arasındaki doku minimal adapte bu yüzden biraz zaman tanıyın. Bir dakika amil asetat ve 10 -3 M heptaldehyde sıvı konsantrasyonları için yeterli olur; yüksek konsantrasyonlarda az 5 dakika izin verir. Yüksek koku konsantrasyonu (sonunda bir doz-yanıt eğrisi gibi) teslim ettikten sonra artık koku tüp içinde kalabilir. % 95 etanol ile yıkayın ve hava tüpü ek doku örnekleri ile devam etmeden önce kuru. </li><li> Axograph yazılımı EOG sinyali önemli parametreleri ölçmek için araçları sağlar. Bu parametreleri yanıtı genlik, latans zirve zamanı ve fesih zaman sabitleri içerir. Bu, dijital daha fazla analiz önce 25 Hz&#39;de izlerini filtre istenebilir. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. EOG analiz için Parametreler. EOG çeşitli parametreleri yanıtı genlik, latans (uyaran uygulanan ve yanıt başlar arasındaki zaman), yükselme zamanını (başlangıcı arasındaki süre de dahil olmak üzere, fareler arasında karşılıklar karşılaştırma, özellikle yararlı tepki ve pik), tepe (stimülasyon başından itibaren yanıt zirvesine zaman) ve sabit fesih süresi (τ, tek bir üstel denklem yanıt çürüme aşamasında uygun belirlenen .) , Gecikme, yükselme zamanı, ve sabit bir zaman fesih olarak kinetik parametrelerin karşılaştırılması için, bu analizden önce tepkilerin tepe genlik normalleştirmek için tavsiye edilir. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Temsilci farklı stimülasyon protokolleri altında sinyalleri EOG uyarılara yanıt olarak bir fare EOGs (a) Örnekler amil asetat artan konsantrasyonları ile. Panelin üst kısmında siyah bir çizgi odorant stimülasyon zamanlaması ve süresi gösterir. Efsaneye konsantrasyonları sıvı solüsyon konsantrasyonlarının. (B) Bir doz-cevap ilişkisi beş farelerden alınan ortalama. Hata çubukları,% 95 güven aralığı. Tepe genlik azalması, sık sık, çok yüksek kokusu konsantrasyonlarda görülmektedir. (C), eşleştirilmiş bir darbe stimülasyonuna yanıt olarak bir EOG bir örnek. Odorant tek bir kısa pulse birkaç saniye süren adaptasyon ortaya çıkarır. (D) 10 sn yanıt EOG bir örnek odorant stimülasyon sürdürmüştür. EOG sürekli odorant sunum sırasında duyarsızlaştırma gösterir.

<ol>
	<li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium.">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, 1-83 (1956).</li><li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroolfactogram:+a+review+of+its+history+and+uses.">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li><li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel.">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li><li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+in+G(olf)+are+anosmic.">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li><li>Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice.">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27, 487-497 (2000).</li><li>Munger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+the+CNGA4+channel+subunit+in+Ca2+-calmodulin-dependent+odor+adaptation.">Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation.</a> Science. 294, 2172-2175 (2001).</li><li>Michalakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CNGB1+protein+leads+to+olfactory+dysfunction+and+subciliary+cyclic+nucleotide-gated+channel+trapping.">Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping.</a> J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).</li><li>Buiakova, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+marker+protein+(OMP)+gene+deletion+causes+altered+physiological+activity+of+olfactory+sensory+neurons.">Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).</li><li>Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+chloride+accumulation+in+olfactory+epithelium+of+mice+lacking+NKCC1.">Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1.</a> J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).</li><li>Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+CNG+channel+desensitization+by+Ca2+/CaM+via+the+B1b+subunit+affects+response+termination+but+not+sensitivity+to+recurring+stimulation.">Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation.</a> Neuron. 58, 374-386 (2008).</li><li>Cygnar, K. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons.">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+"IP(3)-odors".">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li><li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice.">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li><li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram.">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li><li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram.">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li></ol>

Fare, Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanan yöntemler ile ele ve ötenazi uygulandı.

Bu protokol açıklanan kurulum ile olfaktör epitel yüzeyinde odorant uyaranlara, tam odorant konsantrasyon ve dinamikleri bilinmiyor olsa bile, vahşi tip ve mutant fareler arasında karşılaştırma sağlayan doku hazırlıkları arasında tutarlı olacaktır. Çeşitli faktörler, özellikle kayıt yeri ve nemlendirilmiş hava akış hızı, EOG değişimler neden olabilir. Bakım benzer konumlarda aynı konka varyasyonu en aza indirmek için kayıt alınmalıdır. Bu başın aynı tarafında sürekli kayıt ve mikroskop, koku teslim tüp, ve doku örnekleri arasında hava tablo değişmeden üzerinde mikromanipülatörler ayak izi tutarak kolayca elde edilebilir. Buna ek olarak, aşırı doku diseksiyonu sonra kurumasını önlemek için doku örnekleri hemen nemlendirilmiş hava akışı içine yerleştirilmiş olmalıdır. Fareler üzerinde EOG kayıtları da 7, 14, 15, ya da baş zedelemeden ve konkalar 16, 17 üzerinde delinmiş küçük bir delik içine elektrod ekleme konkalar hazırlanan fare üzerindeki sıvı perfüzyon aparatı ile yürütülen olabilir . Her varyasyon EOG kayıt kendi güçleri vardır: Bu protokol açıklandığı gibi doku hazırlıkları hava fazlı kayıtları az miktarda bir kurulum gerektirmez ve yapmak kolay; bir sıvı perfüzyon cihazları kullanırken kayıtları farmakolojik reaktiflerin kullanımını kolaylaştırmak karşın birçok koku hidrofobik doğa koku teslim zordur; son olarak, kafa sağlam olduğu kayıtları &#39;yapay sniff&#39; deneylerde kullanılabilir, elektrot yerleştirme konkalar tam maruz kaldığında daha zor olmasına rağmen.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Air delivery tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute</td>
</tr>
<tr>
<td>Air table</td>
<td>equipment</td>
<td>Newport</td>
<td>LW3030B-OPT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>equipment</td>
<td>Warner</td>
<td>DP-301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and Data Acquisition Software</td>
<td>equipment</td>
<td>Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.</td>
</tr>
<tr>
<td>Butane torch</td>
<td>equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A cr&egrave;me br&ucirc;l&egrave;e torch works well</td>
</tr>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>equipment</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scope</td>
<td>equipment</td>
<td>Scienscope</td>
<td>SSZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode holder</td>
<td>equipment</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>64-1021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Holding Devices (12 mm)</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M3301R M3301L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope</td>
<td>equipment</td>
<td>Tektronix </td>
<td>5110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>equipment</td>
<td>Parker Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone tubing</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalge Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Specimen stage</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.</td>
</tr>
<tr>
<td>18 gage needles</td>
<td>material</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305195</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 oz. glass bottles</td>
<td>material</td>
<td>VWR International</td>
<td>16152-201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass capillaries</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW150F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone stoppers size 16D</td>
<td>material</td>
<td>Chemware</td>
<td>D1069809</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver wire</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>AGW1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SylGuard 184</td>
<td>material</td>
<td>Dow Corning </td>
<td>SYLG184</td>
<td>From World Precision Instruments</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amyl acetate</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>W504009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-1016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptaldehyde</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>H2120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9272</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
<td>reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>3624-05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>flowmeter</td>
<td>equipment</td>
<td>Gilmont</td>
<td>GF-2260</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording

Hayvanlar, gıda kaynakları bulma predatör kaçınarak, çiftleşme ve diğer sosyal etkileşimler conspecifics tespit gibi birçok kritik davranışları, koku bağlıdır. Electroolfactogram (EOG) kayıt koku epiteli seviyesinde tahlil koku alma işlevi, bilgilendirici yapmak için, kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Kurbağa 1 Ottoson tarafından EOG açıklamasını, 1956 yılından bu yana, EOG kayıt semender, tavşan, sıçan, fare, ve insanlar (Scott ve Scott Johnson, 2002, ref. 2) dahil olmak üzere pek çok omurgalıların tatbik edilmiştir. Farelerde genetik modifikasyon son gelişmeler knock-out koku alma fonksiyonu fizyolojik karakterizasyonu EOG kayıt ilgi başlattı ve fareler-vurmak var. , Koku alma sinyal iletimi bileşenleri 3-8 merkezi bir rol göstermek için, ve daha yakın zamanda 9-12 OSN yanıtları bazı düzenleyici mekanizmaların katkısı karakterize EOG kayıtları başarıyla uygulanmıştır . Odorant algılama kirpikler akar ve membran 13 depolarizes bir akım üreten bir sinyal iletimi kaskad iyon kanallarının açılması için neden OSNs, kirpikler olfaktör epitelin yüzey oluşur. EOG negatif potansiyel kayıt alan 2 ayrı duyarlı OSNs kaynaklanan potansiyel değişikliklerin bir toplamı sonucu, üzerine koku epiteli yüzeyinde odorant stimülasyon ekstraselüler kaydedildi. EOG genliği ve kinetik karşılaştırılması ve böylece genetik modifikasyon ve diğer deneysel manipülasyonlar koku OSN yanıt altında yatan moleküler sinyalizasyon nasıl etkilediğini hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada fare koku alma konkalar bir hazırlık bir hava faz EOG kayıt açıklar. Kısaca, fare ödün sonra, koku konkalar orta hat boyunca baş bisecting ve septum çıkarmadan maruz kalmaktadır. Konka hazırlık sonra kayıt kurulum yerleştirilir ve bir kayıt elektrot medial konkalar olfaktör epitelin yüzeyine yerleştirilir. Referans elektrot, elektriksel bir tampon çözelti ile dokusuna bağlıdır. Epitel yüzeyi nemli tutmak için sürekli bir nemlendirilmiş hava akımı üzerine üflenir. Odorant çözümleri buharı epitel uyarmak için nemlendirilmiş hava akışı içine şişirilmiş. Yanıtları kaydedilir ve daha fazla analiz için sayısallaştırılmış.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording at JoVE.com

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Electroolfactogram (EOG) kayıt koku epiteli düzeyinde koku alma fonksiyonu değerlendiren bir bilgilendirme yapmak için kolay ve güvenilir bir yoldur. Bu protokol bir kayıt kurulum, fare doku hazırlanması, veri toplama ve temel veri analizi açıklar.

Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.4K Görüntüleme.  Johns Hopkins University. Electroolfactogram (EOG) kayıt koku epiteli düzeyinde koku alma fonksiyonu değerlendiren bir bilgilendirme yapmak için kolay ve güvenilir bir yoldur. Bu protokol bir kayıt kurulum, fare doku hazırlanması, veri toplama ve temel veri analizi açıklar.

Video: Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Nörobilim

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Hücre içi Kaydı, Duyu Alan Haritalama ve Sülük de Kültüre Belirlenen Nöronlar Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Semiokimyasallar için yatak hataların Koku Nöron Cevapları Algılama Tek Sensillum Kaydı Kullanma

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Of Bilgisayar İzleme tarafından Analiz Edilmiş Olfaktor Davranışlar<em&gt; Drosophila</em&gt; Dört kadranda olfactometer içinde

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...