Bu çalışma NIH DC052256 ve DC006015 ve NSF 0.324.769 QG ve T32-DC008072 BS tarafından desteklenmektedir.

1. Hazırlık Bu prosedür, biyogüvenlik düzeyi 2, bu nedenle aşağıdaki tüm hazırlıkları, mikroenjeksiyon işlemi gerçekleştirilen bir biyolojik tehlike kaput yapılır . <ol><li> Hazırlayın ve ön ısıtma 37 ° C su yatağı: su dolu bir plastik saklama poşetine doldurun - boşaltılmış bir ısıtma blok inkübatör mühür ve set. Bu fareler aşağıdaki enjeksiyon kurtarmak için izin verecektir. </li><li> Bir biyolojik tehlikeli atık konteyneri bu yordamı tüm atık batırmak için uygun bir hacmi% 10 oranında çamaşır suyu ile doldurun. </li><li> % 70 etanol küçük bir açık biyolojik güvenlik kabini, steril ddH2O ve yer ile çanak ve ikinci bir yemek hazırlayın. </li><li> 5μL kapasiteli Hamilton şırınga, piston, tüm yol çıkardı% 70 etanol ile beden ve iğne aşağı püskürtme 33-gauge bir iğne ile sterilize edin. Tekrar tekrar çanak etanol aspirat ve en az 5 kez bu şekilde dışarı çıkarmak. </li><li> Şırınga kartuşu aspirasyon ve çıkarma en az 5 kez steril su ile durulayın. Kültür kaput, güvenli bir şekilde kenara şırınga yerleştirin ve kurutun. </li><li> ° C derin dondurucuda buz üzerinde depolama yeri ve çözülme izin -80 viral stokları çıkarın. Mikroenjeksiyon 10 9 enfeksiyöz birim / ml bir titresi fare başına düşen virüs stokunun 2μL gerektirir. Lentiviruses laboratuvar kurulan protokolü (Lois ve ark, 2002) göre, ticari kaynaklardan elde edilen veya üretilen olabilir. </li><li> Kaputun yüzey üzerinde büyüyen bir alan sağlayan bir enjeksiyon aşamasında hazırlayın - Kimwipe bir levha ile kaplı bir 10cm kültürü çanak kullanabilirsiniz. </li><li> Enjeksiyon istasyonu yakınında alkol mendil düzenleyin. </li></ol> 2. Olfaktör epitel içine lentiviral parçacıkların Mikroenjeksiyon Bu yöntemle yapılan tüm hayvan prosedürleri IACUC onaylanmış yönergelere göre yapılır. Mus musculus suşu C57BL/6J tüm deneylerde kullanılan hayvan modelinde gösterilmiştir. <ol><li> Kafesin yavru bir fare (P0-P3) ve 5 dakika buz üzerinde bir kesim açık eldiven yavru koyarak hipotermi fare yavrular Anesteziyoloji. </li><li> Yavru sterilize Hamilton şırıngaya viral stokunun tamamen anestezi, aspirat 2μL için beklerken. </li><li> Enjeksiyon sahne üstünde yavru fare yerleştirin. Boynun üst kısmına doğru kulak yavaşça başın üst deri çekin. Bu nazal kavite içinde öğretilen bir cilt yüzeyini sağlamak ve enjeksiyon kolaylığı olacak. </li><li> Olfaktör epitel ulaşmak için cilt yüzeyinin altında 3mm hakkında burun boşluğunun üst yoluyla iğne takın. Sağ ve sol iki tarafında başına iki site (fare başına düşen toplam dört enjeksiyonları gerekli virüs = 2μL) seçerek atış başına virüs çözümü 0.5μL Microinject. Enjeksiyon siteleri birbirlerinden şaşırtmalı olmalıdır. Uygun enjeksiyon siteleri hedef için, koku ampul anahat dorsal kafatası yüzeyi arama. Bu çizgi, yarı şeffaf bir cilt ve kafatası yoluyla doğumda zar zor görünür. Her iki tarafta da iki enjeksiyon yapmak için, sadece az bir ampul anahat medial eksen rostral bir enjeksiyon hedefliyoruz. Ampul anahat lateral ikinci bir ekleme yapın, henüz ventral ampul altında bulunduğu olfaktör epitel ulaşabilirsiniz enjeksiyon mediale açısını emin olun. Koku ampul nüfuz kaçının! </li><li> Leke herhangi bir kalıntı virüs çözümü ya da kuru bir Kimwipe kullanarak enjeksiyon yerinde veya burun deliğine açıklıklar kaçmak kan. Hemen seyreltilmiş sıvı çamaşır suyu biohazard konteyner Kimwipes atmayın. </li><li> Enjekte edilen fare, su yatağı inkübatör üzerine yerleştirin. </li><li> Tekrar fare başına düşen virüs stokunun yaklaşık 2μL gerekecektir hatırlayarak enjekte edilecek tüm fareler için 1-4 adımları. </li><li> Orijinal yuvalama kafes onları dönmeden önce fareler 30 dakika boyunca su yatağı inkübatör kurtarmanızı sağlar. </li><li> Sıvı çamaşır suyu biyolojik tehlike bertaraf mikroenjeksiyon sahne, sterilize mendil ve herhangi bir ekstra temizlik kağıt ürünleri atın. </li><li> Hamilton şırınga hazırlık adımları yapılan tekrarlanan aspirasyon ve etanol ejeksiyon ve sonra su ile temizleyin. Şırınga kurumasını bekleyin. </li><li> Maksimum transduction verimlilik için 4 saat içinde tekrar bu prosedürü tekrarlayın. Enfekte OSNs hücre uzunluğu boyunca üç gün gibi az olarak görüntülendi olabilir. </li></ol> 3. Kayan koku alma ampul bölümleri, İmmünohistokimya <ol><li> Istenilen zaman noktada enjekte fare Kurban ve perfüzyon% 4 paraformaldehid doku çözmek. OB parçalara ayır. Bir gecede gecelik ve sonra paraformaldehid PBS içinde% 30 sakaroz inkübe edin. Kuru buz OCT gömme orta göm. </li><li> Koronal OB bölümleri bir Kriyostat kullanarak kalınlığı 60μm elde edilir. 5ml 1x PBS (pH 7.4) ile 10cm kültürü çanak içine ampul bölümleri Sweep. Bölüm d Ekim izin PBS içinde yüzen tutulmalıdırissolve. 50ml konik bir şişenin içine yüzer bölümleri ve PBS aktarın. </li><li> Flakonun alt bölümlere yerleşmek için izin ver. PBS kapalı herhangi bir bölümü emme Vakum. 20ml PBS ile doku bölümleri durulayın. Yerleşmek ve vakumlama adımları tekrarlayın. 10 ml PBS ve immün için 15 mL konik flakon transfer kayan bölümleri ile yeniden süspanse edin doku. Bir kez doku kesitlerinde doku bozmadan, PBS süpernatant kapalı vakum yerleşmiştir. Ile yeniden süspanse bölümleri% 0.3 1x PBS, pH 7.4 deterjan hücre zarları delinecek izin (PBS-Tx) Triton X-100. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. PBS-Tx süpernatant ve tekrar inkübasyon iki kez kapalı Vakum. </li><li> Engelleme çözümünün 10 ml (PBS-Tx% 5 at serumu) doku bölümlerini iki saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Her biri 15 dakika oda sıcaklığında en az iki kez PBS-Tx engelleme çözüm durulayın. </li><li> PBS-Tx birincil antikor çözüm 2mL hazırlayın. Reaktifler ve bu deneyde kullanılan antikorlar için donatım bölümüne bakın. </li><li> Primer antikor çözümü ile ikinci PBS-Tx engelleme yıkama değiştirin. 4 ° C 24-48 saat 60μm kayan bölümleri içine derinlemesine nüfuz sağlamak için yavaş yavaş sallanan bir platform (~ 30rpm) inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra, birincil antikor çözümü 4 dikkatli bir pipet kullanarak alınan ve saklanan olabilir ° C boyanma yoğunluğu önemli bir kaybı olmadan iki hafta içinde iki kez daha yeniden. </li><li> Nazik rotasyon (~ 30rpm) ile oda sıcaklığında her 20 dakika için bölümler PBS-Tx üç kez yıkayın. </li><li> PBS-Tx ikincil antikor seyreltme 2mL hazırlayın. Son yıkama Vakum ve doku kesitlerinde sekonder antikor çözüm ekleyin. Dış fluorofor photobleaching neden olabilir ışık, blok boyama flakon alüminyum folyo ile sarın. 4 ° C gece boyunca yavaş yavaş sallanan bir platform ve inkübe yerleştirin flakon tamamladı. </li><li> Uzakta vakumlama ikincil antikor çözüm atın. Bölümleri, her oda sıcaklığında 20 dakika PBS-Tx ile bir kez yıkayın. Oda sıcaklığında, her 20 dakika için PBS (pH 7.4) ile iki kez durulayın. Fluoromount G. kullanılarak cam Slaytlarınıza Mount boyanan doku kesitleri </li><li> Olumlu bir floresan mikroskop ile enfekte OSN ve akson Termini boyanan kesitler aracılığıyla Ekran. </li><li> Etiketli OSN akson ve terminal çardak üç boyutlu bir görüntü oluşturmak için, konfokal mikroskopi kullanılarak hedef OB doku dilim (z ekseni boyunca) 60μm derinliği ile optik bölümleri bir dizi yapmak. </li><li> Z-bölüm görüntüler Bu yığın bütünüyle terminal çardak detay da dahil olmak üzere tek bir etiketli OSN akson 360 ° dönen perspektif, daha sonra yeniden bir araya yansıtılabilir. Herhangi bir tek dönme açısı yakalanır ve 2D formatında sunumu için bir resim dosyası olarak (yani, JPG, TIFF) ihraç edilebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Burada açıklanan yöntemler, in vivo lentivirüs koku alma duyu nöronları transduce. GFP ve mCherry floresan gazetecilere böylece çok görüntülenmiştir enfekte OSNs, iyi immünsitokimya üzeri myc etiketli füzyon proteini var. Bu teknik, virüslü OSNs bir bolluk sağlar. Yine de, transdüksiyon, böylece tek bir hücre morfolojisi analizi için izin sporadik tek tek etiketli OSNs sağlamak için yeterli oluşur. Ve akson terminallerindeki konfokal mikroskobu (Şekil 1) kendi doğal ortamı ortasında OB doku kesitlerinde içinde görüntülenmiş. Tüm OSN akson terminali çardak genellikle 40-50μm optik bölüm içinde büyüledi olabilir. Enfekte OSN akson terminalleri Yüksek büyütme glomerüler katman aksonal çardak morfolojisinin detaylı analiz sağlar. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Şekil 1. Tek koku alma duyu nöron, akson ve terminal çardak Yörünge A) P7 fare koku sinir tabakası (onl) gösteren bir koku ampul koronal bölümünde OMP (kırmızı) ile immunohistokimyasal ve OMP hem glomerüler katman (GL) ile boyanmış Vglut2 (gri). GFP (yeşil) ifade tek bir koku duyusal nöron akson onl içinde yolculuk yapar ve glomerüler yapı içine nüfuz eder. B) glomerul içinde akson terminali çardak morfolojisi GFP ifade tarafından açıkça vurgulanır. Vglut2 gri co-boyama, GFP pozitif bir aksonun terminal abor ayrıntılarına içinde toplam glomular alanı aydınlatır. C) lentiviral enfekte OSNs OE ifade GFP (yeşil). Olfaktör epitel cytostructure DAPI boyama (mavi) ile gösterilir. GFP ifade OE OSN hücre gövdeleri ve bunların hücresel süreçlerin görselleştirme sağlar. D) Rap1GAP2 ifadesi ile bir OSN akson ve terminal morfolojisi knock-down shRNA. Altında fare U6 organizatörü ve GFP altında Rap1GAP2 shRNA ile ikili bir ifadenin kaseti taşıyan LentivirusesCMV organizatörü OE uygulandı. Enfekte koku alma akson terminalleri GFP sadece kontrol ile kıyaslandığında daha basitleştirilmiş bir terminal çardak sergilenmektedir. Bar = 20μm.

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

Bu protokol, biyo-güvenlik düzeyi 2 uyumlu. Tüm uygun çalışma alanı, kişisel koruma, ve viral atık kısıtlama tedbirlerini buna göre kurulmuştur. Bütün hayvan prosedürleri IACUC kurallarına göre yapılmıştır.

OSN genomik DNA gen yapıları kalıcı transferi lentivirüs sonuçları Mikroenjeksiyon. Bu yaklaşım bize aşırı ekspresyonu veya shRNA aracılı knock-down &quot;ile aday genler kısa vadeli veya uzun vadeli manipülasyonlar ile yarabilirsiniz. Buna ek olarak, floresan odorant reseptör popülasyonları co-lokalizasyon gözlemlemek için mevcut bir transgenik fare doğrultusunda tek OSNs etiketleyebilirsiniz. Mikroenjeksiyon OSNs lentiviral transdüksiyon için gereklidir. Biz herhangi bir başarı olmadan OSNs u...

Mikroenjeksiyon: Yenidoğan farelere 33 iğne (Hamilton # 7762-06) ile donatılmış bir 5μL Hamilton şırınga (Hamilton # 7647-01) kullanılarak microinjected. İmmünositokimya Reaktifler: Primer antikorlar: tavşan poliklonal antikor GFP (Molecular Probes # A-6455), OMP karşı tavuk poliklonal antikor (özel) (Chen ve ark, 2005), kobay VGlut2 karşı poliklonal antikor (Millipore # AB2251). İkincil antikorları: Cy2-konjuge eşek anti-tavşan (Jackson Immunolab # 711-225-152), eşek Cy3-konjuge anti-tavuk (Jackson Immunolab # 703-165-155) ve Cy5-konjuge keçi anti-guinea pig (Jackson Immunolab # 106-175-008). Bölüm 50ng/mL DAPI kromatin leke çözümü ile Fluoromount G (Güney Biotech # 0010-01) ile cam kızaklar üzerinde monte edilmiştir. Konfokal Görüntüleme: Z-yığını görüntüler Olympus Flouview FV1000 konfokal mikroskop ve Olympus FV10-ASW 2.01 konfokal toplama ve analiz yazılımı kullanarak 3D projeksiyonları toplanır ve işlenmiş görüntüler kullanılarak alınmıştır.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

Hassas bir koku alma devre Geliştirme koku ampul (OB) sinaptik hedeflere koku alma duyu nöron (OSN) aksonlar doğru projeksiyon dayanmaktadır. OSN akson büyüme ve hedefleme moleküler mekanizmaları iyi anlaşılmış değildir. Kurgulama gen ekspresyonu ve şimdiye kadar tek OSN akson ve onların terminali çardak morfolojisi görselleştirme sonraki zorlu olmuştur. Belirli bir zaman dilimi içinde tek hücre düzeyinde gen fonksiyonu çalışma için, gen ekspresyonu in vivo OSNs işlemek için lentiviral tabanlı bir teknik geliştirdi. Lentiviral parçacıklar koku epiteli (OE) mikroenjeksiyon OSNs için teslim edilir. İfade kasetleri daha sonra kalıcı transduced OSNs genom içine entegre edilmiştir. Yeşil floresan proteini ifade enfekte OSNs tanımlayan ve akson terminali çardak de dahil olmak üzere tüm morfoloji, özetliyor. Mikroenjeksiyon ve muhabir algılama arasındaki kısa gerçekleştirme süresi nedeniyle, gen fonksiyonu çalışmaları çok dar bir süre içinde geliştirme odaklı olabilir. Bu yöntem ile, en az üç gün içinde, GFP ifade tespit ettik ve enjeksiyonu takiben üç ay kadar uzun. Biz knock-down lentiviral mikroenjeksiyon aracılı aşırı ifade ve shRNA hem de elde ettik. Bu yöntem, in vivo olarak tek hücre düzeyinde OSN hücre gövdeleri ve aksonlar detaylı morfolojileri sağlar ve böylece koku alma gelişimi sırasında aday gen fonksiyonu karakterizasyonu sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo at JoVE.com

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Biz lentiviral bir tek koku alma duyu nöron akson genetik manipülasyon ve görselleştirme tekniği ve terminal arborization mevcut<em&gt; In vivo</em&gt;.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.5K Görüntüleme.  University of California, Davis. Biz lentiviral bir tek koku alma duyu nöron akson genetik manipülasyon ve görselleştirme tekniği ve terminal arborization mevcut In vivo.

Video: Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Nörobilim

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.