1.. Elektrotlar ve Tuzlu Çözüm hazırlanması <ol><li> Hayvan kesilmiş önce fizyolojik tuzlu su ve elektrotlar hazırlayın. 115.3 mM NaCI, 1.8 mM CaCl2, 4.0 mM KCI, 10 mM Tris / maleik asit veya HEPES: Leech Ringer çözeltisi aşağıdaki gibidir. PH&#39;ı 7.4 &#39;e ayarlayın. </li><li> Telin pürüzsüz bir koyu gri renge sahip olana kadar 20 dakika boyunca çamaşır suyu küçük bir miktar temizlenmiş bir gümüş tel daldırma ya da bir Ag-Cl tel hazırlayın. Kullanmadan önce distile su ile tel yıkayın. Sonra amplifikatör takılan bir mikropipet tutucu içine tel yerleştirin. </li><li> Bir pipet çektirmenin kullanarak borosilikat cam keskin bir cam elektrot hazırlayın. Elektrot direnci 20 MQ sırasına olmalıdır. </li><li> 3 M potasyum asetat çözeltisi ile pipet dolgu ve mikropipet tutucu içine eklemek. </li><li> Dışı bir elektrot için geri ucunu kırmak, yukarıda açıklandığı gibi keskin bir cam pipet hazırlamakkeskin kenarında keskin bir pipet ovuşturarak. Sonra connectives gözyaşı kalmaması ucu lehçe yangın. Plastik hücre dışı elektrodlar da sürece, elektrot ve sinir arasında iyi bir temas yoktur olarak çalışacaktır. </li><li> Emiş için bir kauçuk tüp ve şırınga ile donatılmıştır (Ag-Cl tel ile) bir mikropipet tutucu içine ekstraselüler kayıt elektrodu takın. En az gümüş tel seviyesine elektrotun içine tuzlu su çekmek için şırınga kullanın. </li><li> Özel sinyal kayıt ünitesi için kılavuzunu takip ederek donanım (amplifikatör ve uyaran izolatör) ve yazılımı kayıt parametrelerini ayarlamak. Aşağıda tarif edilen deneylerde kullanılan ekipman ile ilgili bilgileri görüntülemek için Leksrisawat et al. 22, bkz. </li></ol> 2. Ventral Ganglion Diseksiyon <ol><li> Sülük Ringer solüsyonu ile büyük bir silikon elastomer kaplı tabak sülük ayır. Hayvan, uzunlamasına uzatılmış olur ise,ventral sinir kablosu (bkz. Şekil 1A) kaldırmak için daha kolay olacak. </li><li> # 10 veya # 11 boyutu neşter ile, ventral orta hat çok sığ kesintileri ile uzunlamasına bir kesi yapmak. Ventral orta kesim 2/3rd hakkında Şekil 1B &#39;de gösterilmiştir. Kırıksız hayvan tamamen açılır ve kan sinüs gerilir kadar siyah çorap (ventral kan sinüs) kesmemeye çalışın. Bu kan sinüs ventral orta hat boyunca hayvanın uzunluğu çalışır. VNC bu damar içinde ihtiva edilmektedir. </li><li> Cilt nick kan sinüs (Şekil 2) ince iris makas kullanımı hayvanın tam uzunlukta kesilmiştir sonra. Sinüsün altında ince iris makas biri bıçak Kayma ve biraz sinir dokusu ayırmak için bıçak yükseltmek. Sinir kökleri, segmental sinirler, ya ganglionlar arasında connectives kaçınarak sinüs VNC uzunlukta kesin. </li><li> Sonraki tarafından ventral sinir kablosu parçası kaldırmakkan damarı kökleri birleştiği yere uzak kesme kökleri. Ventral sinir kablosunun uzunluğu boyunca her bir gangliyon için bu işlemi tekrar edin. </li><li> Daha küçük bir Petri kabı, bir ya da iki gangliyon bir segment aktarın. Ganglion veya tek ganglion bazı bolluğu ile gergin tutturulmuş gerekmektedir. </li><li> Ganglion glial kılıf biraz glial kılıftan ve ilgi nöron içine impaling zaman etrafında hareket nöron hücre gövdeleri önlemek için gergin böylece connectives ve kökleri pin. Pimler kökleri için siyah sinüs içinden ve aksonların hasarı (Şekil 3) en aza indirmek için iki bağlaçlar ortasına yerleştirilmelidir. </li><li> Mikroskop altında hazırlanması ile Petri yerleştirin ve hareket etmesini önlemek için çanak alt balmumu ile sabitleyin. </li><li> Dikkatlice Şekil 4A&#39;da olarak nöronlar görmek için bir ayna ve ışık kondansatör kullanılarak ışık ışınının odak (şematik olarak Şekil 4B&#39;de gösterilen </stRong&gt;). Ganglion merkezinde iki büyük Retzius hücreleri edin. </li><li> Rz, T, P, N ve nöronların hücre içi kayıt yapmak için dikkatli bir şekilde ilgi konusu hücrenin üzerine elektrodun ucu ile hafifçe bir çukur glial kılıf görülür kadar alt ucu. </li><li> Elektrot tutucu veya manipülatör (çok dikkatli) ve böylece dokunun ilgi hücreye elektrot ucu &quot;çıkar&quot;. </li><li> Aksiyon potansiyelleri uyandırmak için hücreye pozitif akım (1-10 nA) kısa darbeleri (30-40 msn) enjekte edilir. </li></ol> 3. Ventral Ganglion Hazırlık Kültürleme Nöronlar <ol><li> Fetal sığır serumu (FCS) (Şekil 3) ile L-15 ihtiva eden temiz bir tabak içinde ganglia ventral tarafı yukarı Pin. Hücre içi kayıtları için yukarıda yapıldığı gibi ganglionlar biraz gerilir böylece kökleri pin. Ince makas ile, nick bir ucunda glial kapsül, sonra glial kapsül kesen, kapsül altında bir makas bıçak kaymaŞekil 5A&#39;da gösterildiği gibi. </li><li> 15 dakika süre ile bir çalkalama çanağı ve yere kollajenaz / dispaz 100 ul bir kısım ekleyin. Maruz kalan hücre gövdeleri etrafında kültür ortamı hareket hücreleri inceleyin. Hücreler az emilerek dışarı gelene kadar başka bir 15 dakika veya daha uzun süre çalkalayıcıya hücreleri dönün. </li><li> Yavaşça ganglion hücreleri çıkarmak için bir şınngaya bağlanmış bir pipet kullanın. Bu hücre gövdesi çapından biraz daha büyüktür, böylece yangın pipet cila. Yetişkin bir sülük R &#39;nin hücreleri için, çapı yaklaşık 50 um olmalıdır. </li><li> Bu pipet içindeki yapışma, hücrelerin şansını azaltır olarak bir iplik olmaksızın farklı çaplarda pipetler çeşitli hazırlayın. Yonga arasındaki ipuçları korumak için alt kısmında bir pamuk ile% 80 etanol (EtOH) ihtiva eden bir şişe içinde pipetler saklayın. Hücreleri aspire önce orta ile pipet dışarı EtOH&#39;nin yıkamayı unutmayın. </li><li> Enzim muamelesinden sonra, yıkayınenzim-ihtiva eden 2x (FCS), L-15, orta. Ilgi hücreleri belirlemek ve yavaşça şırınga (Şekil 6A) çekerek pipet içine çekmek. (FCS) ile L-15 içeren başka bir yemeğin içine aspire hücreleri boşaltın. </li><li> Şimdiye kadar, tüm işlemler steril olmayan edildi. Steril bir kaput aşağıdaki adımları uygulayın. Steril bir Petri kabı içinde, farklı yerlerde (FCS) ile steril L-15 3-4 büyük damla yerleştirin. </li><li> Yıkayın damla etrafında üfleme, daha önce adı geçen damla birine hücreleri Pipet. Orta 3 ya da 4 damla seri olarak bu işlemi tekrar edin. </li><li> (FCS), L-15 ile doldurulmuş bir temiz Petri kabındaki hücrelere yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 1-24 saat boyunca inkübe hücreleri. Daha sonra temiz hücreler kaplı olabilir. Birkaç saat veya hücreleri bırakarak bir gece boyunca hücre dışı matris kolayca kapalı gelir. Uzun süreçleri oluşturmak için hemen hücreleri Plate. </li><li> Bir mikro Di kaplamak için steril substrat kullanarak<html> sh ve deneyler kültürleme önce (gece) tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> Çanak kaplanmış sonra, L-15 ortamı içinde bir miktar daha sonra steril su ile hafifçe çanak yıkayın. FCS olmadan L-15 çözümü kullanmak unutmayın hücreleri çanak uymak için izin eklendi. Hücreler, alt-tabakaya yapıştırılır sonra ortam yavaşça FCS, L-15 için değiştirilebilir. Hücreler, birkaç saat FCS, L-15 için orta geçiş sonra, kaplama sonrası kullanılacak ise gerekli değildir. </li><li> Hızlı sinaptogenez (Şekil 6B) ikna etmek için kaplama sırasında birbirine hücreleri yerleştirin. Nöronların eşleşmelerde 24 saat ölçü fizyolojik aktivite sonrası. </li><li> (2. hücre içi elektrot kullanarak eşleştirilmiş hücresinden hücre içi bir elektrot ve kayıt yanıtları ile 1 nöron teşvik) hücrelerinin kültüre çiftleri RP veya sinaptik yanıtları kaydetmek içi elektrofizyolojik tekniklerini kullanın. </li></ol>title &quot;&gt; 4. ganglion-vücut Duvar HAZIRLIĞI <ol><li> Yukarıda tarif edildiği gibi bir elastomer kaplı tabak içinde aşağı sülük dorsal tarafına Pin. </li><li> Kesik ganglion diğer tarafında kökleri ile bir tarafa deri (Şekil 7B&#39;de büyütülmüş Şekil 7A) pim veya vücuda tüm kökleri ile bir ganglion (Şekil 7C) üzerinden sülük ventral bir pencere yapmak sağlam duvar. </li><li> Duyusal hücrelerin (T, P, N) ateş hafifçe aynı segmentte cilde dokunmak cilalı olmuştur küçük bir cam çubuk kullanmak birinde istikrarlı bir hücre içi kayıt alındıktan sonra. Kaydedilmiş olan bir N nöron hücre ise, daha fazla baskı cilde tatbik edilmesi gerekir. Cilt cımbız ile bloke olursa Çoğu durumda, N hücre tek yanıt verir. Bir cilde zarar verebilir veya böyle bir şekilde hazırlanmasını bozarak hücre içi recoding deplase olabilir Bu nedenle bu hücreler, son olarak denenmelidir. </li><li> Bir olmalıdırhızlı yeterli ayrıntıları ile cilt ve ganglion kroki mümkün dokundu biri belirli bir nöron için alıcı alanını belirlemek için kullanılan nerede bir harita. Bir ganglionun her iki yüzüne mümkün olduğu kadar çok T ve P hücrelerinden kayıt sonra N hücreleri deneyin. </li><li> Duyusal nöronlar, rostral ve kaudal bir şekilde ve daha sonra deriye bitişik segmentinde köklerinden dışarı bağlaçlar ile seyahat süreçleri varsa incelemek amacıyla, getirmedi ganglia arasındaki bağlaçları kesilebilir ve açık alanların bir kez daha ele algılama yayıldı. Açık alanda herhangi bir kaybı olmamıştır Temelde tek inceliyor. </li></ol> 5. Floresan Boyalar enjekte <ol><li> Yukarıda tarif edildiği gibi bir sülük ganglion hazırlayın. </li><li> Lucifer sarı-CH (% 3.0) ve lityum klorür (300 mM) bir solüsyonu ile bir mikroelektrot doldurun. </li><li> Tarif edildiği gibi ganglion ventral tarafındaki duyusal hücreler ya da Rz hücrelerden birini Impaleyukarıda. </li><li> 15 dakika boyunca elektrot yoluyla negatif akım (3NA) geçirilerek hücre içine boya enjekte edilir. 100 msn darbe süresini ve 2 Hz frekansı ayarlayın. </li><li> Bir cıva lambası ve bir FITC / GFP filtre seti ile heyecan verici boya ile boya dolu nöronlar görselleştirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+and+selective+connexions+of+identified+leech+neurones+in+culture.">Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture.</a> J Physiol. 316, 203-223 (1981).</li><li>Ready, D. F., Nicholls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+neurones+isolated+from+leech+CNS+make+selective+connections+in+culture.">Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture.</a> Nature. 281, 67-69 (1979).</li><li>Blackshaw, S. E., Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurobiology of the Leech. , 51-78 (1981).</li><li>Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+and+selection+of+the+responses+to+serotonin+during+reinnervation+of+an+identified+leech+neuron.">Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron.</a> J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).</li><li>Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Na++and+K++currents+in+soma,+axons,+and+growth+cones+of+leech+Retzius+neurones+in+culture.">Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture.</a> J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).</li><li>Cooper, R. L., Miguel Fernandez, d. e., Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+inhibits+expression+of+calcium+currents+in+purely+postsynaptic+cells.">Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).</li><li>Liu, Y., Nicholls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steps+in+the+development+of+chemical+and+electrical+synapses+by+pairs+of+identified+leech+neurons+in+culture.">Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).</li><li>Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+and+calcium+current+distribution+in+cultured+leech+neurons.">Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+pattern-generating+circuits.">Multifunctional pattern-generating circuits.</a> Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).</li><li>Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+axons+and+synaptic+connections+by+touch+sensory+neurons+in+the+leech+central+nercoys+system.">Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system.</a> J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).</li><li>Becker, T., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+control+of+a+critical+period+for+peripheral+induction+of+central+neurons+in+the+leech.">CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech.</a> Development. 116, 427-434 (1992).</li><li>Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Synapses+to+behavior:+Development+of+a+sensory-motor+circuit+in+the+leech.">From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech.</a> Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).</li><li>Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurobiology+of+Swimming+in+the+leech.">The Neurobiology of Swimming in the leech.</a> Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).</li><li>Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+stimulation+to+undulation:+a+neuronal+pathway+for+the+control+of+swimming+in+the+leech.">From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech.</a> Science. 234, 1002-1004 (1986).</li><li>Arbas, E. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+oscillations+of+membrane+potential+in+interneurons+that+control+heartbeat+in+the+medicinal+leech.">Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech.</a> J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).</li><li>Ching, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synaptogenesis between identified neurons. , (1995).</li><li>Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+neuronal+circuits+and+behaviors+in+the+medicinal+leech.">Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech.</a> Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).</li><li>French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+expression+is+required+for+normal+chemical+synapse+formation.">Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation.</a> J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).</li><li>Li, Q., Burrell, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+long-term+depression+in+a+polysynaptic+pathway+in+the+leech+CNS:+one+NMDA+receptor-dependent+and+the+other+cannabinoid-dependent.">Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).</li><li>Nicholls, J. G., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+modalities+and+receptive+fields+of+sensory+neurons+in+CNS+of+the+leech.">Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech.</a> J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).</li><li>Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+fields,+geometry+and+conduction+block+of+sensory+neurones+in+the+central+nervous+system+of+the+leech.">Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech.</a> J. Physiol. 263, 513-538 (1976).</li><li>Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+receptor+organs+in+the+crayfish+abdomen:+a+student+laboratory+exercise+in+proprioception.">Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception.</a> J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).</li><li>Crisp, K. M., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+central+pattern+generator:+amine+modulation+of+decision-making+neural+pathways+descending+from+the+brain+of+the+medicinal+leech.">Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech.</a> J. Exp. Biol. 209, (2006).</li><li>Puhl, J. G., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+activates+the+motor+pattern+for+crawling+in+the+medicinal+leech.">Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech.</a> J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).</li><li>Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+dopamine+induction+of+crawl-like+bursting+in+leech+motoneurons.">Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons.</a> J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).</li><li>Macagno, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+medicinal+leech+transcriptome+database+and+its+application+to+the+identification+of+leech+homologs+of+neural+and+innate+immune+genes.">Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes.</a> BMC Genomics. 11, 407 (2010).</li><li>Kandarian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medicinal+leech+genome+encodes+21+innexin+genes:+different+combinations+are+expressed+by+identified+central+neurons.">The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons.</a> Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).</li><li>Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+RNAi+and+ectopic+gene+expression+in+the+medicinal+leech.">Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech.</a> J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).</li><li>Firme, C. P., Natan, R. G., Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+select+innexins+in+individual+central+neurons+couples+them+to+pre-existing+neuronal+or+glial+networks+that+express+the+same+innexin.">Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin.</a> J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).</li><li>Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+molecular+data+demonstrate+that+commercially+available+medicinal+leeches+are+not+Hirudo+medicinalis.">Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis.</a> Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu deney setinin amacı 1) öğretmek ve sergi hücre içi kayıtları temel ilkelerini tanımlanabilir nöronlardan gelen ve 2) yetişkin sülükler kullanılarak bu özel nöronal türlerinden kaynaklanan elektrik sinyallerine karakteristik şekilleri tanımak oldu. Orada nörofizyolojik araştırmalar için sülük kullanan araştırmaların zengin bir tarih ve araştırma sinir devresi ve gelişimi sırasında hem de sinaptik onarım ve rejenerasyon 10 sırasında gen regülasyonu sorularını ele devam etmektedir. Nöromodülasyon, özellikle biyojenik amin yollar aracılığıyla, aynı zamanda sülük başarılı bir araştırma yönünde olmuştur. Tuzlu su çözeltisi ile sinir sistemine dopamin ve diğer farmakolojik ajanlar ekleyerek, dopamin karar verme davranışı 24,25 tarama için 23 ve motor modelleri dahil sinir ağları modüle gösterilmiştir. Bu deneysel yaklaşım, bir ahmak olduğunule (ve ucuz) öğretim laboratuvara modülasyonu dahil yolu, ve tuzlu su çözeltisinin iyonik makyaj ayarlayarak Nernst ve Goldman-Hodgkin-Katz denklemleri öğretmek için etkili bir yoldur. Ganglion hazırlıkları ile başarılı olmak için, önce ganglion hücre içi bir elektrot ile bir soma kurcalamak için çalışırken gergin olması önemlidir. Glial paket aşağı iterek aksi takdirde soma hareket edecektir. Kültür nöronlar kaldırmak için ganglion desheathing zaman kaldırılır gibi somas zarar değil bu yüzden ganglion kesen Buna ek olarak, ilgi bölge önlemek. Ayrıca, enzimlerin aşırı inkübasyon nöronlar kaldırılması için çok kırılgan olması ile sonuçlanabilir. Bu enzimlerin her parti kendi eylemlerinin biraz farklı olduğu için ideal bir inkübasyon süresi elde etmek için bazı deneme ve yanılma gerektirir. Kültür ortamını optimize etmek için daha fazla araştırma bu tekniği geliştirmek olabilir. Variinsülin, şeker, ve büyüme faktörlerinin varlığı gibi faktörleri lı, kültürlerin uzun bakım için incelenebilir. Hücreleri, Rz hücrelerinde serotonin sentezi gibi vericileri, sentezleme kapasitelerini muhafaza olmadığını belirlemek için, nötr kırmızı boyama işlemleri serotonerjik etiketlemek için uygulanabilir. Yaralı ve yenileyici dokuya da mikrogliyal işgali bir yaralanma sonrası nükleer lekeleri gün ile tayin edilebilir. Bu hazırlık rejenerasyon ve onarım hem de sinir devresi incelerken sunmak için çok faydası vardır, ancak, sinapslarda, çeşitli reseptör alt-tiplerinin farmakolojik ve molekül kimlik tam olarak karakterize edilmemiştir. Bir sentezlenmiş dizi etiket kitaplığı 26 mevcuttur, ve tıbbi sülük genomdur 27 monte edilmektedir, ancak örnek preparatları ile karşılaştırıldığında sülük ana sınırlama spesifik hücre tiplerinde seçici gen için genomunu değişime uğratmaya yarayan yeteneğidir. Embriyolar TOnun sınırlama gen ifadesini 28 düzenleyen DNA veya dsRNA&#39;yı enjekte tarafından ele alınmıştır. Gen tabancası tekniği son zamanlarda sülük nöronlarda omurgasız konneksin (innexin) proteinleri ifade etmek için kullanılmıştır. Hirudo verbana (Hve-inx6) bir innexin sentezlenmesi tıbbi sülük 29 ektopik boşluk bağlantıları oluşumu için yeterlidir. Tıbbi sülük veya H. 30 olduğu gibi verbena önümüzdeki birkaç yıl içinde fizyoloji ve elektriksel sinapsların evrim anlayışımızı ilerletmek için emin olabilirsiniz.

Sülük hazırlanması tanımlanabilir (duyusal, motor ve hayvanın merkezi sinir sistemi (CNS) içinde arası nöronların fonksiyonu araştırmak için yararlıdır. Sülük nöronların yararlı özelliği eylem potansiyelleri ve biyofiziksel özellikleri şekli için karakteristik olmasıdır belirli bir hücre tipi (örneğin, P, N, T, Rz). Ayrıca nöron hücreler, 45 gün kadar uzun 1,2 olarak onların elektriksel özelliklerini muhafaza ettiği bir uygun ortam içinde kültürlenen hayvan ve kaldırılabilir. Elektrofizyolojik kayıtları yapmak için öğrenmek için sülük ganglion belirgin bir avantajı hücreleri karakteristik ve güvenilir sağlayan bir desen ganglion düzenlenmiş olmasıdır ganglion ganglion ve hayvandan hayvana farklı hücre tiplerinin belirlenmesi. Eşsiz konumu ve sülük gangliada nöronların morfolojisi gibi erken 1891 3 olarak retzius tarafından kaydedildi. Th Bilgie kimlik bir nöronun fonksiyonu sinir devreleri araştırmak için ve belirli bir hücre tipi ile deneyler yapmak için avantajlıdır. Nedeniyle, bir mikroskopla görülebilir ve somata seçici elektriksel özelliklerini kayıt için mikro elektrod ile kazığa edilebilir bir ganglion içinde nöronların nispeten büyük somata için. Boyalar ve büyük moleküllerin tek tek hücreler ve yama kelepçe tarafından incelenmiştir kanal özellikleri içine enjekte edilebilir. Çeşitli nöronlarda karakteristik aksiyon potansiyellerinin çeşitli şekillerde doğuran İyonik akımları 4-7 tespit edilmiştir. Inervasyonunun desen ve CNS içindeki bireysel nöronların dallanma araştırmalardan, sinaptik bağlantıları tespit nöronlar 2,8 ile kültür çoğaltılamaz edilmiştir. Sülük gangliyonlarında Çalışmalar whol yanı sıra elektrofizyoloji ile ölçülebilir fonksiyonel devrelerinin gelişimi içgörü sağladıE hayvan davranış çalışmaları. Sülük MSS ayrıca tüm hayvan ve kültür 4-6,9-12 nöronal tamir ve rejenerasyon ile ilgili mekanizmaların araştırılması için değerli bir hazırlık olarak hizmet vermiştir. Memeli beyinlerinde bu özellikleri ve bireysel tespit nöronların bağlantıları açısından davranışlarını açıklamak için zor bir iştir. Prensip olarak böyle bir sülük gibi daha az karmaşık sistemlerin çalışma yüksek hayvanlarda kullanılan temel mekanizmaları tanımlamak için yardımcı olabilir umut olabilir. Yüzmek desen 13,14 ve kalp ritmini 15 altında yatan kullanılan bağlantıları de sülük karakterize edilmiştir. Hem elektriksel ve kimyasal iletişimi oluşturmak için bazı sülük nöronların yeteneği merak uyandırıcı. Diğer kimyasal olarak tek yönlü, çift yönlü, ancak elektriksel 7 ise bazı bağlantıları iki yönlüdür. Hayvan içinde sinaptik bağlantıları anlama yanı sıra aynı tipik değer yenidenbir kültür çanak bağlantıları e sinaptogenez 16-18 gibi sinaps 19 farmakolojik profil araştırmak için güçlü araçlardır. Burada anlatılan hücre içi kayıt ve stimülasyon teknikleri neuroethology ve geliştirme farmakolojik deneyler ve araştırmalar için bir temel sağlar. Buna ek olarak, segmental ventral sinir kablosu innerve deri bir yama ile disseke edilebilir. Canlı bir deri yaması ve nöronları korumak için yeteneği ile, duyu açık alanları CNS&#39;de ilgili karın ganglion içinde duyu nöronlarının hücre gövdesi (yani soma) elektrik sinyalleri kayıt ile problanabilir. Böylece tek bir ciltte yürürlüğe değişen derecelerde uygulayarak duyusal uçlarının duyarlılığını değerlendirmek ve açık alanları eşleyebilirler: hafif dokunma, basınç, ve zararlı (ağrılı) 20,21 uyaranlara. Bu sülük ganglion-cilt hazırlama bir avantajı, bir can anatomik açık alan harita çizmek ve elektriksel tepkiler kaydedilmiş ediliyor kez tanımlanan nöron nöronal süreçleri iz. Aşağıda açıklanan üç sülük deneyler, her akademik laboratuvarlar için bu maliyetli bir öğretim modülü kılan tek bir numune ile birden çok kez tamamlanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="256">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td style="width:64px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:64px;">&#160;182 silicone kit</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C5670&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris/maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bleach&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>To chloride silver wire</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;221465&#160;</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">CULTURING MATERIALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Boehringer Mannheim&#160;</td>
			<td>&#160;269-638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leibovitz L-15 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>041-01415H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Ready Systems Ag&#160;</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">04-001</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:102px;">D-Glucose-Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gentamycin sulfate&#160;</td>
			<td>any&#160; supplier</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>043-0503H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3375</td>
			<td>Free acid, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Concanavalin A Type IV</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C 2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P 7890</td>
			<td>MW 15-30,000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;Microwell plate, 60 x 10 &#956;l</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3034</td>
			<td>Flat bottom, 10 in a bag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Intracellular electrode probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>&#160;26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting microscope (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fiber optic lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Small adjustable mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To direct light beam toward the preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, Suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;MD4-M3-R</td>
			<td>&#160;Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Raised preparation stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>&#160;782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>&#160;27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass tools&#160;</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pipettes with bulbs&#160;</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Plastic tip for suction electrode</td>
			<td rowspan="2">local hardware store (Watt&#8217;s brand)</td>
			<td rowspan="2">&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis

Tatlı su sülük, Hirudo medicinalis, nörofizyoloji, neuroethology ve gelişimsel biyoloji alanlarında bilimsel soruları için kullanılan çok yönlü bir model organizmadır. Bu raporun amacı, diğer sinir sistemi hazırlıkları uzmanlığı ile fizyolog için kullanım olacak, ya da çok az veya hiç elektrofizyoloji deneyimi ile biyoloji öğrencilerine bir tek madde haline sülük sistemden deneysel teknikleri konsolide etmektir. Biz ganglion tanımlanan sinirsel devreler gelen hücre kayıt için sülük incelemek nasıl gösterilmektedir. Daha sonra fonksiyonu bilinen tek tek hücreler bir Petri kabındaki kültür edilmesi ganglion ve nasıl kültürde bu nöronlardan kaydetmek için kaldırılabilir şeklini göstermektedir. Sonra duyusal veya motor alanlarını haritalama için kullanılacak innerve deri bir yama nasıl hazırlanacağını gösteriyor. Bu sülük hazırlıklar hala yaygın nöral networ temel elektriksel özelliklerini adreslemek için kullanılırks, davranış, sinaptogenez ve geliştirme. Onlar da nörobilim veya fizyoloji öğretim laboratuvarları için uygun bir eğitim modülü vardır.

Sülük ganglionunda sensor nöronlarının hücre içi ikinci kayıtları Şekil 4C&#39;de gösterilen kendi ayrı gerilim-zaman-izleri ile karakterize edilir. Sağlıklı sülük ganglion hücrelerinde dinlenme hücre membran potansiyelinin -45 -60 mV olur. Potansiyelleri daha küçük (daha az negatif) ise bir cam elektrot değiştirmek gerekir, ya da potansiyel hala düşük ise, sinir kablosu başka bir segmente geçmek. Küçük genlikli spontan aksiyon potansiyelleri elektrot bir motor nöron olduğunu gösteriyor olabilir. Bu, ganglion-gövde duvarında olduğu takdirde bir akım enjeksiyon nöron hala deri bağlı kasların her innerve olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Anulusu kurucu motor nöron (AE) ganglion (Şekil 4B) ventral tarafında ve halka kurucu kas aktive ederek yükselmeye halkalarının (sırtlar veya segment) neden olacaktır. Duyusal hücrelerin içine akım enjekte aksiyon potansiyeli uyandırmak gerekirŞekil 4C&#39;de gösterilen karakteristik dalga şekilleri ile s. Dalga farklı bakarsanız bir dengesiz köprü veya ofset kapasitans tazminat nedeniyle olabilir. Bir hücrenin içindeki köprü dengelemek için nasıl ilgili ayrıntılar için sinyal toplama ünitesi eşlik kılavuzuna danışmalısınız. Şekil 4C&#39;de akım darbelerinin başında ve sonunda uyarıcı eserler dikkat edin. Bu köprü dengeli olduğunda eserler bakmak nasıl. Sülük ganglion nöronlarının birincil kültürleri çanak elektriksel ve kimyasal sinaps oluşturur. Başlangıçta kültürlenmiş hücrelerinin elektriksel özellikleri de in vivo olarak aynı değildir. Bununla birlikte, birkaç gün sonra darbeleri ganglion kaydedilen olanlardan hemen hemen ayırt edilemez. Bu Rz hücre bir çift Şekil 6C&#39;de gösterilmiştir. Kültür içinde 7 saat sonra sinaptik potansiyellerin genliği 1-2 mV olmuştur. Kültür sy 56 saat sonranaptic potansiyelleri 10 mV (Şekil 6C üst izleri) daha büyük. Aksiyon potansiyelinin şekli de kültürde 56hr sonra değişir. Tarif edilen koşullar altında, bu hücreler, birkaç gün boyunca geçerli değildir. Hücreler arası iletişim, sinir kökleri veya bağlayıcıları uyarıcı ve ganglion neurons kayıt ile gösterilebilir. Bu sinirleri uyarıcı farklı ganglion hücrelerinin sağlam sinaptik potansiyelleri ve aksiyon potansiyelleri oluşturur. Şekil 8B&#39;de izleri hayvan çıkarılır ve bir çanak içinde tutturulmuş olan bir ganglion bir Retzius hücreden kaydedildi. Siyah iz bağ için hücre dışı bir elektrot ile uygulanan bir eşik altı uyaran tarafından uyarılmış oldu. Uyaran gerilimi artan bir aksiyon potansiyeli (kırmızı iz) yangın hücreyi neden oldu. Boyalar ya da yaban turpu peroksidazı Floresan kendi morfolojisi incelemek için, bu hücre içine enjekte edilebilir. Lucifer sarı bir Rz enjekte edildielektrot boyunca negatif akımı geçirilerek nöron. Alternatif bir. Şekil 9A, enjeksiyon başladıktan kısa bir süre sonra boyayı göstermektedir hava basıncı Puffs kullanılarak boya enjekte etmektir. Otuz dakika sonra, boya zaten sinir kökleri (Şekil 9B) içerisine nüfuz eden. Boya türü uygulamaya bağlıdır boşluk bağlantıları üzerinden geçebilir, örneğin küçük molekül ağırlıklı boyalar elektrik sinaps tanımlamak için kullanılır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> Şekil 1. . Ventral sülük diseksiyonu (A) Hayvan iyice sülük tuzlu su ile dolu bir elastomer astarlı çanak ventral yüzü yukarı tutturulmuş (B) anterior kapsayan sığ bir kesi:. Posterior eksen orta hatta sadece yanal yapılır sinir zarar görmemesi için kord. Siyah kan sinüs (konteynerins ventral sinir kablosu) kolaylıkla görülebilir. Kılıfa göre beyaz bir açıktaki ganglion unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> Şekil 2. Siyah sinüs diseksiyonu. Kan damarı (ok) dikkatle ventral sinir kablosu (çift ok) maruz bir tarafta kesilmelidir. Diseksiyon ve kayıt yemekler arasında aktarma sırasında ventral sinir kablosu işlemek için bir kolu olarak kullanılmak üzere segmental kökleri etrafında sağlam kan damarının kesimleri bırakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3,"fo: İçerik-width = src = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; genişliği &quot;3in&quot; = &quot;400px&quot; /&gt; Ventral sinir kablosu Şekil 3.. İzole bölüm. Segmental kökleri üzerinde kalan kan kap parçaları ile ve segmental eklemlerin uçlarında ventral sinir kablosu bağlantılarını elektrofizyolojik kayıtlar için ganglionlar ortaya koyar. Gangliyon germe bir gergin bir tanımlanabilir hücre organları görmek için izin verir ve keskin bir cam elektrot ile glial kılıf daha kolay nüfuz sağlayacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> Şekil 4. Sülük ganglion hücre anatomisi. (A) İdeal Retzius hücreleri (R) ve diğer büyük hücre gövdeleri (P-presmikroskop ve ışık kondansatör düzgün ayarlanmış ise ure, T-touch, N-nosiseptif, AE-halka erector) açıkça görülebilir olacaktır. (B) ganglion hücrelerinin şematik görünümü. Mis yere hafif farklılıkları nedeniyle ganglion gergin ve gergin sabitleninceye kadar her ganglion ortaya çıkar. Bu nöronların soma kaydedilen (C) Aksiyon potansiyeli karakteristik dalga şekilleri vardır. Bu ani hücre (gerilim-zaman izlerini bindirilirken kare darbe) içine pozitif akım enjekte tarafından uyarılmış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> Şekil 5. Bireysel hücre organları kaldırmak için ganglion Desheathing. (A) glial kılıfdikkatli bir şekilde ilgi zarar hücreleri önlemek için ganglion arasında kesilmelidir. Kırmızı çizgi Rz nöronların soma çarpmamak için bir kesimini göstermektedir. Kılıf Açılış sindirim enzimleri bağ doku matriksinin erişmenizi sağlar. (B) glial kılıf açıldıktan sonra ganglion dışarı şişkin Sağlıklı hücre gövdeleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> Şekil 6,. Sülük gangliyon nöronları kültürlenmesi. (A) Hücreleri bir mikropipet kullanılarak gangliyondan aspire edildi ve kültür ortamı ihtiva eden bir çanak aktarılır. (B) birbirine yakın çok sayıda hücre yerleştirilmesi tanımlanabilir nöronlar arasındaki sinaptogenez oranını artıracaktır. İşte stuİki nöron mps bir sinaps oluşmuştur. (C) Nöronlar kültür sergi biraz farklı elektriksel özellikler de. Üst izleri Hücreler kaplandıktan sonraki bitişik hücre 7 saat ve 56 saat uyararak uyarılmış sinaptik potansiyelleri göstermektedir. Alt izleri doğrudan Rz hücrelerden birine akımını enjekte tarafından uyarılmış. Sinaptik potansiyel genliği artış dikkat ve kültür 56 saat sonra aksiyon potansiyeli dalga değiştirmek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> Şekil 7. Eşleme açık alanlar için sülük ganglion-vücut duvarı hazırlanması. (A) bir yaklaşım, 1-3 gangliyon ile birlikte gövde duvarının bütün bir bölümü ortadan kaldırmaktır. Burada, bir tarafta kökleri b vareen kesim ve ganglion tarafına dışarı tutturulmuş edilmiştir. (B) daha yüksek büyütmede ganglion dışarı tutturulmuş. (C) bir başka yaklaşım, açık alan eşleme ise sağlam gangliyonlarından vücut duvarı ve kayıt küçük bir pencere oluşturmak için . (DG), duyusal nöronların her bir mekanik uyarıcıya tepki karakteristik sergiler. (D) bir hafif dokunma, ancak P veya N hücrelerde T hücrelerinde faaliyet uyandırır. (E) T hücresi tepkisi daha güçlü bir tepki olarak kapanır uyaranlar, P hücresinin aktivasyonu yol veriyor. Uyaran güçlü N hücreleri alır gibi (FG) aktive olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 8," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figüre 8. sülük ganglion aktivitesi Uyarılmış. bağlaçlar hücre dışı uyarım sinir kablosu sinaptik iletim sürmek için kullanılabilir. (A) Bu bağlaçlar birine bir emme elektrodu bağlamak ve küçük bir gerilim uygulanarak yapılır. Keskin cam elektrot (ok) ganglion bir Retzius hücreyi impaling görülebilir. (B) bir sinaptik potansiyel (siyah), ardından uyaran objeyi ve aksiyon potansiyeli (kırmızı) gösteren Gerilim-time izleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">büyük görmek için buraya tıklayın görüntü</a> . <img alt="Şekil 9," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> Şekil 9,. Sülük nöronların içine enjekte boya. (A) Lucifer sarı bir uçtan bir uca geçen akım ile soma enjekte edilebilirkayıt mikroelektrot öf. Bir cıvalı lamba ve FITC filtre set daha sonra floresan görselleştirmek için kullanılabilir. (B) Boya Rz&#39;ye içine dağılmış olan enjeksiyondan sonra yaklaşık 30 dk aksonlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis at JoVE.com

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Bu makale sülükler kullanılarak üç sinir sistemi hazırlıkları anlatmaktadır: Hücre içi kayıt ventral gangliada nöronların, ventral ganglionlar nöronları kültüre ve duyusal alanları haritaya innerve deri bir yama kayıt.

Hücre içi Kaydı, Duyu Alan Haritalama ve Sülük de Kültüre Belirlenen Nöronlar Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

intracellular-recording-sensory-field-mapping-culturing-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

19.5K Görüntüleme.  University of Kentucky.  Bu makale sülükler kullanılarak üç sinir sistemi hazırlıkları anlatmaktadır: Hücre içi kayıt ventral gangliada nöronların, ventral ganglionlar nöronları kültüre ve duyusal alanları haritaya innerve deri bir yama kayıt. 

Video: Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Nörobilim

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Transgenik Balık Sağlam Beyin Tespit Edilen nöronlar Elektrik Aktivitesi Kayıt

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

A Guide<em&gt; In vivo</emOptogenetically Belirlenen Kortikal inhibitör dan&gt; Tek birim Kayıt

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em