Biz deneylerin kurulum, Lourdes Delta Arrueta Antequera (Entomoloji Bölümü, Ohio State Üniversitesi / OARDC, Wooster, OH) tarafından sağlanan yardım kabul etmiş sayılırsınız. Dr Therese Polonya (USDA, Orman Hizmetleri, NRS) EAB larva örnekleri göndermek için teşekkür ederim. Yardım mikroskop kurulum takdir Dr. Luis Canas ve Nuriş M Acosta tarafından sağlanan. Ohio Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Merkezi, Ohio State Üniversitesi tahsis Eyalet ve Federal fonları tarafından bu proje için finansman sağlanmıştır.

Farklı adımlar ile tam protokolü akış şeması Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Diseksiyonu oluşturan bireysel adımlar, RNA ekstraksiyon, İlk Strand cDNA sentezi ve QRT-PCR aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır. I. Larvaların Diseksiyon <ol><li> Bu prosedürün başlaması, yer Emerald kül delici veya EAB, nemli kağıt mendil larvaları önce diseksiyonu kadar. Taze hazırlanan 1X fosfat diseksiyonu boyunca tampon soğuk tutmak için buz üzerinde, ya da PBS, tamponlu salin tutun. </li><li> Başlamak için, ince diseksiyon iğneli diseksiyon plaka üzerinde EAB larvaları düzeltin. Daha sonra, diseksiyon plaka soğuk 1X PBS ekleyin. </li><li> İlk olarak, iyi bir çift ile diseksiyon makas larvaları başını kesmek. Daha sonra larva son karın segment çıkarın. </li><li> Forseps bir saatçi çifti kullanarak, larva karkas manikür kaldırın. Sonra bir makas kullanarak karkas uzunluğu boyunca bir kesi yapmak. Kesi yapılır rüptürü bağırsak dikkat çekin. </li><li> Midgut dokusu, yağ organları ve bağ dokusu gibi diğer dokulardan dikkatle izole eder. Daha sonra, taze 1X PBS fatbody kirlenme var olduğundan emin olmak için doku durulayın. 1.5 ml Eppendorf tüp önceden soğutulmuş Trizol reaktifin 500 mcL izole midgut aktarın. </li><li> Sonra, forseps kullanarak yağ vücut doku izole etmek ve soğutulmuş Trizol reaktif 500 mcL içeren 1.5 ml Eppendorf tüp içine aktarın. </li><li> Son olarak, doku bütünlüğü zarar vermemeye özen kalarak, herhangi bir doku hurdaya larva karkas kütikula doku izole eder. Taze PBS izole manikür doku durulayın ve soğutulmuş Trizol reaktif 500 mcL ile 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarın. </li><li> Vücut, manikür ve midgut izole yağ dokuları -80 ° C kadar RNA ekstraksiyon saklanabilir. </li><li> RNA ekstraksiyonu için hazırlanmasında, çeşitli EAB örnekleri gelişim aşamalarına göre sıralayabilirsiniz. Bu aşamalar, 1.-2., 3., ve 4. instars prepupae ve yetişkinler içerir. </li></ol> II. RNA Ekstraksiyon (başına üretici s Trizol Reaktif kullanarak protokol olarak) Homojenizasyon <ol><li> RNA Ekstraksiyon başlamak için, ilk Trizol içeren 1.5 ml Eppendorf tüpleri dokular homojenize plastik havan kullanabilirsiniz. Homojenizasyon sonra, her örnek 1&#39;e mL Trizol reaktifi ile toplam hacmi getirir. </li><li> Gelişimsel aşamaları için, bir havanda sıvı nitrojen içinde tüm hayvan homojenize. Sonra Homojenat bir kısım Trizol 1 mL (50 mg) ekleyin. </li></ol> Faz ayırma: <ol start="3"><li> Oda sıcaklığında 15 dakika için 1 ml Trizol numune tüpleri ile inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra, her tüpe kloroform 200μL ekleyin. Kloroform ekleyerek hemen sonra, tüpler yaklaşık 15 saniye boyunca kuvvetlice sallayın. Daha sonra, tüpler oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. </li><li> Ardından, 2 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12.000 XG örnekleri santrifüj Santrifüj sonra, RNA sulu faz olacaktır. Sulu fazın hacmi 600 ul, ya da toplam Trizol hacmi% 60 olmalıdır. </li></ol> RNA yağış <ol start="6"><li> Sadece sulu faz dikkatlice çıkarın. Sulu faz altındaki maddelerin varlığı çıkarılan RNA kontaminasyonu neden olacaktır. Sonra uygun bir şekilde etiketlenmiş 1.5 ml Eppendorf tüp içine sulu faz transfer. </li><li> RNA, sulu faz hızlandırabilir her tüpe 0,5 ml izopropil alkol karışımı için. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Inkübasyondan sonra, 2 ° C&#39;de 10 dakika 12.000 xg&#39;de tüpler santrifüj </li></ol> RNA yıkayın <ol start="8"><li> Santrifüj sonrasında tüplerin süpernatant atın. RNA tüpün alt kısmında oluşan jel gibi pelet mevcut. Trizol 1 ml başına% 75 etanol en az 1 ml ekleyerek, pelet% 75 etanol ile yıkayın. Vorteks ile karıştırın. Ardından, 2 ° C&#39;de 5 dakika 7500Xg tüpler santrifüj </li></ol> RNA elüsyon <ol start="9"><li> Tüplerinden süpernatant atın. 1 dakika için küçük bir tablo santrifüj tüpleri tekrar santrifüjleyin. Dikkatli pipetleme tüpten herhangi bir aşırı süpernatantı. Tüpün açık bırakın ve pelet hava 5-10 dakika kurumasını bekleyin. Çözünürlüğünü önemli ölçüde azalacaktır üzerinde pelet kuruması için dikkatli olun. </li><li> Pelet hava Kuruduktan sonra tekrar süspansiyon <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">diethylpyrocarbonate</a> ya da DEPC, arıtılmış su. Pelet tekrar süspansiyon için kullanılan su miktarı, pelet boyutuna bağlı olacaktır. 50 mcL sm için DEPC arıtılmış su kullanınbüyük bir pelet için tüm pelet veya 100 mcL. Pelet tamamen birkaç kez pipet ucu aşağı yukarı hareket ve DEPC arıtılmış su içinde çözülür. </li><li> Pelet çözünmüş sonra, 55 ° C&#39;de 10 dakika için örnek bir yer. </li><li> Sonra Nanodrop spektrofotometre (RNA örnek 2 mcL) kullanarak her bir RNA örnek konsantrasyonu ölçer. </li><li> , -80 RNA örnekleri Mağaza ° C daha sonra kullanmak kadar. </li></ol> III. İlk Strand cDNA sentezi (Invitrogen Üst Simge ilk iplikçik Sentez kiti kullanılarak başına üretici s protokolü gibi.) <ol><li> Her RNA örnek için PCR tüpü aşağıdaki ekleyin: <table border="0"><tbody><tr><td> RNA </td><td> x ul </td></tr><tr><td> 10mM dNTP mix M </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Oligo (dt) (0.5 mg / ml) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DEPC su tedavi </td><td> (8-x) ul </td></tr><tr><td> Toplam Hacim: </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Not: x cDNA sentezi için kullanılan RNA hacmi. RNA RNA konsantrasyonuna bağlı olarak, 2-3 mg her reaksiyon için kullanılan ve her bir reaksiyon toplam hacmi 10 ul olmalıdır. </td></tr></tbody></table></li><li> 4 dakika 65 yaşında bir termalcycler Yukarıdaki reaksiyon karışımı ° C yerleştirin. </li><li> Theromocyler tüpleri çıkarın ve en az 2 dakika boyunca hemen buz koyun. </li><li> Aşağıdaki ekleyerek ilk iplikli master karışımı hazırlayın: <table border="0"><tbody><tr><td> 10X RT Tampon </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25mm MgCl 2 </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 0.1M DTT </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> RNaz çıkışı </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table></li><li> RNA örnek içeren her tüp, pipeting karışım 9 ul ana karışımı ekleyin ve karışımı kısaca santrifüj. </li><li> PCR tüpleri geri koyun ve 42 ° C&#39;de 2 dakika boyunca inkübe </li><li> Pause termalcycler ve her tüpe 1 ul Üstsimge II ters transkriptaz enzim (Invitrogen) ekleyin. Bu adım, hızla yapılmalıdır. </li><li> Örnekleri, 1.5 saat boyunca 42 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 70 ° C&#39;de 15 dakika için reaksiyon sonlandırın. </li><li> PCR tüpleri çıkarın ve buz üzerine koyun. </li><li> Her tüpe 1 RNaz H ul ekleyin ve 37 termalcycler yerine geri ° C 20 dakika. </li><li> PCR örnekleri alındıktan sonra, her bir tüp içinde 20 ul nükleaz içermeyen su ekleyin. Bu aşamada, her bir örnek hacmi iki katına çıkar. </li><li> Örnek 2 ul kullanarak her bir numune konsantrasyonu kontrol edin. QRT-PCR kullanımı için 20ng/μl konsantrasyonu yapmak için, her bir numune kısım alın. 20ng/μl bir konsantrasyon örnekleri makyaj su miktarı ilk sentezlenen cDNA konsantrasyonuna bağlı olacaktır. </li></ol> IV. Mah-PCR: Primer Tasarım ve referans gen belirlenmesi <ol><li> 60 ° C ve ~ 100bp bir ürün boyutu bir erime sıcaklığı (Tm) Tasarım primerler. </li><li> AP-PERI1 Bu deneyde ilgi gen olarak kullanılır. Daha sonra analiz ve veri normalleşmesi için bir referans gen ya da iç kontrol gereklidir. Ribozomal protein (AP-RP1) Bu deneme için referans gen olarak kullanılır. </li><li> Referans gen dahil olmak üzere kullanılacak astar, 5uM çalışma stokları hazırlayın. </li></ol> Standartların hazırlanması <ol start="4"><li> Standartları yapılabilir kullanılan primerler verimliliğini hesaplamak için. </li><li> Farklı örnekleri test edilecektir cDNA bir karışımını olun. </li><li> Grafikte istenen her nokta için 5X seri dilüsyonları olun. Dört dilüsyonları yeterli olacaktır, ancak beş son derece tavsiye edilir. </li><li> Hacmi kaç puan ve kaç teknik çoğaltır kullanılan bağlı olarak değişir. Yeterli referans gen dahil olmak üzere test edilen her bir gen için bir standart olmalı. </li></ol> Plaka Şablon <ol start="8"><li> QRT-PCR plaka, her bir kuyu için örnek adını gösteren bir şablon tasarlayın. Her bir gen için standartlar ve en az iki teknik örnek başına çoğaltır eklemeyi unutmayın. </li></ol> Bisiklet parametrelerini ayarlamak <ol start="9"><li> Mah-PCR Makineyi açın ve bisiklet parametreleri girin. Bu deneme için bisiklet parametreleri aşağıdaki gibi: Adım 1: <ul><li> 1 döngüsü: 95 ° C&#39;de 3 dakika </li></ul> Adım 2: <ul><li> 40 döngü: 95 ° C 15 saniye 60 ° C&#39;de 30 sn (Opsiyonel: erime eğrisi belirlemek için aşağıdaki adımları içerir) </li></ul&gt; Adım 3: <ul><li> 1 periyot: 95 ° C 1 dakika </li></ul> Adım 4: <ul><li> 1cycle: 55 ° C 1 dakika </li></ul> Adım 5: <ul><li> 81 döngüleri: 55 ° C &#39;de 30 sn </li></ul></li></ol> Tabak CFX96 (BioRad) makine kurdu <ol start="11"><li> Ayrı bir tüp (referans gen dahil olmak üzere) her bir gen için master karışımı hazırlayın. Her bir kuyu için, ana karışımı oluşur. <table border="0"><tbody><tr><td> Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2.5 X SYBR yeşil </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Ileri Astar </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Primer ters </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Toplam hacim </td><td> Ul 8 </td></tr></tbody></table></li><li> Hazırlarken ana karışımı pipetleme hataları hesaba 1-2 ekstra reaksiyonları içerir. </li><li> Önceden tasarlanmış şablon göre, 2 mcL (20 ng / mcL) her iyi için cDNA ekleyin. Daha sonra, reaksiyon başına 10 mcL toplam hacmi, her bir kuyunun ana karışımı 8 mcL ekleyin. </li><li> Numune iyice karıştırılır emin olmak için yukarı ve aşağı Pipet (2-3X). Herhangi bir sıvı ucu açık kalır emin olun. Çapraz kontaminasyonu engellemek için, her bir örnek için yeni bir ucu kullanın. </li><li> Tüm plaka kurulum sonra, optik bant ile plaka kapsar. Gres varlığı okuma etkileyebilir bant dokunmaktan kaçının. Daha sonra plaka, plakanın altındaki kuyularda tüm ürünler olduğundan emin olmak için 1 dakika için 500 rpm&#39;de santrifüj. </li><li> Santrifüj sonrasında, plakanın alt tarafında herhangi bir buz veya su olup olmadığını kontrol edin. Son olarak, Mah-PCR makine plaka ve PCR programı çalıştırın. </li></ol> V. Deney şematik Temsilciliği <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Akış şeması, gen ekspresyonu çalışma için adımları sırayla resmeden . <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: ortasında midgut gösteren A) larva EAB diseksiyonu. B) larva EAB izole midgut <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: A) Ortalama manikür (Cu), midgut (MG) ​​ve yağ organları (FB) dahil olmak üzere farklı larva dokularında peritrophin geni (AP-PERI1) göreceli ifade değerleri (devir). EAB özel bir ribozomal protein (burada adlı AP-RP1) ilgi gen, AP-PERI1 elde edilen veriler normalleştirilmesi için iç kontrol olarak kullanıldı . B) larva dokularında AP-PERI1 Göreli kat değişim. Manikür doku en az ifade gösterdi ve bu nedenle kalibratör (1X) örnek (Pfaffl 2001) olarak alınmıştır. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4: A) Ortalama EAB larva instars (1., 2., 3. ve 4.), prepupae (PP) ve yetişkinler (A) dahil olmak üzere farklı gelişim evreleri peritrophin geni (AP-PERI1) göreceli ifade değerleri (devir). EAB özel bir ribozomal protein (AP-RP1) ilgi gen, AP-PERI1 elde edilen veriler normalleştirilmesi için iç kontrol olarak kullanıldı. B) AP-PERI1 çeşitli gelişim evreleri Göreli kat değişim. PP örnek mRNA düzeyleri en az düzeyde gösterdi ve bu nedenle kalibratör (1X örnek) olarak alınmıştır. VI. Sonuç Kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR) mRNA düzeyleri farklı böcek doku ve gelişim evreleri teşhis etmek için etkili bir araçtır. Ayrıca, Mah-PCR çoğunlukla böyle mikroarray&#39;ler ve yeni nesil RNA-Seq gibi yüksek kapasiteli gen ekspresyon analizleri elde edilen verileri doğrulamak için önemli bir araç olmuştur.

<ol>
	<li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritrophic+matrix+structure+and+function.">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li><li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly,+Mayetiola+destructor+[Say].">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li><li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol.">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li><li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li><li>Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).</li></ol>

Eşik döngüleri (Ct) değeri, QRT-PCR plaka her bir numune için elde edilir. Standart eğri yapmak için, her bir dilüsyon için elde Ct değeri, onun konsantrasyonu günlük karşı çizildi. Deney numuneleri için Ct değerlerini daha sonra bu seyreltme serisi standart eğrisi üzerine çizilen. Hedef miktarları, her deney yani doku ve gelişim ifade için ayrı bir standart eğrileri hesaplandı. Göreceli ifade değerleri (devir), daha sonra iç kontrol için elde edilen miktar (AP-RP1) ile ilgi hedef ...

analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr

Emerald kül delici (EAB,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;), Dişbudak ağaçları, milyonlarca öldürdü egzotik bir invaziv haşere, (<em&gt; Fraxinus</em&gt; Spp.) Kuzey Amerika.<strong&gt;</strong&gt; EAB hızla yayılmaya devam ediyor ve saldırılar olgun ağaçların fidan, farklı yaşlardaki ağaçların dişbudak. Ancak, çok az bir tarih ya da herhangi bir moleküler bilgi EAB var. Biz doku düzeyinde moleküler tabanlı fizyolojik süreçleri deşifre ilgilenen dişbudak ağaçları başarılı kolonizasyon yardım EAB. Bu yazıda tespit mRNA düzeyleri farklı larva dokular (midgut, yağ organları ve manikür de dahil olmak üzere) ve farklı gelişim evreleri (1 de dahil olmak üzere etkin kullanımı kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR)<sup&gt; St</sup&gt; - 2<sup&gt; Nd</sup&gt; - 3<sup&gt; Rd</sup&gt; - 4<sup&gt; Th</supEAB&gt; instars, prepupae ve yetişkinler). Bir örnek olarak, bir peritrophin geni (burada adında,<em&gt; AP-PERI1</em&gt;), Ilgi gen ve ribozomal protein (örneğinde<em&gt; AP-RP1</em&gt;), Iç kontrol olarak. Peritrophins böcek bağırsak astar peritrophic membran / matris (PM), önemli bileşenleridir. PM midgut epitel sindirim ve mekanik koruma da dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonları vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR at JoVE.com

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR) mRNA düzeyleri farklı böcek doku ve gelişim evreleri teşhis etmek için etkili bir araçtır. Bu yazıda farklı larva dokularında tespit mRNA düzeyleri ve istilacı böcek türlerinin, zümrüt kül delici gelişim evreleri QRT-PCR kullanımı göstermektedir.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

analysis-gene-expression-emerald-ash-borer-agrilus-planipennis-using

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

10.6K Görüntüleme.  The Ohio State University. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR) mRNA düzeyleri farklı böcek doku ve gelişim evreleri teşhis etmek için etkili bir araçtır. Bu yazıda farklı larva dokularında tespit mRNA düzeyleri ve istilacı böcek türlerinin, zümrüt kül delici gelişim evreleri QRT-PCR kullanımı göstermektedir.

Video: Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...