RNAi, nematodlardaki genlerin işlevini tanımlamak için etkili bir yöntem haline gelmiştir ve patojenik nematodları etkili bir şekilde kontrol etmenin yeni bir yolu olarak önerilmektedir. RNAi, nematodları dsRNA'ya batırıyor, prosedür için yeterli olabilir. Başlamak için, nematodları Baermann huni yöntemiyle toplayın.
Bunun için, bir huninin altına kelepçelenmiş bir lastik tüp yerleştirin ve huninin ağzına iki kat filtre kağıdı yerleştirin. Botrytis cinerea mantar kültürlerini huniye aktarın ve mantar paspasını batırmak için su ekleyin. Nematodlar toplandığında, iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne 500 mikrolitre ekstraksiyon reaktifi ve 100 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin.
Nematodların 20 mikrolitresini aspire edin ve numuneleri 30 saniye boyunca 9.000 x g'de öğütün. Beş dakika boyunca kuluçkaya yatın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze bir santrifüj tüpüne aktarın.
100 mikrolitre kloroform ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Üç dakika boyunca kuluçkaya yatın ve daha sonra dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Yine, süpernatantı taze bir santrifüj tüpüne aktarın.
250 mikrolitre izopropil alkol ve vorteksi kuvvetlice ekleyin. 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj ve vorteks. Süpernatantı atın ve RNA'yı yıkamak için 500 mikrolitre% 75 etanol ekleyin.
Vorteks numunesi ardından dört santigrat derecede beş dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüjleme ile takip edin. RNA peletini beş dakika boyunca hava ile kurutun ve 30 mikrolitre RNaz içermeyen suda tekrar askıya alın. Bu formülü kullanarak RNA konsantrasyonunu hesaplayın ve A260 - A280 oranını hesaplayın.
Daha sonra, BX ppm-1 geninin kısmi kodlama dizisini B.xylophilus'tan yükseltmek için bir çift primer kullanın. Daha sonra ppm-1 bir gen dizilerini T7 promotörünü içeren bir pGEM-T Easy vektörüne klonlayın. 894 baz çifti uzun ppm-1 gen fragmanını, klonlanmış plazmidi pcr şablonu olarak kullanarak kurtarın.
Ardından, dsRNA'yı sentezlemek için bir in vitro transkripsiyon kiti kullanın. Bir spektrofotometre kullanarak dsRNA'nın kalitesini analiz edin ve% 1'lik bir agaroz jeli üzerindeki ürünleri görselleştirin. Dört mikrolitre 5X ıslatma tamponu ekleyin ve mililitre başına 0.8 mikrogramlık son bir RNA konsantrasyonu elde etmek için çift damıtılmış su ile 20 mikrolitreye kadar hacmi oluşturun.
Daha sonra nematodları 30 dakika boyunca tabağa yerleştirin ve yumurtaların dibe yapışmasını bekleyin. Sadece yumurtalar tabakta kalana kadar yumurtaları rahatsız etmeden suyu ve nematodları dikkatlice çıkarın. J2 larvalarını elde etmek için toplanan yumurtaları karanlıkta 25 santigrat derecede 24 saat boyunca yumurtadan çıkarın.
Larvaları bir tüpte toplayın ve üç kez çift damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra larvaları dsRNA çözeltisini içeren tüpe aktarın. Buna,% 1'lik bir çözelti elde etmek için resorsinol çözeltisi ekleyin.
DsRNA'nın larvalara yeterli emilimini sağlamak için larvaları sallanan bir masaya yerleştirin. Kontroller için, aynı miktarda nematodları dsRNA probu olmadan veya bir GFP dsRNA probu ile ıslatma tamponuna batırın. Gen ekspresyon seviyesindeki değişiklikleri değerlendirmek için actB ve tbb-2 genlerini dahili referanslar olarak kullanarak bir qPCR gerçekleştirin.
Çözünme eğrisinden ve Ct değerinden göreceli gen ekspresyon düzeyini tahmin etmek için delta delta Ct yöntemini kullanın. RNAi'den sonra, J2 larvalarını yetişkinliğe kadar Botrytis cinerea çimlerinde PDA plakaları üzerinde kültürleyin. Birinci bölümde gösterildiği gibi Baermann huni yöntemini kullanarak yetişkinleri toplayın.
Yetişkin nematodların görüntülerini mikroskop altında elde edin ve 50 erkek ve 50 dişi nematodun vücut uzunluğunu ölçmek için ImageJ yazılımını kullanın. Her numune için ortalama ve standart sapmayı hesaplayarak verileri analiz edin. Farklı gruplardan örneklerin araçlarını karşılaştırmak için Student's t testini uygulayın.
RNAi'den sonra göreceli gen ekspresyon analizi, ppm-1 dsRNA'nın B.Xylophilus'un ppm-1 bir geninin ekspresyonunu etkili bir şekilde inhibe edebileceğini göstermiştir. Oysa eksojen GFP dsRNA'nın ppm-1 ekspresyonu üzerinde hiçbir etkisi yoktu. RNAi'den sonra, yetişkinlerin büyüklüğü, küçük vücut büyüklüğü mutant fenotipine neden olan cinsel olgunluğa ulaşmasına rağmen belirgin şekilde azalmıştır.
Mutant dişilerin ve erkeklerin ortalama vücut uzunluğu, kontrol grubu için 971 ve 912 mikrometreye kıyasla 544 ve 526 mikrometre idi En önemli şey, nematodları çift iplikli RNA çözeltisine aktarmak ve nematodları beslenmeye teşvik etmek için başka bir reaktif eklemektir. Bu yöntem büyük ölçekli gen taraması için uygundur ve hücre araştırmalarında yaygın olarak kullanılır. B.Xylophilus'un gen fonksiyonunun bu yöntemle incelenmesi, B.Xylophilus'un biyolojik kontrolü için yol gösterici bir değere sahiptir.
