Lazer taramalı konfokal mikroskobu açın ve slaydı slayt tutucuya yerleştirin. Görüntü görselleştirme ve yakalama için 20X objektif lensi seçin. Konfokal yazılımdan, BODIPY 493/503 ve DAPI arasındaki karşılıklı etkileşimi önlemek için sıralı tarama modunu seçin.
Ardından, 488 nanometre argon lazer hattını kullanarak BODIPY 493/503 kalıbını ve 405 nanometre lazer hattını kullanarak DAPI boyasını heyecanlandırın. Emisyon aralıklarını BODIPY için 493 ila 589 nanometre ve DAPI için 410 ila 464 nanometre olarak ayarlayın. Ardından, çerçeve boyutlarını, tarama hızını ve 12 bit olarak iki kat bit derinliğini, çift yönlü olarak yönü, tarama alanı dijital yakınlaştırma eksi bir ve iğne deliği eksi bir alan birimini içeren ortalamayı ayarlayarak mikroskop ayarlarını yapılandırın.
Kazanç ve dijital kazanç ayarlarını yapın. Aralık göstergesinde belirtildiği gibi doygun piksel olmadığından emin olun. Lipit damlacıklarını doğru bir şekilde tanımladıktan sonra, BODIPY ve DAPI kanallarıyla görüntüyü elde edin.
Geniş alan görüntüleri oluşturmak için 10X öznel lense geçin. Ardından karo tarama modunu etkinleştirin ve beşe beş mozaik görüntü oluşturacak şekilde yapılandırın. 3D ve ortogonal görünümler oluşturmak için, kapak camının üstüne bir damla daldırma yağı uygulayın ve objektif lensi 40X lense değiştirin.
Z-stack modunu seçin. Görüntü yakalama için ilk ve son konumları tanımlamak üzere Z düzlemini ayarlayın ve odaktaki tüm damlacıkları yakalamak için yaklaşık 0,5 mikron optik dilim kalınlığı sağlayın. Orto modülünü seçin ve ortogonal görünümler oluşturun.
Saydamlık oluşturma modunu izleyen 3B modülü seçerek 3B görüntüler elde edin. Görüntü alımından sonra, CellProfilr'ı kullanarak tek düzlemli görüntüleri işlemeye ve analiz etmeye başlayın. CellProfiler arayüzünün sol üst köşesindeki görüntü moduna tıklayarak görüntüleri TIF formatında yükleyin.
BODIPY damlacığı ve DAPI çekirdeği boyalı görüntüleri dosya adlarına göre sıralamak için adlar ve türler modülünü kullanın. Lipid damlacık analizi için sadece BODIPY lekeli görüntüler kullanın. Modülleri ayarla'ya tıklayarak işlem hattı inşaatını başlatın ve görüntüleri gri tonlamaya dönüştürmek için rengi griye çevir modülünü seçin.
Ardından, birincil nesneleri tanımlama modülünü kullanarak, gri tonlamalı görüntülerdeki lipit damlacıklarını tespit etmek için 6 ila 300 piksel arasında lipit damlacıkları ve bir eşik düzeltme faktörü tanımlayın. Tanımlanan lipit damlacıklarının piksel yoğunluğunu ölçmek için, bir ölçüm nesnesi yoğunluğu modülü ekleyin. Daha az yoğun sinyallerin nihai lipit damlacık analizinden hariç tutulmasını sağlarken yalnızca en güçlü sinyallerin ölçülmesini sağlamak için ek bir filtre nesneleri modülü ekleyin.
Ardından, çıktı verileriyle ilgili lipit damlacıklarını ölçmek için, nesne boyutu hesaplama şekli modülünü ekleyin. Ardından, tanımlanan damlacığı orijinal görüntüye bindirmek için bir bindirme anahatları modülü ekleyin ve böylece segmentasyonun işlenmemiş görüntüde de doğru görünmesini sağlayın. İşiniz bittiğinde, elektronik tablo modülüne bir dışa aktarma ekleyin ve sol alt köşedeki görüntüleri analiz et düğmesine tıklayın.
Kontrol ile karşılaştırıldığında, HFD ile beslenen hayvanlar belirgin bir dislipidemik profil ve dolaşımdaki trigliserit seviyelerinde ince bir artış gösterdi. Geniş alan görüntüleri, HFD ile beslenen hayvanların karaciğerlerinde artmış lipit damlacıkları ortaya koydu. CellProfiler ile yapılan analiz, artan sayıda hepatik lipid damlacığı, arttırılmış BODIPY floresan yoğunluğu,% 360 alan oranı ve daha büyük çaplar ortaya koydu.
HFD ile beslenen hayvanlarda boyut dağılımı, makro veziküler hepatik lipit damlacıklarında dokuz mikrondan fazla bir artış ve üç mikrondan daha az mikro-parçacıklarda bir azalma olduğunu ortaya koymuştur.
