Bu araştırma, Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (FEDER) ve Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) ve POCI-01-0145-FEDER-007440 aracılığıyla Ulusal ve Avrupa Fonları tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, Coimbra Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin bir tesisi ve ulusal altyapı PPBI-Portekiz BiyoGörüntüleme Platformu'nun (POCI-01-0145-FEDER-022122) bir üyesi olan iLAB - Mikroskopi ve Biyogörüntüleme Laboratuvarı'nın desteğine ve FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142'nin desteğine teşekkür eder.

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri, Coimbra Klinik ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (iCBR) Hayvan Refahı Kurumu (ORBEA, # 9 / 2018) tarafından onaylanmıştır ve Hayvan Bakımı Ulusal ve Avrupa Direktiflerine ve ARRIVE kılavuzlarına uygundur.
1. Deneysel tasarım
<ol><li>Sıcaklık (22 °C ± 1 °C), nem (%50-%60) ve ışık (12 saat açık-karanlık döngüsü) kontrollü çevresel koşullar altında havalandırılan kafeslerde ve musluk suyuna ve standart kemirgen chow'a ad libitum erişimi olan 13 haftalık erkek Wistar sıçanları.</li>
	<li>2 haftalık bir iklimlendirme periyodundan sonra, sıçanları keyfi olarak iki gruba ayırın.</li>
	<li>Kontrol (CTRL, n = 6) ve yüksek yağlı diyet gruplarını (HFD, n = 6) 24 hafta boyunca sırasıyla standart chow ve yüksek yağlı bir diyetle (% 45 kcal / yağ) besleyin.</li>
	<li>Vücut ağırlığını (BW) haftalık olarak izleyin. Yiyecek ve içecek tüketimini kafes başına günlük olarak kaydedin.</li>
</ol>2. Karaciğer örneği hazırlama
<ol><li>Karaciğer diseksiyonu<ol><li>Peristaltik pompayı hazırlayın: Borudan %70 etanol çalıştırın, borunun çıkış ucuna 27 G'lık bir iğne bağlayın ve boruyu buz gibi soğuk (4 °C) 1x fosfat tamponlu salin (PBS, pH ~ 7,4) ile astarlayın (örneğin, 1,6 mm ID silikon borulu, IV mini damlama setli peristaltik bir pompada 200 rpm). Vücut ağırlığına göre ayarlayın (örneğin, 100-150 g'lık bir sıçan için, yaklaşık 10-12 mL / dak'lık bir akış hızı kullanın).</li>
		<li>Bir anestezi protokolü kullanarak sıçanı intraperitoneal enjeksiyonla uyuşturun (ketamin nihai konsantrasyonu = 75 mg / kg ve son medetomidin konsantrasyonu = 1 mg / kg). NOT: Sıçanın ayak parmağı çimdikleme yanıtı yöntemi kullanılarak tamamen uyuşturulduğundan emin olun.</li>
		<li>Sıçanı diseksiyon tepsisine yerleştirin.</li>
		<li>Kürkü% 70 etanol ile iyice sterilize edin ve bir kağıt havluyla kurulayın.</li>
		<li>Makas kullanarak, deriden "U" şeklinde bir kesi yapın ve diyaframın altında kesin. Ardından, kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini kenarlardan rostral olarak kesin.</li>
		<li>1x PBS çalışırken, iğneyi sol ventrikülden yükselen aort içine geçirin ve kelepçeleyin. Daha sonra, perfüzyon başladıktan sonra drenaja izin vermek için sağ atriyum kesilir. NOT: Kan PBS ile değiştirildiği için karaciğer ağartmaya başlamalıdır.</li>
		<li>Makas ve Dumont forseps kullanarak, karaciğeri dikkatlice çıkarın ve 1x PBS ile durulayın.</li>
		<li>Karaciğeri bir Petri kabına aktarın ve tartın.</li>
		<li>Bir neşter kullanarak, gömme işlemi için karaciğerin sol lobunun lateral tarafından (kenardan 1 cm) 5 mm kalınlığında hepatik doku örnekleri toplayın. NOT - Kalan doku uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Karaciğer dokusu gömme<ol><li>Kuru bir buz kabı hazırlayın ve kriyomoldları numune kimliği ve oryantasyonu ile uygun şekilde etiketleyin.</li>
		<li>Optimum kesme sıcaklığını (OCT) elde etmek için kriyomolün merkezine birkaç damla kriyo gömme matrisi yerleştirin.</li>
		<li>Doku örneğinin enine bir kesit için uygun şekilde yönlendirildiğinden emin olun. NOT: Kriyomoldun dibine temas eden tarafın ilk önce bölümlenecek taraf olduğundan emin olun.</li>
		<li>Tamamen kaplanana kadar kriyomold üzerine dikkatlice daha fazla OCT bırakın. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemeye çalışın. Gerekirse, düz forsepslerle, OCT içindeki kabarcıkları çıkarın.</li>
		<li>Kriyomoldu OCT kaplı numune ile birlikte kuru bir buz kabına hızla yerleştirin. NOT: Dokular 3 yıl boyunca -80 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Dondurulmuş doku kesitleme
<ol><li>Kriyostat sıcaklığını ayarlayın (hazne: -21 °C; numune: -18 °C) ve yeni bir steril bıçak takın.</li>
	<li>Sıcaklığın dengelenmesine izin vermeden önce numuneleri kriyostata 30 dakika bekletin.</li>
	<li>Numunenin yapışmasına izin vermek için numune diski üzerinde tek bir OCT tabakası yapın. OCT'nin donmasına izin verin ve doku örneğini istenen yönde monte edin. NOT: Kesme yüzeyi bıçağa paralel olmalıdır. İyi yapışmayı korumak için, ısı çıkarıcıyı numunenin üstüne yerleştirin. Önceki adımlar, kuru buzlu kuru bir buz kabında da gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Numuneyi numune kafasına yerleştirin ve dokunun yüzeyini kesin (birkaç 30 μm doku örneği bölümü).</li>
	<li>İlgilenilen bölge kesitleme için erişilebilir olduğunda, 12 μm kalınlığında kesitleri kesin ve bunları oda sıcaklığında (RT) tutulan etiketli mikroskop slaytlarına yerleştirin. NOT: Kesiti toplamak için, slaytı yavaşça doku bölümüne doğru hareket ettirin. Her slayt iki karaciğer bölümü toplayabilir.</li>
	<li>RT'de slaytların 10 dakika kurumasını bekleyin. NOT: Slaytlar 6-12 ay boyunca -20 °C'de veya 3 yıla kadar -80 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>4. BODIPY boyama
<ol><li>Slaytları RT'de bir slayt boyama sisteminde 30 dakika boyunca çözün.</li>
	<li>1x PBS ile yıkayın (her biri 5 dakika boyunca 3x).</li>
	<li>Bir bariyer kalemi kullanarak bölümü hidrofobik bir tabaka ile daire içine alın.</li>
	<li>500 μg/mL BODIPY 493/503 stok çözeltisi hazırlayın: 1 mg BODIPY 493/503'ü 2 mL çözücü içinde çözün (%90 DMSO; %10 1x PBS). Işıktan koruyun. 37 ° C'de 1 saat (9.5-10 W) ultrasonik bir banyoda sonikasyon. NOT: Çözelti en az 30 gün boyunca -20 ° C'de saklanabilir.</li>
	<li>997,9 μL 1x PBS'ye 2 μL BODIPY 493/503 stok çözeltisi ve 0,1 μL DAPI stok çözeltisi (5 mg/mL) ekleyerek BODIPY boyama çözeltisini (1 μg/mL) hazırlayın.</li>
	<li>Slaytları (75 μL/slayt) BODIPY 493/503 (1 μg/mL) ve DAPI (0,1 μg/mL) ile RT'de 40 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Bu adımdan itibaren slaytları karanlıkta tutun.</li>
	<li>Slaytları 1x PBS ile yıkayın (her biri 5 dakika boyunca 3x).</li>
	<li>Slaytları bir floresan montaj ortamı kullanarak kapaklarla monte edin, 30 dakika kurumasını bekleyin ve oje ile kapatın. NOT: Slaytlar görüntülemeye kadar 4 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>5. Lipid ölçümü
<ol><li>Serum total kolesterol ve TG düzeylerini otomatik, doğrulanmış bir yöntem ve ekipman kullanarak ölçün.</li>
	<li>Hepatik TG seviyelerini, üreticinin protokolüne göre bir trigliserit kolorimetrik tahlil kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak ölçün.</li>
</ol>6. Görüntü alma
<ol><li>Slaydı lazer taramalı konfokal mikroskop slayt tutucusuna yerleştirin.</li>
	<li>Görüntü görselleştirme ve elde etme için, 20x objektif lensli bir konfokal mikroskop kullanın (plan-apokromat: 20x / 0.8).</li>
	<li>BODIPY 493/503 ve DAPI arasındaki karşılıklı konuşmayı önlemek için, konfokal yazılımdaki sıralı (en iyi sinyal) tarama modunu kullanın.</li>
	<li>488 nm argon lazer hattını kullanarak BODIPY 593/503'ü ve 405 nm lazer hattını kullanarak DAPI'yi heyecanlandırın. BODIPY 493/503 için emisyon aralıklarını 493-589 nm ve DAPI için 410-464 nm olarak ayarlayın.</li>
	<li>Şu ayarları kullanın: iğne deliği: 1 AU, çözünürlük: 1.024 piksel x 1.024 piksel, bit derinliği: 12, piksel boyutu: 0,415 μm, çift yönlü mod, tarama hızı: 7 (20x reklam verme amacı için ~1,58 μs/piksel), çizgi ortalaması: 2x ve dijital yakınlaştırma: 1. NOT: Yukarıda belirtilen tarama parametreleri, kullanılan her konfokal mikroskop ve amaç için optimize edilmelidir.</li>
	<li>Kazancı ve dijital kazancı, aralık göstergesinde doygun piksel algılanmayacak şekilde uygun şekilde ayarlayın. NOT: Ofseti ayarlayarak arka plan sinyalini düzeltin.</li>
	<li>LD'ler doğru bir şekilde tanımlandıktan sonra, görüntüyü BODIPY ve DAPI kanallarıyla alın. NOT: Tüm resimler, her renk kanalı için aynı koşullarda (pozlama ve genel ayarlar) alınmalıdır.</li>
	<li>Geniş alan görüntüleri oluşturmak için (Şekil 2), hedefi a10x objektif lens olarak değiştirin (plan-neofluar: 10x/0.3).</li>
	<li>Döşeme Tarama modunu seçin ve 5 görüntü başına 5'lik mozaikler yapın. NOT: Bu çalışmada, karoları analiz için uygun şekilde birleştirmek için her bir karo% 10'luk bir örtüşme vardı.</li>
	<li>3B ve ortogonal görünümler oluşturmak için (Şekil 3A), kapak camının üstüne bir damla daldırma yağı yerleştirin ve hedefi 40x objektif lensle değiştirin (plan-neofluar: 40x/1.30 yağ).</li>
	<li>Z-Stack modunu seçin ve Z düzlemini ayarlayarak, tüm damlacıkların yakalandığından emin olmak için optimum kalınlıkta (~0,5 μm) bir optik dilimle elde edilecek ilk ve son konumları tanımlayın. NOT: Görüntü alımını hızlandırmak ve ağartmayı önlemek için, optik dilim optimal olmayan bir boyuta ayarlanabilir ve iyi bir 3D rekonstrüksiyon için en az% 30 aşırı örnekleme sağlanır.</li>
	<li>Orto modülünü seçin ve ortogonal görünümler oluşturun.</li>
	<li>Konfokal mikroskop yazılımı ile Saydamlık İşleme Modu'nu takip eden 3B modülü seçerek 3B görüntüler elde edin.</li>
</ol>7. Görüntülerin analizi
<ol><li>CellProfiler (sürüm 4.2.5) ile tek düzlemli görüntüleri (20x büyütme) işleyin ve analiz edin. NOT: Bu çalışmada kullanılan boru hattı Adomshick ve ark.'dan uyarlanmıştır.45.</li>
	<li>CellProfiler penceresinin sol üst köşesindeki Görüntüler modülüne tıklayın ve görüntüleri .tiff dosyaları olarak yükleyin.</li>
	<li>Dosya adlarına göre BODIPY- (damlacık) ve DAPI- (çekirdek) lekeli görüntüleri sıralamak için NamesAndTypes modülünü kullanın. LD analizini yalnızca BODIPY boyalı görüntülerle gerçekleştirin.</li>
	<li>İşlem hattı yapılandırmasını başlatmak için Modülleri Ayarla'ya tıklayın ve görüntüleri gri tonlamalı görüntülere dönüştürmek için ColorToGray modülünü seçin. NOT: Nesneleri tanımlamak için gri tonlamalı görüntüler gereklidir.</li>
	<li>Gri tonlamalı görüntüyü kullanarak IdentifyPrimaryObjects modülünü kullanarak damlacıkları tanımlayın. NOT: Bu modüldeki parametreler, iyi LD tanımlaması yapmak için ayarlanmalıdır. Bu çalışmada, boyutu 6 piksel ile 300 piksel arasında olan LD'lerin ve eşik düzeltme faktörünün 1.0 olarak tanımlanması en doğru tanımlamaya yol açmıştır.</li>
	<li>Tanımlanan lipit damlacıklarının piksel yoğunluğunu ölçmek için bir MeasureObjectIntensity modülü ekleyin.</li>
	<li>Son lipit damlacık analizinden daha az yoğun sinyaller hariç tutulurken yalnızca en güçlü sinyallerin ölçülmesini sağlamak için ek bir FilterObjects modülü ekleyin (minimum yoğunluk: 0,15; maksimum yoğunluk:1 rastgele birim).</li>
	<li>Çıktı verileriyle ilgili LD'leri ölçmek için MeasureObjectSizeShape modülünü ekleyin.</li>
	<li>Tanımlanan damlacığı orijinal görüntüye bindirmek için bu noktada bir OverlayOutlines modülü ekleyin ve böylece segmentasyonun işlenmemiş görüntüde de doğru görünmesini sağlayın. NOT: Bu isteğe bağlı (kalite kontrol) bir adımdır.</li>
	<li>Sonuna bir ExportToSpreadsheet modülü ekleyin ve sol alt köşedeki Görüntüleri Analiz Et düğmesine tıklayın.</li>
</ol>8. İstatistiksel analiz
<ol><li>Herhangi bir istatistiksel analiz yazılımı uygulamasını kullanarak sonuçları ortalamanın (S.E.M.) ortalama ± standart hatası olarak ifade edin. NOT: Bu çalışmada istatistiksel analiz için GraphPad yazılımı kullanılmıştır.</li>
	<li>Normallikten önemli sapmaları değerlendirmek için Kolmogorov-Smirnov testini kullanarak değerlerin dağılımını analiz edin. Öğrencinin eşlenmemiş t-testini kullanarak parametrik verileri analiz edin. NOT: p < 0,05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.</li>
</ol>

3D Floresan Lipid Damlacık Rekonstrüksiyonu ile Hepatik Steatozun Değerlendirilmesi

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

LD değerlendirmesi için bu BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol, hepatik steatozun değerlendirilmesi için yeni bir görüntüleme yaklaşımı geliştirmeyi amaçlamıştır. Obezite ve yağlı karaciğer hastalığı arasındaki güçlü korelasyon göz önüne alındığında, Batı tarzı yüksek yağlı diyet, hepatik steatoz26'nın bir hayvan modelini oluşturmak için kullanılmıştır. Hepatik TG içeriğinde sağlam bir artış, HFD ile beslenen hayvanlarda artmış bir hepatik l...

Klasik olarak enerji depoları olarak görülen lipit damlacıkları (LD'ler), lipit depolanmasına aracılık eden özel hücresel organellerdir ve esas olarak bir fosfolipid monokatmanı 1,2,3 tarafından kapsüllenen kolesterol esterleri ve trigliseritler (TG'ler) içeren hidrofobik nötr bir lipit çekirdeği içerirler.
LD biyogenezi, triasilgliserol (TAG) ve sterol esterlerinin sentezi ile başlayan endoplazmik retikulumda (ER) meydana gelir. Nötr lipitler, düşük konsantrasyonlarda ER çift katmanlı broşürler arasında dağılır, ancak hücre içi konsantrasyonları4 arttığında ER membranından neredeyse küresel damlacıklar halinde büyüyen ve tomurcuklanan yağ lenslerine birleşir. Daha sonra, ER çift katmanlı ve sitosolden proteinler, özellikle perilipin (PLIN) protein ailesi, tomurcuklanmayı kolaylaştırmak için LD'lerin yüzeylerine translokasyon yapar 5,6,7,8,9.
Yeni yağ asidi sentezi ve LD füzyonu veya birleşmesi yoluyla, LD'ler farklı boyutlarda büyür. Buna göre, LD'lerin boyutu ve sayısı farklı hücre tipleri arasında önemli ölçüde farklılık gösterir. İlk LD'ler (iLD'ler) olarak bilinen küçük damlacıklar (300-800 nm çapında), neredeyse tüm hücreler tarafından oluşturulabilir4. LD oluşumunda daha sonra, çoğu hücre bazı iLD'leri daha büyük olanları genişleten LD'lere (eLD'ler >1 μm çapında) dönüştürebilir. Bununla birlikte, adipositler ve hepatositler gibi sadece spesifik hücre tipleri, dev veya süper boyutlu LD'ler (onlarca mikron çapına kadar) oluşturma kapasitesine sahiptir4,10.
LD'ler, hücresel lipit metabolizmasının düzenlenmesinde, lipotoksisitenin baskılanmasında ve ER stresinin, mitokondriyal disfonksiyonun ve nihayetinde serbest yağ asitlerinin (FA'lar) neden olduğu hücre ölümünün önlenmesinde çok önemli bir rol oynamaktadır11,12,13,14. Ayrıca, LD'ler ayrıca gen ekspresyonunun, viral replikasyon proteini tutulmasının ve membran kaçakçılığının ve sinyalizasyonunun düzenlenmesinde de rol oynamıştır15,16,17. Bu nedenle, LD biyogenezinin yanlış düzenlenmesi, metabolik sendrom, obezite, tip 2 diabetes mellitus (T2DM) ve / veya arteriyoskleroz ile ilişkili kronik hastalıkların bir işaretidir.
Karaciğer, metabolik bir merkez olarak, lipitleri depolayarak ve işleyerek lipit metabolizmasından çoğunlukla sorumludur ve bu nedenle, lipotoksisite21 tarafından sürekli tehdit edilmektedir. Hepatik steatoz (HS), bir dizi ilerleyici karaciğer hastalığının ortak bir özelliğidir ve sonuçta karaciğer metabolik disfonksiyonuna, inflamasyona ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının ileri formlarına yol açabilen sitozolik LD'ler şeklinde aşırı hücre içi lipid birikimi ile karakterizedir22,23,24,25. HS, çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL'ler) içindeki yağ asidi oksidasyonu ve trigliseritler olarak ihracat hızı, plazmadan hepatik yağ asidi alım hızından ve de novo yağ asidi sentezinden26 daha düşük olduğunda ortaya çıkar. Lipidlerin hepatik birikimi sıklıkla iki formda ortaya çıkar - mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz- ve bunlar farklı sitoarkitektonik özellikler gösterir27. Tipik olarak, mikro-veziküler steatoz, çekirdeğin merkezi olarak yerleştirildiği hepatosit boyunca dağılmış küçük LD'lerin varlığı ile karakterize edilirken, makroveziküler steatoz, hepatositin büyük bölümünü kaplayan ve çekirdeği çevreye iten tek bir büyük LD'nin varlığı ile karakterize edilir28,29. Özellikle, bu iki tip steatoz sıklıkla birlikte bulunur ve bu iki LD paterninin hastalık patogenezini nasıl etkilediği belirsizliğini korumaktadır, çünkü kanıtlar hala tutarsızdır31,32,33,34. Bununla birlikte, bu tür analizler genellikle LD'lerin dinamik davranışını anlamak ve hepatik steatozukarakterize etmek için klinik öncesi ve klinik çalışmalarda bir "referans standardı" olarak kullanılır 29,34,35,36.
HS tanısı ve derecelendirilmesinde altın standart olan karaciğer biyopsileri, H&E boyalı karaciğer bölümlerinde lipid damlacıklarının lekelenmemiş vakuoller olarak değerlendirildiği histolojik hematoksilin ve eozin (H&E) analizi ile rutin olarak değerlendirilmektedir37. Makroveziküler steatoz değerlendirmesi için kabul edilebilir olsa da, bu tip boyama genellikle mikro-veziküler steatoz38'in değerlendirmesini daraltır. Yağ Kırmızısı O (ORO) gibi lipitte çözünür diazo boyaları, hücre içi lipit depolarını analiz etmek için klasik olarak parlak alan mikroskobu ile birleştirilir, ancak bunların hala bir takım dezavantajları vardır: (i) boyama işleminde etanol veya izopropanol kullanımı, bu da genellikle doğal LD'lerin bozulmasına ve hücrelerin sabitlenmesine rağmen ara sıra füzyona neden olur39; (ii) ORO çözeltisi, sınırlı raf ömrü nedeniyle taze tozun çözülmesini ve filtrelenmesini gerektirdiğinden, zaman alıcı doğa, böylece daha az tutarlı sonuçlara katkıda bulunur; (iii) ve ORO'nun sadece lipit damlacıklarından daha fazlasını boyadığı ve sıklıkla hepatik steatoz38'i abarttığı gerçeği.
Sonuç olarak, Nil Kırmızısı gibi hücre geçirgen lipofilik floroforlar, yukarıda belirtilen sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek için canlı veya sabit numunelerde kullanılmıştır. Bununla birlikte, hücresel lipid organel etiketlemesinin spesifik olmayan doğası, LD değerlendirmelerini tekrar tekrar daraltır40. Dahası, Nil Kırmızısı'nın spektral özellikleri, çevrenin polaritesine göre değişir ve bu da genellikle spektral kaymalara yol açabilir41.
Lipofilik floresan prob 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (uyarma dalga boyu: 480 nm; emisyon maksimum: 515 nm; BODIPY 493/503), hücre içi LD'ler tarafından hızlı bir şekilde alınmasına izin veren, lipit damlacık çekirdeğinde biriken ve daha sonra parlak yeşil floresan12 yayan hidrofobiklik özellikleri sergiler. Nil Kırmızısı'nın aksine, BODIPY 493/503 çevre polaritesine duyarsızdır ve LD görüntüleme için yüksek parlaklık gösterdiği için daha seçici olduğu gösterilmiştir. Nötr LD'leri boyamak için, bu boya canlı veya sabit hücrelerde kullanılabilir ve diğer boyama ve / veya etiketleme yöntemleriyle başarıyla birleştirilebilir42. Boyanın bir diğer avantajı, bir çözeltiye yerleştirmek için çok az çaba gerektirmesi ve kararlı olmasıdır, böylece her deney için taze olarak hazırlama ihtiyacını ortadan kaldırır42. BODIPY 493/503 probu, hücre kültürlerinde LD'lerin lokalizasyonunu ve dinamiklerini görselleştirmek için başarıyla kullanılmış olsa da, bazı raporlar bu boyanın insan vastus lateralis kası43, sıçan soleus kası 42 ve fare bağırsağı44 dahil olmak üzere dokularda LD görüntüleme aracı olarak güvenilir bir şekilde kullanıldığını göstermiştir.
Burada, hepatik steatozun bir hayvan modelinden karaciğer örneklerinde LD sayısının, alanının ve çapının değerlendirilmesi için alternatif bir analitik yaklaşım olarak optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 tabanlı protokol öneriyoruz. Bu prosedür karaciğer örneği hazırlama, doku kesitleme, boyama koşulları, görüntü elde etme ve veri analizini kapsar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10191455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CC</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>Used to design the figures</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic analyzer Hitachi 717</td>
			<td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany</td>
			<td>8177-30-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)</td>
			<td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>221052145</td>
			<td>Used in the cryostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler version 4.2.5</td>
			<td>https://cellprofiler.org/releases/</td>
			<td>Used to analyse the acquired images</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D-8418</td>
			<td>Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic 
			and flammable. Vapors may cause 
			irritation. Manipulate in a fume 
			hood. Avoid direct contact with skin. 
			Wear rubber gloves, protective eye 
			goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice container (styrofoam cooler)</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A26742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish (H 25 mm, &#248; 
			150 mm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Used to weigh the liver after dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel</td>
			<td>DAKO Omnis</td>
			<td>S303023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software, version 9.3.1</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat diet</td>
			<td>Envigo, Barcelona, Spain</td>
			<td>MD.08811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Nimatek&#160; 100 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>791/01/14DFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 75 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope&#160; (QUASAR detection unit; )</td>
			<td>Carl Zeiss, germany</td>
			<td>LSM 710 Axio Observer Z1 microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 15 Sterile carbon steel scalpel 
			Blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)</td>
			<td>&#160;Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td>
			<td>&#160;Used to handle cryosections</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Minipuls 3)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1004170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, 125 mm (5&#34;), No. 3</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining system StainTray</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard diet</td>
			<td>&#160;Mucedola</td>
			<td>4RF21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT mounting media</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides colorimetric assay kit</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10010303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>&#160;TK 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors - 3 mm 
			cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fluorescent-stained lipid droplets with 3d reconstruction for hepatic steatosis assessment

Lipid damlacıkları (LD'ler), lipid depolanmasına aracılık eden ve lipotoksisiteyi baskılamada ve serbest yağ asitlerinin (FA'lar) neden olduğu işlev bozukluğunu önlemede çok önemli bir rol oynayan özel organellerdir. Karaciğer, vücudun yağ metabolizmasındaki kritik rolü göz önüne alındığında, LD'lerin hem mikro-veziküler hem de makroveziküler hepatik steatoz şeklinde hücre içi birikimi ile sürekli tehdit altındadır. LD'lerin histolojik karakterizasyonu tipik olarak Yağ Kırmızısı O (ORO) boyaması gibi lipitte çözünür diazo boyalarına dayanır, ancak bir dizi dezavantaj bu analizin karaciğer örnekleriyle kullanımını sürekli olarak engellemektedir. Daha yakın zamanlarda, lipofilik floroforlar 493/503, nötr lipit damlacık çekirdeğine hızlı alımları ve birikimleri nedeniyle LD'leri görselleştirmek ve bulmak için popüler hale gelmiştir. Çoğu uygulama hücre kültürlerinde iyi tanımlanmış olsa da, doku örneklerinde LD görüntüleme aracı olarak lipofilik florofor problarının güvenilir kullanımını gösteren daha az kanıt vardır. Burada, yüksek yağlı diyet (HFD) kaynaklı hepatik steatozun bir hayvan modelinden karaciğer örneklerinde LD'lerin değerlendirilmesi için optimize edilmiş bir bor dipirometen (BODIPY) 493/503 tabanlı protokol öneriyoruz. Bu protokol karaciğer örneği hazırlama, doku kesitleme, BODIPY 493/503 boyama, görüntü elde etme ve veri analizini kapsamaktadır. HFD beslenmesinde hepatik LD'lerin sayısının, yoğunluğunun, alan oranının ve çapının arttığını gösteriyoruz. Ortogonal projeksiyonlar ve 3D rekonstrüksiyonlar kullanarak, neredeyse küresel damlacıklar olarak görünen LD çekirdeğindeki nötr lipitlerin tam içeriğini gözlemlemek mümkündü. Dahası, florofor BODIPY 493/503 ile, mikro-parçacıkları (1 μm < d ≤ 3 μm), ara vezikülleri (3 μm < d ≤ 9 μm) ve makro-parçacıkları (d > 9 μm) ayırt edebildik ve mikro-veziküler ve makroveziküler steatozun başarılı bir şekilde ayırt edilmesini sağladık. Genel olarak, bu BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol, hepatik LD karakterizasyonu için güvenilir ve basit bir araçtır ve klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.

Lipid droplets (LDs), classically viewed as energy depots, are specialized cellular organelles that mediate lipid storage, and they comprise a hydrophobic neutral lipid core, which mainly contains cholesterol esters and triglycerides (TGs), encapsulated by a phospholipid monolayer1,2,3.
LD biogenesis occurs in the endoplasmic reticulum (ER), starting with the synthesis of triacylglycerol (TAG) and sterol esters. Neutral lipids are diffused between the leaflets of the ER bilayer at low concentrations but coalesce into oil lenses that grow and bud into nearly spherical droplets from ER membrane when their intracellular concentration increases4. Subsequently, proteins from the ER bilayer and cytosol, particularly the perilipin (PLIN) protein family, translocate to the surfaces of the LDs to facilitate budding5,6,7,8,9.
Through new fatty acid synthesis and LD fusion or coalescence, LDs grow into different sizes. Accordingly, the size and number of LDs differ considerably across different cell types. Small droplets (300-800 nm diameter), which are known as initial LDs (iLDs), can be formed by nearly all cells4. Later in LD formation, most cells are able to convert some iLDs into larger ones-expanding LDs (eLDs &#62;1 &#181;m in diameter). Yet, just specific cell types, such as adipocytes and hepatocytes, have the capacity to form giant or supersized LDs (up to tens of microns in diameter)4,10.
LDs play a very important role in the regulation of cellular lipid metabolism, suppressing lipotoxicity, and preventing ER stress, mitochondrial dysfunction, and, ultimately, cell death caused by free fatty acids (FAs)11,12,13,14. Furthermore, LDs have also been implicated in the regulation of gene expression, viral replication protein sequestration, and membrane trafficking and signaling15,16,17. Therefore, the misregulation of LD biogenesis is a hallmark of chronic diseases associated with metabolic syndrome, obesity, type 2 diabetes mellitus (T2DM), and/or arteriosclerosis, to name just a few18,19,20.
The liver, as a metabolic hub, is mostly responsible for lipid metabolism by storing and processing lipids, and, therefore, it is constantly threatened by lipotoxicity21. Hepatic steatosis (HS) is a common feature of a series of progressive liver diseases and is characterized by excessive intracellular lipid accumulation in the form of cytosolic LDs that, ultimately, may lead to liver metabolic dysfunction, inflammation, and advanced forms of nonalcoholic fatty liver disease22,23,24,25. HS occurs when the rate of fatty acid oxidation and export as triglycerides within very low-density lipoproteins (VLDLs) is lower than the rate of hepatic fatty acid uptake from the plasma and de novo fatty acid synthesis26. The hepatic accumulation of lipids often occurs in two forms-microvesicular and macrovesicular steatosis-and these display distinct cytoarchitectonic characteristics27. Typically, microvesicular steatosis is characterized by the presence of small LDs dispersed throughout the hepatocyte with the nucleus placed centrally, whereas macrovesicular steatosis is characterized by the presence of a single large LD that occupies the greater part of the hepatocyte, pushing the nucleus to the periphery28,29. Notably, these two types of steatosis are often found together, and it remains unclear how these two LD patterns influence disease pathogenesis, as evidence is still inconsistent31,32,33,34. Yet, such type of analysis is often employed as a &#34;reference standard&#34; in preclinical and clinical studies to understand the dynamic behavior of LDs and characterize hepatic steatosis29,34,35,36.
Liver biopsies, the gold standard for diagnosing and grading HS, are routinely assessed by histological hematoxylin and eosin (H&#38;E) analysis, where lipid droplets are evaluated as unstained vacuoles in H&#38;E-stained liver sections37. While acceptable for macrovesicular steatosis evaluation, this type of staining generally narrows the assessment of microvesicular steatosis38. Lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO), are classically combined with brightfield microscopy to analyze intracellular lipid stores, but these still have a number of disadvantages: (i) the usage of ethanol or isopropanol in the staining process, which often causes the disruption of the native LDs and occasional fusion despite the cells being fixed39; (ii) the time-consuming nature, as ORO solution requires fresh powder dissolving and filtering due to the limited shelf life, thus contributing to less consistent results; (iii) and the fact that ORO stains more than just lipid droplets and often overestimates hepatic steatosis38.
Consequently, cell-permeable lipophilic fluorophores, such as Nile Red, have been used in either live or fixed samples to overcome some of the aforementioned limitations. However, the non-specific nature of cellular lipid organelle labeling repeatedly narrows LD assessments40. Moreover, the spectral properties of Nile Red vary according to the polarity of the environment, which can often lead to spectral shifts41.
The lipophilic fluorescent probe 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitation wavelength: 480 nm; emission maximum: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibits hydrophobicity characteristics that allow its rapid uptake by intracellular LDs, accumulates in the lipid droplet core, and, subsequently, emits bright green fluorescence12. Unlike Nile Red, BODIPY 493/503 is insensitive to the environment polarity and has been shown to be more selective, as it displays high brightness for LD imaging. In order to stain neutral LDs, this dye can be used in live or fixed cells and successfully coupled with other staining and/or labeling methods42. Another advantage of the dye is that it requires little effort to place into a solution and is stable, thus eliminating the need to freshly prepare it for each experiment42. Even though the BODIPY 493/503 probe has been successfully employed to visualize the localization and dynamics of LDs in cell cultures, some reports have also demonstrated the reliable use of this dye as an LD imaging tool in tissues including the human vastus lateralis muscle43, the rat soleus muscle42, and the mouse intestine44.
Herein, we propose an optimized BODIPY 493/503-based protocol as an alternative analytical approach for the evaluation of the LD number, area, and diameter in liver specimens from an animal model of hepatic steatosis. This procedure covers liver sample preparation, tissue sectioning, staining conditions, image acquisition, and data analysis.

Yazar Spotlight: Hepatik Steatoz Değerlendirmesi için 3D Rekonstrüksiyon ile Floresan Lekeli Lipid Damlacıklarının Analizi  

Hepatik Steatoz Değerlendirmesi için Floresan Boyalı Lipit Damlacıklarının 3D Rekonstrüksiyon ile Analizi

This imaging approach allows the three-dimensional reconstruction of hepatic lipid droplet deposition and overcomes the main disadvantages of classic histological staining that narrowed the successful discrimination between micro and macrovesicular steatosis. The assessment of microvesicular steatosis is when gold-standard histological stainings are used, both and Oil Red, due to disruption and occasional fusion of native lipid droplets. The pro-BODIPY offers an alternative to the routine protocols for microvesicular hepatic steatosis assessment due to its right hydrophobicity for a fast uptake and effective tagging of lipid droplets, being not only insensitive to the environment polarity, but also extremely selective.This imaging approach encloses broader applications in combination with immunochemistry techniques, allowing the simultaneous detection of other subcellular antigens that may advance the study of lipid droplets'biogenesis and dynamics, underpinning micro and macrovesicular hepatic steatosis.

Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması, LD morfolojisinin (3D rekonstrüksiyona dayalı şekil ve lipit çekirdek yoğunluğu) eşzamanlı karakterizasyonu için açık lipit damlacık boyaması ile uzamsal dağılımları, toplam alan başına sayı ve ortalama büyüklükleri (yukarıda tarif edilen boru hattı ile değerlendirilmiştir, Şekil 1) ile sonuçlanmalıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" s...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment at JoVE.com

Burada, karaciğer dokusunda lipid damlacık karakterizasyonu için optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol gösterilmektedir. Ortogonal projeksiyonların ve 3D rekonstrüksiyonların kullanılmasıyla, florofor mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz arasında başarılı bir ayrım yapılmasına izin verir ve hepatik steatoz değerlendirmesi için klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Bu görüntüleme yaklaşımı, hepatik lipid damlacık birikiminin üç boyutlu rekonstrüksiyonuna izin verir ve mikro ve makroveziküler steatoz arasındaki başarılı ayrımı daraltan klasik histolojik boyamanın ana dezavantajlarının üstesinden gelir. Mikro-pasifüler steatozun değerlendirilmesi, doğal lipit damlacıklarının bozulması ve ara sıra füzyonu nedeniyle hem Yağ Kırmızısı hem de altın standart histolojik boyamaların kullanıldığı zamandır. Pro-BODIPY, lipit damlacıklarının hızlı alımı ve etkili bir şekilde etiketlenmesi için doğru hidrofobikliği nedeniyle mikro-veziküler hepatik steatoz değerlendirmesi için rutin protokollere bir alternatif sunar, sadece çevresel polariteye duyarsız değil, aynı zamanda son derece seçicidir.Bu görüntüleme yaklaşımı, immünokimya teknikleriyle kombinasyon halinde daha geniş uygulamaları kapsamakta ve mikro ve makroveziküler hepatik steatozun temelini oluşturan lipit damlacıklarının biyogenezi ve dinamiklerinin çalışmasını ilerletebilecek diğer hücre altı antijenlerin eşzamanlı olarak tespit edilmesini sağlar.

analysis-fluorescent-stained-lipid-droplets-with-3d-reconstruction

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

3.0K Görüntüleme.  University of Coimbra. Bu görüntüleme yaklaşımı, hepatik lipid damlacık birikiminin üç boyutlu rekonstrüksiyonuna izin verir ve mikro ve makroveziküler steatoz arasındaki başarılı ayrımı daraltan klasik histolojik boyamanın ana dezavantajlarının üstesinden gelir. Mikro-pasifüler steatozun değerlendirilmesi, doğal lipit damlacıklarının bozulması ve ara sıra füzyonu nedeniyle hem Yağ Kırmızısı hem de altın standart histolojik boyamaların kullanıldığı zamandır. Pro-BODIPY, lip...

Video: Yazar Spotlight: Hepatik Steatoz Değerlendirmesi için 3D Rekonstrüksiyon ile Floresan Lekeli Lipid Damlacıklarının Analizi  

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Biyokimya

Frozen Liver Tissue Sectioning and BODIPY Staining of Lipid Droplets

Turn on the cryostat and cut 12-micron-thick sections of the frozen liver tissue collected from a rat. Place the sections onto the labeled microscope slides at room temperature. For BODIPY staining, wash the tissue sections thrice with PBS for five minutes each.After the last wash, circle the sections on the slide with a hydrophobic layer using a barrier pen. Prepare a staining solution containing BODIPY 493/503 and DAPI. Then, pipette 75 microliters of the solution onto each slide.Incubate the slides at room temperature for 40 minutes in the dark. Following incubation, wash the slides thrice with PBS for five minutes each. Then, using a fluorescence mounting medium, carefully mount cover slips on each slide.Allow the slides to dry for 30 minutes before sealing the edges with nail polish.

Dondurulmuş Karaciğer Dokusu Kesiti ve Lipid Damlacıklarının BODIPI Boyama

Image Acquisition of Lipid Droplets and Analysis

Turn on the laser scanning confocal microscope and place the slide on the slide holder. For image visualization and acquisition, select the 20X objective lens. From the confocal software, select sequential scan mode to avoid crosstalk between the BODIPY 493/503 and DAPI.Then excite the BODIPY 493/503 die using the 488 nanometer argon laser line and the DAPI stain using the 405 nanometer laser line. Set the emission ranges at 493 to 589 nanometers for BODIPY and 410 to 464 nanometers for DAPI. Next, configure the microscope settings by adjusting frame sizes, scan speed, and averaging which includes number two times bit depth as 12 bits, direction as bidirectional, scan area digital zoom minus one, and pinhole minus one area unit.Adjust the gain and digital gain settings. Ensure there are no saturated pixels as indicated by the range indicator. After accurately identifying the lipid droplets, acquire the image with the BODIPY and DAPI channels.To create wide area images, switch to a 10X subjective lens. Then activate tile scan mode and configure it to generate five by five mosaic images. To generate 3D and orthogonal views, apply a drop of immersion oil on the top of the cover glass and change the objective lens to a 40X lens.Select the Z-stack mode. Adjust the Z-plane to define the first and last positions for image capture, ensuring an optical slice thickness of approximately 0.5 microns to capture all droplets in focus. Select the ortho module and create orthogonal views.Acquire 3D images by selecting the 3D module following transparency rendering mode. After image acquisition, begin processing and analyzing single plane images using CellProfiler. Upload the images in TIF format by clicking on the images mode in the top left corner of the CellProfiler interface.Use the names and types module to sort between BODIPY droplet and DAPI nuclei stained images based on the filenames. For lipid droplet analysis, use only BODIPY stained images. Initiate pipeline construction by clicking on adjust modules and select the color to gray module to convert the images into gray scale.Then using identify primary objects module, define lipid droplets between 6 to 300 pixels and a threshold correction factor of one to detect lipid droplets within the gray scale images. To measure the pixel intensity of the identified lipid droplets, add a measure object intensity module. Incorporate an additional filter objects module to ensure that only the strongest signals are quantified while less intense signals are excluded from the final lipid droplet analysis.Next, to measure the lipid droplets related to the output data, add the measure object size shape module. Then add an overlay outlines module to overlay the identified droplet on the original image and thus ensure that the segmentation looks accurate on the unprocessed image as well. Once done, add an export to spreadsheet module and click on the analyze images button from the bottom left corner.Compared to the control, HFD-fed animals presented a pronounced dyslipidemic profile and subtle increase in circulating triglycerides levels. Wide area images revealed increased lipid droplets across the livers of HFD-fed animals. Analysis with CellProfiler revealed an increased number of hepatic lipid droplets, augmented BODIPY fluorescence intensity, 360%area ratio, and larger diameters.Size distribution in HFD-fed animals revealed an increase in macro vesicular hepatic lipid droplets of more than nine microns and a reduction in microvesicles of less than three microns.