Murine Adipose-Derived Mesenchymal Cell Isolation, Maintenance and Characterization

Bir biyogüvenlik kabininin içinde, murin yağ dokusunu steril forsepslerle çıkarın. Fazla PBS çıkarıldıktan sonra, dokuyu başka bir petri kabına aktarın ve her biri 10 mililitre PBS AA çözeltisi ile beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Bir santimetre kare büyüklüğünde parçalanmış doku ve manyetik bir çubuk içeren bir kristal beher içine 20 mililitre hazırlanmış kollajenaz çözeltisi ekleyin.

Kapalı beheri sürekli ajitasyonla 37 santigrat derecede inkübe edin. Homojenatı 40 örgülü 0,38 milimetre paslanmaz çelik açıklıktan filtreleyin Bir petri kabı üzerinde filtreleyin ve hücre süspansiyonunu steril bir 50 mililitrelik konik tüpte toplayın. Stromal vasküler fraksiyonu 20 mililitre sıcak takviyeli DMEM'de dikkatlice askıya alın ve süspansiyonu santrifüj edin.

Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 40 mililitre takviye edilmemiş DMEM ortamı ile iki kez hafifçe yıkayın. Damakları beş mililitre takviyeli DMEM'de askıya alın. Süspansiyonu 25 santimetrekarelik bir T şişeye aktarın ve inkübe edin.

Hücreleri beş mililitre ılık PBS AA ile üç kez ve takviye edilmemiş DMEM ile iki kez yıkayın. Herhangi bir hücre kalıntılarını ve murin olmayan hücreleri çıkarmak için beş mililitre taze, sıcak takviyeli DMEM ekleyin ve ortamı her üç ila dört günde bir değiştirin. Hücreler% 90 ila% 100 akıcılığa ulaştığında, DMEM ile yıkanmış hücrelere bir mililitre sıcak tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.

37 santigrat derecede beş ila yedi dakika inkübe edin. Ayrılmış hücre tek katmanına dört mililitre takviyeli DMEM ekleyin ve süspansiyonu yavaşça ayırın. Hücreleri beş mililitre sıcak takviyeli DMEM'de askıya alın.

Supernatanı santrifüj edip attıktan sonra, peleti bir mililitre takviyeli DMEM'de yavaşça karıştırın. Hücreleri tripan mavisi ile lekeleyin ve bir Neubauer odasında sayın. T-75 şişelerindeki tohum hücreleri.

Koloni oluşumunu ve yüksek proliferasyonu sağlamak için, hematoksilin ve eosin boyalı hücrelerin morfolojisini optik mikroskop altında gözlemleyin. hematoksilin ve eozin boyaması, uzamış uzamalar ve bol miktarda hücre içi mikrofilament ile geniş sitoplazmayı ortaya koymaktadır.