Yazarlar, Meksika Sosyal Güvenlik Enstitüsü (IMSS) ve Meksika Çocuk Hastanesi, Federico Gomez (HIMFG) ve IMSS Araştırma Koordinasyonu'nun Bioterio personeline bu projenin yürütülmesine verilen destek için minnettardır. AOC (815290) bursu için Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'ne ve görsel-işitsel materyaldeki teknik destek için Antonio Duarte Reyes'e teşekkür ederiz.

Tüm deneysel prosedürler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği'nin (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Meksika) tavsiyelerine dayanarak, Meksika Hayvan Bakımı Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092) Sağlık Araştırmaları Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş, onaylanmış ve tescil edilmiştir.
1. Sıçanlardan yağ dokusunun cerrahi rezeksiyon ile çıkarılması
<ol><li>20 mL steril 1x fosfat tamponlu salin-antibiyotik antimikotik (PBS-AA) çözeltisi (1x PBS, gentamisin [20 μg / mL] ve amfoterisin [0.5 μg / mL]) içeren iki konik tüp hazırlayın ve buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Sağlık durumu iyi olan iki yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanı (R. norvegicus) seçin. Sıçanların 3-4 aylık olduğundan ve 350-450 g koporal ağırlığa sahip olduklarından emin olun.</li>
	<li>20 mg / kg ksilazin hidroklorür ile sedasyona devam edin ve 5 dakika sonra intraperitoneal olarak 120 mg / kg ketamin hidroklorür dozunda bir anestezi uygulayın. Kurumayı önlemek için her iki gözü de oftalmik bir merhemle yağlayın. Ardından, pedal refleksi eksikliği ile anestezi derinliğini onaylayın.</li>
	<li>Karın ve kasık bölgesini iyot çözeltisi ile tıraş edin ve dezenfekte edin. Steriliteyi korumak için cerrahi örtüler uygulayın. Daha sonra, sternumdan testis bölgesine medyan uzunlamasına bir kesi yapın.</li>
	<li>Hem epididimis hem de böbrekleri çevreleyen yağ dokusunu steril forseps ile çıkarın ve 1x PBS-AA çözeltisine yerleştirin. Örnekleri buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Kurumsal kılavuzlara göre gerekirse insizyonu kapalı olarak dikin ve 40 mg / kg sodyum pentobarbital intrakardiyak doz ile hayvanları ötenazi yapın. Ölüm onaylandıktan sonra, kurumsal prosedür (ler) i izleyerek karkası atın. NOT: Ölüm, mezenkimal hücrelerin immünofenotipini, farklılaşma kapasitesini ve parakrin etkisini etkileyen sinyal mekanizmalarını ortaya çıkarır. Bu nedenle, doku toplama ötenaziden önce gerçekleştirilir. </li>
</ol>2. Mezenkimal hücrelerin yağ dokusundan izolasyonu
<ol><li>Bir biyogüvenlik kabini içindeki steril forsepsli yağ dokusunu çıkarın ve fazla PBS'yi emmek için 100 mm çapında bir Petri kabında steril filtre kağıdına yerleştirin.</li>
	<li>Yağ dokusunu başka bir Petri kabına aktarın ve 10 mL'lik bir pipet kullanarak 10 mL 1x PBS-AA çözeltisi ile her biri 5 dakika boyunca üç yıkama gerçekleştirin.</li>
	<li>Makas ve neşter kullanarak dokuyu mekanik olarak yaklaşık 1cm2'lik parçalara ayırın.</li>
	<li>Kollajenaz tip IV'ü (% 0.075), takviye edilmemiş Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) 20 mL'sinde hazırlayın. 0,22 μm şırınga filtresinden süzün ve 37 °C'de tutun.</li>
	<li>Adım 2.4'te hazırlanan kollajenaz çözeltisini (20 mL) parçalanmış doku ve manyetik bir çubukla kristal bir beher içine ekleyin. Kabı kapatın ve 37 ° C'de yavaş ve sürekli ajitasyon altında inkübe edin. NOT: Enzimatik sindirim yaklaşık 90 dakika sürer (hücre zarlarının bütünlüğünü korumak için yavaş karıştırmayı sürdürün).</li>
	<li>Homojenatı 100 mm'lik bir Petri kabı üzerinde paslanmaz çelik, 40 ağ, 0,38 mm diyafram açıklığı filtresinden süzün ve hücre süspansiyonunu steril 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın.</li>
	<li>20 mL ısıtılmış, takviye edilmiş DMEM ekleyin (% 10 fetal sığır serumu [FBS], 2 mM glutamin, 2 mM sodyum piruvat, 100x esansiyel olmayan amino asit çözeltisi ve 100x antibiyotik antimikotik çözeltisi [AA]). Stromal vasküler fraksiyonu (SVE) dikkatlice askıya alın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 290 x g'de santrifüj edin, süpernatantı 25 mL'lik bir pipetle atın ve hücreleri 40 mL'lik takviyesiz bir DMEM ortamıyla nazikçe yıkayın.</li>
	<li>Bu adımı yineleyin. En az miktarda hücresel detritus ve yağ sürüklemek için adımlar arasında yeni bir steril konik tüp kullanın.</li>
	<li>Peletleri 5 mL'lik bir pipetle 5 mL takviyeli DMEM'de askıya alın ve bir T-25cm2 şişeye aktarın. 37 ° C'de 24 saat ve % 5 CO2'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, hücre kalıntılarını ve yapışkan olmayan hücreleri çıkarmak için 5 mL ısıtılmış 1x PBS-AA ile üç yıkama ve takviye edilmemiş DMEM ile iki yıkama gerçekleştirin. 5 mL'lik bir pipetle 5 mL taze, ısıtılmış, takviye edilmiş DMEM ekleyin ve ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.</li>
</ol>3. ASC birincil kültürlerinin korunması ve genişletilmesi
<ol><li>Hücreler% 90 -% 100 birleşmeye ulaştığında (8 ± 2 gün), 5 mL takviye edilmemiş DMEM ile iki kez yıkayın. 1 mL ısıtılmış% 0.025 Tripsin-2 mM Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 37 ° C'de 5-7 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücre tek katmanı ayrıldığında, 4 mL takviyeli DMEM ekleyin ve hücre süspansiyonunu yavaşça ayrıştırın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın, 5 mL ısıtılmış, takviye edilmiş DMEM ekleyin ve homojenize etmek için hafifçe askıya alın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 290 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve peleti 1 mL takviyeli DMEM içinde yavaşça karıştırın. Trypan mavisi ile boyandıktan sonra Neubauer odasındaki hücreleri sayın.</li>
	<li>Son olarak, T-75 şişelerinde 1:4 bölünmüş oranda 2,5 x 103 hücre/cm2 tohumlayın. Bu adım koloni oluşumunu ve yüksek çoğalma oranını sağlar.</li>
</ol>4. ASC primer kültürlerinin morfoloji karakterizasyonu
<ol><li>ASC'lerin morfolojisini ters mikroskopi altında gözlemleyin. NOT: Histoloji ve ASC tanımlaması için montajdan önce, kapaklara %1'lik bir jelatin çözeltisi uygulayın. 15 dakika boyunca UV ile ışınlayın.<ol><li>Kapak kapaklarını %70 etanol çözeltisinden çıkarın ve 5 dakika kurumasını bekleyin.</li>
		<li>Kapakları steril %1 jelatin çözeltisine batırın, boşaltın ve oda sıcaklığında (RT) kurutun.</li>
		<li>Her bir kapak kaymasını 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirin ve plakaları 15 dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın.</li>
		<li>Kuyunun ortasına 25 x 103 hücre içeren bir damla tohumlayın, 1 dakika bekleyin ve 1 mL takviyeli DMEM ortamı ekleyin. 37 ° C'de 96 saat ve % 5 CO2'de inkübe edin.</li>
		<li>Ortamı çıkarın ve bir transfer pipeti kullanarak 1x PBS-AA ile üç yıkama gerçekleştirin.</li>
		<li>Her bir kuyucuğa 1 mL% 3.5 nötr formalin ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Kurumasını önlemek için plakayı kullanana kadar parafilmle kapatın. NOT: ASC'lerin hücresel morfolojisi, farklı pasajlar sırasında hematoksilin-eozin boyaması ile de değerlendirilir.</li>
		<li>% 70 etanol'ü her bir kuyudan çıkarın ve hücreleri damıtılmış suyla 5 dakika nemlendirin. Bu arada, boyama çözeltilerini filtreleyin.</li>
		<li>Suyu çıkarın ve Harris'in hematoksilin çözeltisi ile 15 dakika boyunca yavaş ajitasyon altında hücreleri lekeleyin.</li>
		<li>Boyama solüsyonunu çıkarın ve 1x PBS ile iki yıkama yapın.</li>
		<li>Hücreleri 1 dakika boyunca yavaş ajitasyon altında eozin çözeltisi ile lekeleyin. Ardından, çözeltiyi çıkarın ve 1x PBS ile iki yıkama yapın.</li>
		<li>Kapak kapaklarını her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve slaytları bir damla PBS-gliserol montaj çözeltisi (1: 1 v / v) üzerine monte edin.</li>
		<li>Kapak kaymasının etrafına bir tırnak verniği çizgisi yerleştirin ve ışık mikroskobu altında histolojik slaytları gözlemleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>5. ASC'lerin immünofloresan ile ekspresyon belirteçleri
<ol><li>1x PBS-0.05% Tween 20 içeren yıkama tamponunu hazırlayın. Yıkamaları RT'de ve yavaş çalkalayarak gerçekleştirin. Plakaları 2 mL tampon / kuyu ile üç kez yıkayın (her yıkama için 3 dakika inkübe edin).</li>
	<li>1 mL bloke edici reaktif (1:10) yerleştirin ve 20 dakika boyunca yavaş ajitasyonla inkübe edin.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa aşağıdaki birincil antikorlardan 200 μL (1:50 seyreltme) ekleyin: CD9 (monoklonal fare), CD34 (poliklonal tavşan) ve anti-CD63 (poliklonal keçi). Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Plakaları üç kez tekrar yıkayın ve aşağıdaki ikincil antikorların 200 μL (1:50 seyreltmesi) ile inkübe edin: anti fare IgG FITC konjuge keçi, eşek anti-keçi IgG DyeLight 550 ve keçi anti tavşan IgG Cy3.</li>
	<li>1x PBS-0.05% Tween 20 ile üç kez yıkayın ve hücre çekirdeklerini 20 dakika boyunca 100 μL DRAQ-7 (seyreltme: 1 mL çift damıtılmış suda 17 μL) ile karşı boyayın.</li>
	<li>Üç kez daha yıkayın ve slaytları 4.1.12-4.1.13 adımlarına göre monte edin. Işıktan korunan ve dondurulan numuneleri kullanıma kadar saklayın.</li>
	<li>Bu ekipman için önerilen uygun ayarları ve yazılımı kullanarak numuneleri epifloresan konfokal mikroskopi altında görselleştirin.</li>
</ol>6. ASC'lerin akış sitometrisi ile ekspresyon belirteçleri
<ol><li>Tripsinize edilmiş veya çözülmüş hücrelerden (alt pasajlar 3 veya 4) tek bir hücre süspansiyonunu, 1 x 106 hücre / mL'lik 1x PBS-5% FBS konsantrasyonunda ayarlayın. Aliquot 100 μL, 1.5 mL santrifüj tüplerinde 100.000 hücreli. Otomatik floresan kontrolü için etiketleme yapmadan bir aliquot kullanın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre tüm uygun miktarlarda Anti-CD105 AF-594 ve Anti-CD31 AF-680'i dinlenmeye ekleyin. Karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Fazla lekeyi 1 mL 1x PBS-5% FBS ile 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleme ile yıkayın ve 300 μL% 1 formalin içinde askıya alın.</li>
	<li>Bir akış sitometresinde numune alımı gerçekleştirin. Hücrelerin geçit stratejisi, FSC-A ve SSC-A geçidine, SSC-H ve SSC-A kullanılarak kapılı tek hücrelere ve ardından FSC-A'ya karşı FSC-H'ye dayanmaktadır.</li>
	<li>CD105 AF-594 için Y610-mCherry-A dedektörü ve CD31 AF-680 için R660-APC-A dedektörü kullanın.</li>
</ol>7. ASC'lerin adipojenik soya farklılaşması
<ol><li>6 delikli bir plakada, cm2 başına 1 x 10 4 hücre (P-4 ) tohumlayın ve% 60-80 birleşime (~72-96 saat) kadar 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin. Doğrudan kültür ortamına uygulayarak farklılaşmayı indükleyin: 4 μM insülin, 1 μM deksametazon 21-asetat (Dxa) ve 0.5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (MIX). Farklılaştırma ortamını her 2-3 günde bir değiştirin.</li>
	<li>2 mL steril ultra saf suda 800 μM insülin stok çözeltisi hazırlayın (tam çözünmeyi sağlamak için 20 μL 1 N HCl ekleyin) ve -20 ° C'de saklayın. Daha önce 1:100 oranında seyreltilmiş 10 μL insülin stoğu ekleyin ve kuyucuk başına 2 mL'lik son hacimde 10 μL uygulayın.</li>
	<li>5 mL steril ultra saf suda 1 mM Dxa'lık bir stok çözeltisi hazırlayın (tam çözünmenin gerçekleşmediğini unutmayın). 4 °C'de saklayın. Dxa stoğunun 1:4 seyreltmesinden 40 μL/kuyu ekleyin.</li>
	<li>2,5 mL 0,1 N NaOH, vorteks içinde 100 mM'lik bir MIX stoğu hazırlayın ve tam çözünme için 40 μL 1 N NaOH ekleyin. -70 °C'de saklayın. 10 μL/kuyu MIX stoğu ekleyin.</li>
	<li>Stok çözeltilerini depolamadan önce 0,22 μm steril şırınga filtresinden geçirin.</li>
	<li>12. günde, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve RT'de 1 saat boyunca 500 μL% 4 formalin ile inkübe edin. Her bir kuyuyu damıtılmış suyla iki kez yıkayın, ardından 5 dakika boyunca% 60 izopropanol ile yıkayın ve kurumaya bırakın.</li>
	<li>% 60 izopropanol (500 μL / kuyu) içinde seyreltilmiş% 0.5 yağ kırmızısı O ekleyin ve RT'de 20 dakika inkübe edin. NOT: Gerekli reaktifler, ekipman ve malzemeler için Malzeme Tablosuna bakın.</li>
</ol>

Yağ Dokusu Kaynaklı Kök Hücre İzolasyonu ve Karakterizasyonu

<ol>
	<li>Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+\anatomic+site+and+age+on+the+replication+and+differentiation+of+rat+adipocyte+precursors+in+culture.">Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).</li><li>Greenwood, M. R., Hirsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+adipocyte+cellularity+in+the+normal+rat.">Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat.</a> Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).</li><li>Gonz&#225;lez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).</li><li>Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+yield+and+growth+characteristics+are+affected+by+the+tissue-harvesting+procedure.">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure.</a> Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells:+enzymatic+digestion+in+combination+with+mechanical+distortion+to+increase+adipose+tissue-derived+stem+cell+yield+from+human+aspirated+fat.">Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).</li><li>Gittel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+equine+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+by+enzymatic+tissue+digestion+or+explant+technique:+comparison+of+cellular+properties.">Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties.</a> BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).</li><li>Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization+and+growth+kinetic+comparison+of+bone+marrow+and+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+of+guinea+pig.">Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig.</a> International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).</li><li>Jurgens, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+tissue-harvesting+site+on+yield+of+stem+cells+derived+from+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).</li><li>Secunda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+bone+marrow,+adipose+tissue,+umbilical+cord+blood+and+matrix:+a+comparative+study.">Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study.</a> Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).</li><li>Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+from+rat+visceral+fat+exhibit+multipotential+differentiation+in+vitro.">Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-assisted+lipotransfer+for+cosmetic+breast+augmentation:+supportive+use+of+adipose-derived+stem/stromal+cells.">Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).</li><li>Si, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+Sources,+potency,+and+implications+for+regenerative+therapies.">Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).</li><li>Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perirenal+adipose+tissue+inflammation:+Novel+insights+linking+metabolic+dysfunction+to+renal+diseases.">Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).</li><li>Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perirenal+fat:+A+unique+fat+pad+and+potential+target+for+cardiovascular+disease.">Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease.</a> Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).</li><li>Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+adipose+tissue-derived+stem+cells+into+cells+with+pancreatic+phenotype+by+regenerating+pancreas+extract.">In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).</li><li>Chandra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-like+cell+aggregates+generated+from+human+adipose+tissue+derived+stem+cells+ameliorate+experimental+diabetes+in+mice.">Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice.</a> PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+insulin+sensitivity+and+reversal+of+age-dependent+glucose+intolerance+with+inhibition+of+ASIC3.">Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).</li><li>Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+stem+cells+for+cell+therapy+of+airway+allergic+diseases+in+mouse.">Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse.</a> Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).</li><li>Haasters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immunocytochemical+characteristics+indicate+the+yield+of+early+progenitors+and+represent+a+quality+control+for+human+mesenchymal+stem+cell+culturing.">Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing.</a> Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+pig+adipose-derived+progenitor+cells.">Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells.</a> Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).</li><li>Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypical+and+functional+characterization+of+freshly+isolated+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells.</a> Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolation,+characterization+and+expansion+of+human+adipose-derived+stem+cells+(ASCs):+An+overview.">Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).</li><li>Yu, B., Zhang, X., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+mesenchymal+stem+cells.">Exosomes derived from mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).</li><li>Maumus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+human+adipose+stromal+cells:+localization,+morphology,+and+phenotype.">Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype.</a> International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).</li><li>Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+primary+isolation+and+culture+of+adipose-derived+stem+cells+and+their+phenotypic+profile.">A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile.</a> Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).</li><li>He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mesenchymal+stem+cells+from+rat+bone+marrow+and+adipose+tissue.">Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue.</a> Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

MSC'lerin keşfinden bu yana geçen kırk yılda, birkaç araştırmacı grubu, MSC'leri farklı doku ve türlerden elde etmek için prosedürleri tanımlamıştır. Sıçanları bir hayvan modeli olarak kullanmanın avantajlarından biri, kolay bakım ve hızlı gelişimlerinin yanı sıra MSC'leri yağ dokusundan elde etmenin kolaylığıdır. ASC'lerin elde edilmesi için viseral, perirenal, epididim ve subkutan yağ 12,13,14,15,16 gibi farklı doku kaynakları tanımlanmıştır.<su...

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), kendini yenileme, çoğalma, göç etme ve farklı hücre soylarına farklılaşma konusundaki yüksek kapasiteleri nedeniyle rejeneratif tıbbı güçlü bir şekilde etkilemiştir 1,2. Şu anda, çok sayıda araştırma, çeşitli hastalıkların tedavisi ve teşhisi için potansiyellerine odaklanmaktadır.
Farklı mezenkimal hücre kaynakları vardır: kemik iliği, iskelet kası, amniyotik sıvı, saç kökleri, plasenta ve yağ dokusu, diğerleri arasında. İnsanlar, fareler, sıçanlar, köpekler ve atlar dahil olmak üzere farklı türlerden elde edilirler3. Kemik iliği kaynaklı MSC'ler (BMSC'ler) uzun yıllardır rejeneratif tıpta önemli bir kök hücre kaynağı olarak ve embriyonik kök hücrelerin kullanımına alternatif olarak kullanılmaktadır4. Ancak adipoz kaynaklı MSC'ler veya adipoz kaynaklı kök hücreler (ASC'ler), toplanma ve izolasyon kolaylığının yanı sıra gram yağ dokusu başına elde edilen hücre verimi 5,6 nedeniyle büyük avantajlara sahip önemli bir alternatiftir. ASC'lerin hasat oranının genellikle BMSC'lerinkinden daha yüksek olduğu bildirilmiştir7. Başlangıçta, ASC'lerin onarıcı / rejeneratif kapasitesinin, diğer hücre soylarına farklılaşma yeteneklerinden kaynaklandığı öne sürülmüştür8. Bununla birlikte, son yıllarda yapılan araştırmalar, ASC'ler tarafından salınan parakrin faktörlerin onarıcı potansiyellerinde birincil rolünü güçlendirmiştir 9,10.
Yağ dokusu (AT), bir enerji rezervi olmasının yanı sıra, endokrin, sinir ve kardiyovasküler sistemlerle etkileşime girer. Ayrıca doğum sonrası büyüme ve gelişme, doku homeostazının korunması, doku onarımı ve yenilenmesinde rol oynar. AT, adipositler, vasküler düz kas hücreleri, endotel hücreleri, fibroblastlar, monositler, makrofajlar, lenfositler, preadipositler ve ASC'lerden oluşur. İkincisi, düşük immünojeniteleri nedeniyle rejeneratif tıpta önemli bir role sahiptir11,12. ASC'ler enzimatik sindirim ve mekanik işlemle veya yağ dokusu eksplantları ile elde edilebilir. ASC'lerin birincil kültürlerinin bakımı, büyümesi ve genişletilmesi kolaydır. ASC'lerin fenotipik karakterizasyonu, immünofloresan ve akış sitometrisi13 gibi yöntemleri kullanarak spesifik membran belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirerek hücrelerin kimliğini doğrulamak için gereklidir. Uluslararası Yağ Tedavisi ve Bilim Federasyonu (IFATS) ve Uluslararası Hücresel Terapi Derneği (ISCT), ASC'lerin CD73, CD90 ve CD105'i ifade ettiğini, ancak CD11b, CD14, CD19, CD45 ve HLA-DR14 ifadesinden yoksun olduğunu tanımlamıştır. Bu nedenle, hem pozitif hem de negatif olan bu belirteçler, ASC'lerin karakterizasyonu için güvenilir kabul edilir.
Bu proje, sıçanların AT'sinden ekstrakte edilen yetişkin mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve tanımlanması için bir prosedürün tanımlanmasına odaklanmıştır, çünkü bu hücre kaynağı, embriyonik kök hücrelerin aksine, etik zorluklar sunmamaktadır. Bu, kemik iliği kaynaklı kök hücrelere kıyasla erişim kolaylığı ve minimal invaziv yöntem nedeniyle prosedürü uygulanabilir bir seçenek olarak sağlamlaştırır. 
Bu doku kaynağından elde edilen mezenkimal hücreler, immünomodülatör yetenekleri ve düşük immün rejeksiyonları nedeniyle rejeneratif tıpta önemli bir role sahiptir. Bu nedenle, bu çalışma, sekretomları ve diyabet gibi metabolik hastalıklar da dahil olmak üzere farklı hastalıklarda rejeneratif tedavi olarak uygulamaları ile ilgili gelecekteki araştırmaların temel bir parçasıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30078.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>AX224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti- CD9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-13118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-CD34 (C-18)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-7045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-C63</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-18838A594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-18916AF680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 </td>
			<td>Novus</td>
			<td>NB 120-6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA5-10087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab&#180;)</td>
			<td>RD Systems.</td>
			<td>No. F103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Filter Sterile</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>10718003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and Tissue Culture Flasks</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>170718-312B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides</td>
			<td>SIGMA Aldrich </td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell wells: 6 well with Lid</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge conical tubes</td>
			<td>HeTTICH</td>
			<td>ROTANA460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge eppendorf tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>M0018242_44797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV </td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>SPL Life Science</td>
			<td>43112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytExpert 2.0</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Free version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFlex LX cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>FLOW-2463VID03.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td> 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DraQ7 Dye</td>
			<td>Thermo Sc. </td>
			<td>D15106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin yellowish</td>
			<td>Hycel</td>
			<td>300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Baker</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum </td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>128111163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin-High Purity</td>
			<td>Herschi Trading </td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>AMRESCO </td>
			<td>0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator </td>
			<td>Thermo Sc.</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)</td>
			<td>Aranda</td>
			<td>SV057430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine </td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc. </td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM software Zen 2009 V5.5</td>
			<td></td>
			<td>Free version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>12082100801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope </td>
			<td>Zeiss Axiovert 100M</td>
			<td>21.0028.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Olympus CK40</td>
			<td>CK40-G100 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 mL </td>
			<td>Sarstedt </td>
			<td>72695400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 mL</td>
			<td>Sarstedt </td>
			<td>72706400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 0.2-2 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>E97743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 2-20 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>F54167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 20-200 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>G32419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>FJ39895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tank liquid</td>
			<td>Taylor-Wharton</td>
			<td>681-021-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>SLBC3029V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin </td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc. </td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Cell culture</td>
			<td>CORNING Inc</td>
			<td>480167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-03-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pisabental (pentobarbital sodium)</td>
			<td>PISA Agropecuaria</td>
			<td>Q-7833-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride </td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>2139900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 Pipette Fillers</td>
			<td>Thermo Sc</td>
			<td>9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>L010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>L010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride </td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>15368426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td>11840-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Sterile</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>431222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer Lambda 25</td>
			<td>L6020060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titer plate shaker</td>
			<td>LAB-LINE</td>
			<td>1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Samco/Thermo Sc</td>
			<td>728NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1198566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin From Porcine Pancreas</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>102H0234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Blocking Reagent 10x</td>
			<td>BioGenex</td>
			<td>HK085-GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)</td>
			<td>Pet&#39;s Pharma</td>
			<td>Q-7972-025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue of sprague dawley rats

Yetişkin mezenkimal hücreler son yıllarda moleküler ve hücre biyolojisinde devrim yaratmıştır. Kendini yenileme, göç etme ve çoğalma konusundaki büyük kapasitelerine ek olarak, farklı uzmanlaşmış hücre tiplerine farklılaşabilirler. Yağ dokusu, mezenkimal hücrelerin en az invaziv ve en erişilebilir kaynaklarından biridir. Ayrıca diğer kaynaklara kıyasla daha yüksek verime ve üstün immünomodülatör özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir. Son zamanlarda, farklı doku kaynaklarından ve hayvan türlerinden yetişkin mezenkimal hücrelerin elde edilmesi için farklı prosedürler yayınlanmıştır. Bazı yazarların kriterlerini değerlendirdikten sonra, farklı amaçlara uygulanabilir ve kolayca tekrarlanabilir bir metodolojiyi standartlaştırdık. Perirenal ve epididim yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyon (SVF) havuzu, optimal morfoloji ve işlevselliğe sahip primer kültürler geliştirmemizi sağladı. Hücrelerin 24 saat boyunca plastik yüzeye yapıştığı gözlendi ve uzamalar ve koloniler oluşturma eğilimi ile fibroblast benzeri bir morfoloji sergiledi. CD105, CD9, CD63, CD31 ve CD34 membran belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için akım sitometrisi (FC) ve immünofloresan (IF) teknikleri kullanıldı. Adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) adipojenik soya farklılaşma kabiliyeti de bir faktör kokteyli (4 μM insülin, 0.5 mM 3-metil-izo-bütil-ksantin ve 1 μM deksametazon) kullanılarak değerlendirildi. 48 saat sonra, fibroblastoid morfolojide kademeli bir kayıp gözlendi ve 12 günde, yağ kırmızısı lekelenmesine pozitif lipit damlacıklarının varlığı doğrulandı. Özetle, rejeneratif tıpta uygulama için optimal ve fonksiyonel ASC kültürlerinin elde edilmesi için bir prosedür önerilmektedir.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have strongly impacted regenerative medicine due to their high capacity for self-renewal, proliferation, migration, and differentiation into different cell lineages1,2. Currently, a great deal of research is focusing on their potential for the treatment and diagnosis of various diseases.
There are different sources of mesenchymal cells: bone marrow, skeletal muscle, amniotic fluid, hair follicles, placenta, and adipose tissue, among others. They are obtained from different species, including humans, mice, rats, dogs, and horses3. Bone marrow-derived MSCs (BMSCs) have been used for many years as a major source of stem cells in regenerative medicine and as an alternative to the use of embryonic stem cells4. However, adipose-derived MSCs, or adipose-derived stem cells (ASCs), are an important alternative with great advantages due to their ease of collection and isolation, as well as the yield of cells obtained per gram of adipose tissue5,6. It has been reported that the harvest rate of ASCs is generally higher than that of BMSCs7. It was initially proposed that the reparative/regenerative capacity of ASCs was due to their ability to differentiate into other cell lineages8. However, research in recent years has reinforced the primary role of paracrine factors released by ASCs in their reparative potential9,10.
Adipose tissue (AT), in addition to being an energy reserve, interacts with the endocrine, nervous, and cardiovascular systems. It is also involved in postnatal growth and development, the maintenance of tissue homeostasis, tissue repair, and regeneration. The AT is composed of adipocytes, vascular smooth muscle cells, endothelial cells, fibroblasts, monocytes, macrophages, lymphocytes, preadipocytes, and ASCs. The latter possess an important role in regenerative medicine due to their low immunogenicity11,12. ASCs can be obtained by enzymatic digestion and mechanical processing or by adipose tissue explants. Primary cultures of ASCs are easy to maintain, grow, and expand. Phenotypic characterization of ASCs is essential to verify the identity of the cells by assessing the expression of specific membrane markers using methods such as immunofluorescence and flow cytometry13. The International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT) have defined that ASCs express CD73, CD90, and CD105, while lacking the expression of CD11b, CD14, CD19, CD45, and HLA-DR14. These markers, both positive and negative, are therefore considered reliable for the characterization of ASCs.
This project was focused on describing a procedure for the isolation and identification of adult mesenchymal cells extracted from rats' AT, as this source of cells does not present ethical challenges, unlike embryonic stem cells. This solidifies the procedure as a viable option because of the ease of access and minimally invasive method compared to bone marrow-derived stem cells. 
Mesenchymal cells from this tissue source have an important role in regenerative medicine because of their immunomodulatory capabilities and low immune rejection. Therefore, the present study is a fundamental part of future research into their secretome and their application as regenerative therapy in different diseases, including metabolic diseases such as diabetes.

Yazar Spotlight: Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Türetilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması  

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Mesenchymal stem cells have a really broad role in cellular communication due to their paracrine function. This protocol obtains adipose-derived mesenchymal stem cells with morphological, immunophenotypical, and adequate functionality for use in studying therapies for pancreatic regeneration and diabetes. There has been increased use of cell therapies in the treatment of diabetes.These therapies include allogenic transplants of pancreatic cells, autologous stem cell-derived products of insulin-producing cells, and 3D-printed pancreatic tissue using biological inks. Most research primarily studied the secretome components and the role in the regulation of different cellular processes. New techniques like microarrays and next-generation sequencing can investigate the function of miRNAs.A challenge in this area is to achieve greater stimulation of mesenchymal cells, reaching precise molecular composition in the secretome, and directing it to the treatment of a specific conditions. We will be evaluating how an miRNAs contribute to pancreatic tissue degeneration exposed to oxidative stress. The study will involve usage of stem cells from adipose tissue.

Yağ dokusu, 3-4 aylık ve vücut ağırlığı 401 ± 41 g (geometrik ortalama ± SD) olan yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından elde edildi. Ortalama 3.8 g epididim ve perirenal yağ dokusu değeri, 15 deneysel ekstraksiyonun analizine karşılık geldi. 24 saatlik kültürden sonra, hücre popülasyonları plastik yüzeye yapışmış kaldı ve heterojen bir morfoloji sergiledi. İlk pasaj, toplam sekiz deneyde 1.4 ± 0.6 x 106 hücre verimi ile 8 ± 2 günde gerçekleştirildi. Doğrudan parlak alan g?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats at JoVE.com

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Mezenkimal kök hücreler, parakrin fonksiyonları nedeniyle hücresel iletişimde gerçekten geniş bir role sahiptir. Bu protokol, pankreas rejenerasyonu ve diyabet tedavilerinin incelenmesinde kullanılmak üzere morfolojik, immünofenotipik ve yeterli işlevselliğe sahip adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücreler elde eder. Diyabet tedavisinde hücre tedavilerinin kullanımı artmıştır.Bu tedaviler, pankreas hücrelerinin allojenik nakillerini, insülin üreten hücrelerin otolog kök hücre türevi ürünlerini ve biyolojik mürekkepler kullanılarak 3D baskılı pankreas dokusunu içerir. Çoğu araştırma öncelikle sekretom bileşenlerini ve farklı hücresel süreçlerin düzenlenmesindeki rolünü inceledi. Mikrodiziler ve yeni nesil dizileme gibi yeni teknikler miRNA'ların işlevini araştırabilir.Bu alandaki bir zorluk, mezenkimal hücrelerin daha fazla uyarılmasını sağlamak, sekretomda kesin moleküler bileşime ulaşmak ve onu belirli bir durumun tedavisine yönlendirmektir. Bir miRNA'nın oksidatif strese maruz kalan pankreas dokusu dejenerasyonuna nasıl katkıda bulunduğunu değerlendireceğiz. Çalışma, yağ dokusundan kök hücrelerin kullanımını içerecektir.

isolation-identification-mesenchymal-stem-cells-derived-from-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

1.9K Görüntüleme.  Universidad Autónoma Metropolitana. Mezenkimal kök hücreler, parakrin fonksiyonları nedeniyle hücresel iletişimde gerçekten geniş bir role sahiptir. Bu protokol, pankreas rejenerasyonu ve diyabet tedavilerinin incelenmesinde kullanılmak üzere morfolojik, immünofenotipik ve yeterli işlevselliğe sahip adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücreler elde eder. Diyabet tedavisinde hücre tedavilerinin kullanımı artmıştır.Bu tedaviler, pankreas hücrelerinin allojenik nakillerini, insülin üreten hücrelerin otol...

Video: Yazar Spotlight: Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Türetilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması  

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

Biyoloji

Murine Adipose Tissue Excision

Shave the abdominal and inguinal regions of two sedated adult male Sprague Dawley rats. Disinfect the shaved regions with an iodine solution. Make a medial longitudinal incision from the sternum to the testicular region, Using a pair of sterile forceps, remove the adipose tissue from the epididymidis and the kidneys.Place the tissue in conical tubes containing 20 milliliters of cold, sterile PBS-AA solution.

Murin Yağ Dokusu Eksizyonu

Murine Adipose-Derived Mesenchymal Cell Isolation, Maintenance and Characterization

Inside a biosafety cabinet, remove the murine adipose tissue with sterile forceps. Once excess PBS is removed, transfer the tissue to another petri dish and wash twice for five minutes each with 10 milliliters of PBS AA solution. Add 20 milliliters of prepared collagenase solution into a crystal beaker containing one square centimeter sized fragmented tissue and a magnetic bar.Incubate the sealed beaker at 37 degrees Celsius with continuous agitation. Filter the homogenate through a 40-mesh 0.38-millimeter stainless steel aperture Filter on a petri dish and collect the cell suspension in a sterile 50-milliliter conical tube. Carefully suspend the stromal vascular fraction in 20 milliliters of warm supplemented DMEM and centrifuge the suspension.After discarding the supernatant, gently wash the cells twice with 40 milliliters of non-supplemented DMEM medium. Suspend the palate in five milliliters of supplemented DMEM. Transfer the suspension to a 25-square centimeter T bottle and incubate.Wash cells three times with five milliliters of warm PBS AA and twice with non-supplemented DMEM. To remove any cell debris and non-murine cells add five milliliters of fresh, warm supplemented DMEM and change the medium every three to four days. Once the cells reach 90 to 100%confluency, add one milliliter of warm trypsin EDTA solution to the DMEM washed cells.Incubate for five to seven minutes at 37 degrees Celsius. Add four milliliters of supplemented DMEM to the detached cell monolayer and gently disaggregate the suspension. Suspend the cells in five milliliters of warm supplemented DMEM.After centrifuging and discarding the supernatant, gently mix the pellet in one milliliter of supplemented DMEM. Stain the cells with trypan blue and count them in a Neubauer chamber. Seed cells in T-75 flasks.To ensure colony formation and high proliferation, observe the morphology of the hematoxylin and eosin-stained cells under an optical microscope. hematoxylin and eosin staining reveal extensive cytoplasm with elongated prolongations and abundant intracellular microfilaments.

Murin Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Hücre İzolasyonu, Bakımı ve Karakterizasyonu

Immunofluorescent Detection of Adipose-Derived Stem Cell Expression Markers

Begin by washing murine adipose-derived stem cells in a six-well plate with two milliliters of wash buffer. Add one milliliter of blocking reagent after incubating and washing the cells thrice. Incubate the cells with slow agitation for 20 minutes.Add 200 microliters of the primary antibodies to each well and incubate overnight at four degrees Celsius. After washing the plates thrice as demonstrated previously, incubate with 200 microliters of the secondary antibodies. Counterstain the cell nuclei with 100 microliters of DRAQ7 for 20 minutes after washing the plates thrice.Repeat washing and mount slides. Visualize the mounted slides under epifluorescence confocal microscopy. Adipose-derived stem cells were 100%positive for CD9 surface markers in all subpassages tested.All cells expressed CD63 markers in the subpassages one, three and nine, while 49.3%of the cells expressed it in passage seven. CD34 markers were absent in passages one, seven, and nine, but visible in passage three.

Adipoz Kaynaklı Kök Hücre Ekspresyon Belirteçlerinin İmmünofloresan Tespiti

Flow Cytometric Detection of Adipose-Derived Stem Cell Expression Markers

Begin by adjusting the concentration of thawed murine adipose-derived stem cell suspension using PBS with 5%fetal bovine serum. Aliquot 100 microliters of the suspension containing 100, 000 cells into a 1.5 milliliter centrifuge tube. Add appropriate amounts of anti-CD105 AF594 and anti-CD31 AF680 as per the manufacturer's instructions.Incubate for 20 minutes in the dark at four degrees Celsius. Remove excess stain by washing with PBS/FBS and centrifuge at 250 x g for five minutes. Resuspend the cells in 300 microliters of 1%formalin.Create a dot plot graph by clicking on the polygon symbol to select the subpopulation of interest and exclude the debris areas using FSC-A versus SSC-A gating. Next, click on the polygon symbol to generate a new dot plot and exclude the duplexes and multiples cells using SSC-H versus SSC-A followed by FSC-H and FSC-A. Use Y610-mCHERRY for the AF594 and the R660 APC-A detectors for the AF680 fluorophores, respectively.Click on the quadrant symbol and set each detector's threshold for autofluorescence cells. Select samples labeled with CD105 and positive population to be shown on Q1LR. Next, choose samples labeled with CD31 and positive population to be shown on Q1LR.Immunophenotyping showed that 98.7%of the cell population was positive for CD105, while only 5.88%expressed the CD31 marker.

Yağ Kaynaklı Kök Hücre Ekspresyon Belirteçlerinin Akış Sitometrik Tespiti

Adipose-Derived Stem Cell Differentiation to the Adipogenic Lineage

Begin by seeding a six well plate with 10, 000 adipose-derived stem cells per square centimeter. Once cells become 60 to 80%confluent add the differentiation medium. On day 12, wash the cells trice with PBS and incubate them with 500 microliters of 4%formalin for one hour at room temperature.Once the cells are washed with distilled water, wash them with 60%isopropanol for five minutes and let them dry. Add 500 microliters of 0.5%oil red O staining dye diluted in 60%alcohol. After incubation at room temperature wash the wells twice with one milliliter of distilled water and observe the plate under an inverted microscope.Adipose-derived stem cells differentiated towards the adipogenic lineage showing reduced cell size and rounded shape within 48 hours. After seven days, lipid vesicles were visible, which were positive for oil red staining 12 days after differentiation.