Yedi ila sekiz haftalık ötenazi yapılmış bir erkek fareyi temiz bir tezgah yüzeyine yerleştirerek başlayın. Farenin karın derisini alt karın bölgesine doğru bir çift makasla kesin. Yağ dokusunu iç uyluklardan çıkarın.
Eksize edilen dokuyu, FBS veya antibiyotik olmadan 2.5 mililitre D, R, A enzimi ve 2.35 mililitre DMEM / F12 enzim karışımı içeren buz üzerindeki tüp C'ye yerleştirin. Makas kullanarak, yağ dokusunu yaklaşık iki milimetre kare büyüklüğünde parçalara ayırın. C tüpünün kapağını sıkıca kapatın ve tüpü ters çevirin.
Tüpü bir doku ayrıştırıcısının manşonuna takın ve örnekleri 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede sindirin. Ardından, FBS ve antibiyotik içeren DMEM / F12 ortamını 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. İnkübasyondan sonra, C tüpünü doku ayrıştırıcısından çıkarın ve FBS ve antibiyotiklerle beş mililitre DMEM / F12 ekleyerek sindirimi durdurun.
Dört kez hafifçe pipet yapın. Süspansiyonu 700 g'da 20 santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre paletini bozmadan, süpernatanı dikkatlice aspire edin.
Peleti FBS ve antibiyotik içeren 10 mililitre DMEM/F12 içinde tekrar askıya alın ve beş kez hafifçe pipet yapın. Hücre süspansiyonunu, 50 mililitrelik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 70 mikron çapında bir hücre süzgecinden geçirin. Filtratı beş dakika boyunca 250 g'da santrifüj edin.
Peletleri 10 mililitre PBS'de tekrar askıya alın. Kaplamadan önce, hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj edin. Supernatan'ı atın.
Pelet, FBS ve antibiyotik içeren 10 mililitre DMEM / F12'de tekrar askıya alın. Süspansiyonu nazikçe 10 kez pipetleyerek karıştırın. Süspansiyonun 10 mililitresini 10 santimetre kollajen kaplı bir tabak üzerinde tabaklayın.
Çanağı bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ortamı aspire edin ve hücreleri yıkama başına üç mililitre PBS ile üç kez yıkayın. FBS ve antibiyotik içeren 10 mililitre DMEM / F12 ekleyin ve inkübe edin.
Yağ Kırmızı O boyaması, adiposit farklılaşmasını indükledikten yedi gün sonra lipid yüklü adipositleri gösterdi. Tam farklılaşma derecesi, adipogenez düzenleyicilerinin mRNA ekspresyon analizi ile doğrulandı. Rosiglitazon, Ucp1 ve Ppargc1a gibi kahverengi yağa özgü genlerin ekspresyon seviyeleri üzerinde doza bağlı bir etkiye neden oldu.
Bununla birlikte, Fabp4 için, etki 0.1 mikromol rosiglitazon konsantrasyonunda doyurulmuştur. Diferansiye adipositler, oksijen tüketim hızı analizi ve kromatin immünopresipitasyonu gibi çeşitli fonksiyonel ve mekanik analizler için kullanılabilir.
