Yapışkan ham 264.7 içeren plakalardan medyayı aspire ederek başlayın. 15 santimetre plaka başına 10 mililitre PBS ekleyin. Hücreleri ayırmak ve tek bir 50 mililitrelik tüpe çekmek için bir hücre kazıyıcı kullanın.
Homojenize etmek için hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetin. Ardından, hücre süspansiyon hacminin% 5'ini yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300G'de santrifüj.
Süpernatantı atın ve toplam hücre fraksiyonu peletini buzun üzerine yerleştirin. Kalan süspansiyonu daha önce tarif edildiği gibi santrifüj ettikten sonra, süpernatantı aspire edin ve hücre peletini beş mililitre buz gibi soğuk mitokondri tamponunda yeniden askıya alın. Süspansiyonu 300G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüjleyin.
Peletleri 0.5 mililitre soğuk mitokondriyal tamponda tekrar askıya alın. Ve süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, süspansiyonu, bir mililitrelik bir şırıngaya takılı 25 gauge'lik bir iğneden 30 kez atlayarak homojenize edin.
Daha sonra tüpe bir mililitre soğuk mitokondri tamponu ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Hücreleri santrifüj ettikten sonra, süpernatantın bir mililitresini buz üzerindeki taze bir tüpe aktarın. Peleti tamponda tekrar askıya alın ve bir mililitrelik bir şırıngaya takılı 25 gauge'lik bir iğneden geçerek peleti homojenize edin.
Homojenize hücre peletlerini ve süpernatantı önceki adımlardan tek bir 1,5 mililitrelik tüpe çekin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2.000G'de santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın ve dört adet 1.5 mililitrelik tüpe bölün.
Mitokondriyal tampon kullanarak her tüpteki hacmi 1.5 mililitreye yükseltin. İçeriğini karıştırmak için tüpleri ters çevirin ve ardından tüpleri santrifüj edin. Süpernatant ve üst beyaz hücresel pelet dikkatlice çıkarın.
Kahverengi mitokondriyal pelet içeren dört tüpten birini ham mitokondriyal fraksiyon olarak buz üzerinde tutun. Kalan peletleri yeni bir tüpe çekin ve son hacmi mitokondri tamponu ile bir mililitre yapın. Bu protokol kullanılarak, ham 264.7 makrofaj hücre hattı ve BMDM'den toplam hücreler ve ham mitokondriyal fraksiyonlar elde edildi.
İmmünokan analizi, mitokondriyal sitrat sentazın ham fraksiyonda zenginleştirildiğini göstermiştir. Sitozol, plazma zarı, çekirdek, lizozom ve endoplazmik retikulumdan proteinler kayboldu. Proteom analizi, ham fraksiyonda on kattan fazla bir zenginleşme gösterdi.
Diğer altı hücresel bölme saflaştırma sırasında tükendi.
