Manfredo Quadroni'ye, Protein Analiz Tesisi'ne ve Lozan Üniversitesi'ndeki Elektron Mikroskopi Tesisi'ne yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca H.G. Sprenger, K. Maundrell ve Jourdain laboratuvarı üyelerine makale hakkında tavsiye ve geri bildirim için teşekkür ederiz. Bu çalışma Pierre-Mercier pour la Science Vakfı ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (proje hibesi 310030_200796) tarafından desteklenmiştir.

Eldivenler her zaman giyilmeli ve hücre kültürü adımları laminer akış başlığı altında gerçekleştirilmelidir. Hücreler,% 5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde tutulur. Bu protokolde sunulan araştırma, Lozan Üniversitesi ve İsviçre'nin hayvanların kullanımına ilişkin kılavuzlarına uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.
1. RAW264.7 makrofaj hücre hattının kültürü
<ol><li>Dulbecco'nun modifiye kartal besiyerinde (DMEM) farelerin makrofaj RAW264.7 hücrelerini,% 5 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HI-FBS) ve 100 IU / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin (P / S) ile desteklenmiş yüksek glikoz ve glutamin ile büyütün. NOT: Mitokondrileri izole etmek için, tek bir 15 cm'lik bir konfluent plaka (yaklaşık 70 x 10 7 RAW264.7 hücre) yeterlidir.</li>
	<li>RAW264.7 hücrelerini doku kültürü plakalarında tutun. 1 x 105 hücre/mL'lik bir başlangıç tohumlama yoğunluğu, 3 gün içinde bir birleşik plakaya yol açar. 15 cm'lik bir plaka için ortamda 25 mL hücre süspansiyonu kullanın. RAW264.7 hücreleri yüksek hücre bölünme oranına sahiptir ve çoğu hücre hattından daha sık bölünmesi gerekir.</li>
	<li>RAW264.7 hücrelerini ayırma<ol><li>Ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
		<li>15 cm'lik bir plaka için, 8 mL sıcak RAW ayrışma tamponu (270 mM potasyum klorür,H2O'da30 mM sodyum sitrat dihidrat, steril filtrelenmiş) ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Plakalara eşdeğer miktarda ortam ekleyin (ayrışma tamponunun 1:1 seyreltilmesi) ve hücreleri ayırmak ve homojenize etmek için pipet.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın ve tüpü oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı aspire edin ve hücre sayımı için peleti uygun bir ortam hacminde (adım 1.1'de açıklanmıştır) yeniden askıya alın. NOT: RAW264.7 hücrelerini ayırmak için tripsin veya hücre kazıyıcı gibi başka yöntemler de kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler hücreler üzerinde daha serttir ve ayrılmayı takip eden günlerde M1 benzeri makrofajlara polarizasyonlarına yol açabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kemik iliği kaynaklı makrofajların (BMDM'ler) izolasyonu ve kültürü
NOT: Burada açıklanan protokol tek bir fare içindir ve birden fazla fare için ölçeklendirilebilir. BMDM izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı protokoller başka bir yerde tanımlanmıştır13,14.
<ol><li>Yüksek dozda CO2 ile 8-12 haftalık bir C57BL/6 fareyi kurban edin. NOT: Erkek veya dişi fareler kullanılabilir.</li>
	<li>Sterilize etmek için fareye% 75 etanol püskürtün.</li>
	<li>Kalçaları, femurları ve tibiaları fareden disseke edin ve toplayın15.</li>
	<li>Kemik iliğini femurlardan ve tibiaslardan toplamak için, her iki kemiğin diz eklemi ucunu çıkarın15. Asetabulumu çıkararak kemik iliğini kalçalardan kurtarın.</li>
	<li>Kemikleri, buz üzerinde tutulan 4 mL BMDM ortamı ile 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın (% 5 HI-FBS, P / S ve 10 mM HEPS ile desteklenmiş yüksek glikoz ve glutamin içeren DMEM). NOT: Diseksiyon sırasında kemik iliğinin kurumasını önlemek için kemiklerin ortamda tutulması önemlidir.</li>
	<li>6 delikli bir plakanın iki farklı kuyucuğuna 4 mL PBS ve 4 mL sıcak BMDM ortamı ekleyin.</li>
	<li>Kemikleri ve ortamı 50 mL konik tüpten 6 delikli plakanın boş bir kuyucuğuna aktarın.</li>
	<li>Bir çift forseps kullanarak, kemikleri yıkamak için PBS'ye iyice aktarın.</li>
	<li>Kemikleri sıcak BMDM ortamı içeren kuyuya aktarın.</li>
	<li>Forseps ile iki adet 0,5 mL tüpün dibinde 1-2 mm çapında bir delik açın ve bunları 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. NOT: Bu hızlı adım için tüpe medya eklemek gerekli değildir.</li>
	<li>Her 0.5 mL'lik tüpte, maruz kalan kemiklerin kemik iliği tüplerin dibine bakacak şekilde bir femur, tibia ve kalça yerleştirin.</li>
	<li>Kemik iliğini ve artık ortamı 0,5 mL tüpün deliğinden ve 1,5 mL tüpün içine toplamak için tüpleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj edin. 0.5 mL tüpleri kemiklerle birlikte atın.</li>
	<li>BMDM ortamındaki kemik iliği peletlerini yeniden askıya alın ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.</li>
	<li>10 mL'ye kadar BMDM ortamı ekleyin.</li>
	<li>50 mL'lik bir konik tüpe 40 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve kemik iliği süspansiyonunu içinden filtreleyin.</li>
	<li>Bozulmamış hücreleri geri kazanmak ve hücre süspansiyonundaki küçük kalıntıları temizlemek için filtrelenmiş süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.</li>
	<li>50 ng / mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile desteklenmiş 70 mL BMDM ortamı hazırlayın.</li>
	<li>Peletin 10 mL M-CSF takviyeli BMDM ortamında yeniden askıya alınması.</li>
	<li>Yedi adet 10 cm'lik Petri kabının her birine 9 mL M-CSF takviyeli BMDM ortamı ekleyin.</li>
	<li>Yedi adet 10 cm'lik Petri kabının her birinde 1 mL hücre (yaklaşık 1 x 107 hücre) plakası.</li>
	<li>Plaka üzerinde dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleme yaparak her plakadaki hücre süspansiyonunu homojenize edin ve plakaları inkübatöre aktarın.</li>
	<li>3 gün sonra, her plakaya 50 ng / mL M-CSF ile desteklenmiş 5 mL sıcak BMDM ortamı ekleyin.</li>
	<li>3 gün sonra (6. gün, kemik iliği izolasyonundan sonra), BMDM'nin yapışmasını ve farklılaşmasını mikroskopi ile doğrulayın. NOT: Bu noktada, doğrudan mitokondri izolasyonuna geçmek mümkündür (adım 3). Alternatif olarak, sitokinler ve küçük moleküllerle tedavi edilmelerine izin veren BMDM'yi yeniden plakalayabiliriz.</li>
	<li>BMDM'lerin ayrılması<ol><li>Ortamı her plakadan aspire edin ve 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile desteklenmiş 7 mL soğuk PBS ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri 4 ° C'de 7-8 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>BMDM'leri 10 mL'lik bir pipet kullanarak dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın.</li>
		<li>Yedi plakanın hepsinden askıya alınmış BMDM'leri tek bir 50 mL konik tüpte bir araya getirin ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süpernatantı aspire edin ve hücre sayımı için hücreleri 40 mL sıcak BMDM ortamında yeniden askıya alın. NOT: Fare başına 7-9 x 107 BMDM arasında elde edilir. Proteomikler için mitokondri izolasyonu için en az 6 x 107 BMDM önerilir.</li>
		<li>İstenirse, BMDM'leri deneysel hedefe göre plakalayın ve tedavi edin. Değilse, doğrudan adım 3.3'e geçin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Diferansiyel santrifüjleme ile ham mitokondriyal fraksiyonun hazırlanması
NOT: Tüm santrifüjleme adımlarını 4 °C'de gerçekleştirin. Biri en az 300 x g bağıl santrifüj kuvvetine sahip konik tüpler için bir salınım rotoru ve adaptörleri, diğeri 1,5 mL borular için uygun en az 21.000 x g bağıl santrifüj kuvvetine sahip iki santrifüj gereklidir. Yapışkan hücreleri kullanırken, bir hücre kazıyıcı kullanın.
<ol><li>Yapışkan hücreler için, ortamı aspire edin ve 15 cm'lik plaka başına 10 mL PBS ekleyin. NOT: PBS'deki kazıma hücreleri, birinin aynı anda yıkanmasını sağlar. Hücreler zaten askıya alma aşamasındaysa, doğrudan adım 3.3'e geçin.</li>
	<li>Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırın ve bunları tek bir 50 mL konik tüpte toplayın. Hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin. NOT: Hücreler bir hücre kazıyıcı kullanılarak ayrılabilir, çünkü bu daha hızlıdır ve kısa bir süre sonra lize edilirler.</li>
	<li>Her deneysel durum için, hücre süspansiyon hacminin% 5'ini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. NOT: Süspansiyon hücrelerini kullanırken, FBS gibi ortamlardan olası kirleticileri temizlemek için hücreleri daha önce PBS ile bir kez yıkadığınızdan emin olun.</li>
	<li>Supernatant'ı atın ve peleti buz üzerinde tutun. NOT: Bu, proteomikler için "toplam hücre" fraksiyonunu temsil edecektir.</li>
	<li>Adım 3.1 veya 3.2'deki numunelerin geri kalanını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin.</li>
	<li>Aşağıdaki tüm adımları buz üzerinde ve buz gibi soğuk tamponlar kullanarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 5 mL buz gibi soğuk mitokondri tamponunda (MB) (210 mM mannitol, 70 mM sakaroz, 10 mM HEPS / NaOH [pH 7.4] ve 1 mM EDTA) yeniden askıya alın.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme ile hücreleri geri kazanın.</li>
	<li>Hücre peletini 0,5 mL soğuk MB'de tekrar askıya alın ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. NOT: Bu prosedür yaklaşık 1,5 x 10 8 BMDM hücre/mL veya 3 x 108 RAW264,7 hücre/mL hücre konsantrasyonu sağlar.</li>
	<li>25 G iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, hücre süspansiyonunu iğneden 30 pasajla homojenize edin (Şekil 1A).</li>
	<li>Tüpe 1 mL soğuk MB ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Homojenize hücre süspansiyonunu 2.000 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatantın 1 mL'sini, hücre peletini rahatsız etmeden buz üzerinde taze bir 1.5 mL tüpe aktarın. Hücre peletini yeniden askıya alın ve adım 3.7'de olduğu gibi tekrar homojenize edin.</li>
	<li>Homojenize hücre peletini ve önceki iki adımdaki süpernatantı tek bir 1,5 mL tüpte toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj edin. NOT: Bu noktada, pelet çoğunlukla çekirdek ve kırılmamış hücreler içerir ve atılır. Süpernatant, hücresel enkaz, sitosol ve mitokondri de dahil olmak üzere organeller içerir (Şekil 1B).</li>
	<li>Süpernatantı dört adet 1,5 mL tüp arasında bölün. NOT: Bu aşamada süpernatantın birden fazla tüp arasında bölünmesi, aşağıdaki adımlarda kirleticilerin uzaklaştırılmasını iyileştirir.</li>
	<li>Dört tüpün her birinde 1 mL'lik son bir hacim elde etmek için MB ekleyin. İnversiyon ile karıştırın ve tüpleri 13.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. NOT: Bu adımdan sonra, iki katmanlı bir pelet görülebilir. Alt, sert, kahverengi pelet mitokondri içerir ve daha fazla saflaştırma için tutulur (Şekil 1C). Üst, gevşek, beyaz pelet diğer hücresel yapıları içerir ve atılabilir.</li>
	<li>Bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Süpernatantı mümkün olduğunca beyaz üst pelet ile çıkarın. Üzerine hafifçe pipetleme yaparak, beyaz peleti yeniden askıya almak ve daha sonra kahverengi mitokondriyal peleti bozulmadan bırakarak atmak mümkündür.</li>
	<li>Dört tüpten birini mitokondriyal pelet ile buz üzerinde tutun. Bu, proteomikler için "ham mitokondri" fraksiyonunu temsil eder.</li>
	<li>Diğer üç peleti 1,5 mL'lik bir tüpte 1 mL'lik bir MB'lık son hacimde bir araya getirin.</li>
</ol>4. Mitokondrinin süperparamanyetik antikor bazlı saflaştırılması
NOT: Soğuk bir odada 4 °C'de aşağıdaki adımların tümünü uygulayın.
<ol><li>Ham mitokondriyal preparatın 1 mL'sini adım 3.18'den 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 150 mM NaCl (MB + NaCl) ile desteklenmiş 7 mL MB ekleyin. NOT: NaCl ilavesi antikor bağlanmasını iyileştirir ve kirleticilerin boncuklara ve mitokondriye spesifik olmayan bağlanmasını azaltır.</li>
	<li>8 mL ham mitokondri süspansiyonuna 50 μL Tomm22 boncuk ekleyin (Şekil 1D) ve tüpü düşük hızda dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Tomm22 boncukları, süperparamanyetik boncuklara bağlanmış, farede yetiştirilen Tomm22 monoklonal antikorlarına kovalent olarak bağlanır.</li>
	<li>Bu arada, mıknatısın üzerine bir sütun yerleştirin.</li>
	<li>Sütunu 8 mL MB + NaCl ile dengeleyin ve akışı atın.</li>
	<li>Tomm22 boncukları ile numunenin 4 °C'sinde 15 dakikalık inkübasyonun ardından, numuneyi kolona aktarın. Akışı atın. NOT: Mitokondri, sütundaki manyetik boncuklara bağlı kalacaktır (Şekil 1E).</li>
	<li>Kolonu 8 mL MB + NaCl ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Kolonu mıknatıstan çıkarın ve 15 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin.</li>
	<li>Kolona 1.5 mL MB + NaCl ekleyerek mitokondrileri temizleyin ve saflaştırılmış mitokondrileri tüpe sokmak için hemen bir piston uygulayın.</li>
	<li>Salınan mitokondrileri 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 21.000 x g'de santrifüj edin. NOT: Kahverengi bir pelet oluşacaktır. Bu, izole edilmiş mitokondrileri ve antikorla eşleşmiş boncukların bazılarını içerir (Şekil 1F).</li>
	<li>Süpernatantı peletten dikkatlice çıkarın. Pelet, proteomikler için "saf mitokondri" fraksiyonunu temsil eder. Bu pelet, 3.4 ve 3.17. basamaklardaki peletlerle birlikte -20 °C'de saklanabilir ve çıkış yönündeki uygulamalar için hazırdır.</li>
</ol>

İki aşamalı mitokondriyal izolasyon kullanılarak geliştirilmiş protein miktar tayini

<ol>
	<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism.">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li><li>West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+innate+immune+responses.">Mitochondria in innate immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).</li><li>Chakrabarty, R. P., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+signaling+organelles+control+mammalian+stem+cell+fate.">Mitochondria as signaling organelles control mammalian stem cell fate.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 394-408 (2021).</li><li>Morgenstern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-confidence+human+mitochondrial+proteome+and+its+dynamics+in+cellular+context.">Quantitative high-confidence human mitochondrial proteome and its dynamics in cellular context.</a> Cell Metabolism. 33 (12), 2464-2483 (2021).</li><li>Rath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoCarta3.0:+an+updated+mitochondrial+proteome+now+with+sub-organelle+localization+and+pathway+annotations.">MitoCarta3.0: an updated mitochondrial proteome now with sub-organelle localization and pathway annotations.</a> Nucleic Acids Research. 49, D1541-D1547 (2021).</li><li>Pagliarini, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitochondrial+protein+compendium+elucidates+complex+I+disease+biology.">A mitochondrial protein compendium elucidates complex I disease biology.</a> Cell. 134 (1), 112-123 (2008).</li><li>Diaz-Vegas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+mitochondrial+dysfunction+a+common+root+of+noncommunicable+chronic+diseases.">Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases.</a> Endocrine Reviews. 41 (3), 005 (2020).</li><li>Bury, A. G., Vincent, A. E., Turnbull, D. M., Actis, P., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation:+when+size+matters.">Mitochondrial isolation: when size matters.</a> Wellcome Open Research. 5, 226 (2020).</li><li>Chen, W. W., Freinkman, E., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+immunopurification+of+mitochondria+for+metabolite+profiling+and+absolute+quantification+of+matrix+metabolites.">Rapid immunopurification of mitochondria for metabolite profiling and absolute quantification of matrix metabolites.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2215-2231 (2017).</li><li>Daniele, J. R., Heydari, K., Arriaga, E. A., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+mitochondrial+subtypes+in+Caenorhabditis+elegans+via+analysis+of+individual+mitochondria+by+flow+cytometry.">Identification and characterization of mitochondrial subtypes in Caenorhabditis elegans via analysis of individual mitochondria by flow cytometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (12), 6309-6316 (2016).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), e82392 (2013).</li><li>Yates, J. R., Gilchrist, A., Howell, K. E., Bergeron, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+organelles+and+large+cellular+structures.">Proteomics of organelles and large cellular structures.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (9), 702-714 (2005).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+macrophage+production.">marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).</li><li>Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+macrophage+polarization+using+bone+marrow+derived+macrophages.">Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. (76), e50323 (2013).</li><li>Toda, G., Yamauchi, T., Kadowaki, T., Ueki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+bone+marrow-derived+macrophages+from+mice+for+functional+analysis.">Preparation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice for functional analysis.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100246 (2020).</li><li>Gene Ontology Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gene+Ontology+resource:+enriching+a+GOld+mine.">The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine.</a> Nucleic Acids Research. 49, D325-D334 (2021).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.">Gene ontology: tool for the unification of biology.</a> The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation.">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li><li>Delamarre, L., Pack, M., Chang, H., Mellman, I., Trombetta, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+lysosomal+proteolysis+in+antigen-presenting+cells+determines+antigen+fate.">Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate.</a> Science. 307 (5715), 1630-1634 (2005).</li><li>Bayraktar, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MITO-Tag+mice+enable+rapid+isolation+and+multimodal+profiling+of+mitochondria+from+specific+cell+types+in+vivo.">MITO-Tag mice enable rapid isolation and multimodal profiling of mitochondria from specific cell types in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (1), 303-312 (2019).</li><li>Nusinow, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia.">Quantitative proteomics of the cancer cell line encyclopedia.</a> Cell. 180 (2), 387-402 (2020).</li><li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+seahorse+XF96+analyzer.">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li><li>Hornig-Do, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+pure+mitochondria+by+superparamagnetic+microbeads.">Isolation of functional pure mitochondria by superparamagnetic microbeads.</a> Analytical Biochemistry. 389 (1), 1-5 (2009).</li><li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods in Enzymology. 457, 349-372 (2009).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Mitokondri izolasyonu için geliştirilmiş bir saflık elde etmek için diferansiyel santrifüjleme ve immünoyakalamayı birleştirdik. Prosedürümüz, yeni mitokondriyal proteinlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için birincil materyale erişim sağlar. Protokol basit ve sağlamdır ve genetik modifikasyona gerek kalmadan hücre hatlarına, birincil hücrelere ve dokulara uygulanabilir. Saflaştırma prosedürü boyunca farklı aşamalarda alınan numuneler üzerinde immünoblotlama ve proteomik analizler yaparak protokolümüzü doğruladık.
Tek izolasyon yöntemlerine kıyasla, farklı doğalardaki zenginleştirme adımlarının kombinasyonu - burada, santrifüjleme ve bağışıklık etiketleme - mitokondrileri izole etmek için daha sağlam bir protokol oluşturur. Bunun nedeni, mitokondriyal proteinlerin her iki saflaştırmada da zenginleşmesine rağmen, kirleticilerin her iki zenginleştirme adımından sonra da zenginleştirilmesi olası değildir. Yüksek mitokondriyal saflık, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ile de elde edilebilse de, bu yaklaşım büyük miktarda başlangıç malzemesi ve bir ultrasantrifüje erişim gerektirir. Son olarak, etiket tabanlı mitokondriyal izolasyon20'ye dayanan son yöntemlerin aksine, yaklaşımımız numunenin genetik modifikasyonunu gerektirmez, bu da onu herhangi bir kaynaktan birincil materyal için uygun hale getirir.
Protokolümüzü uygularken deney tasarımında bazı teknik ve biyolojik hususların dikkate alınması gerekir. (1) Yeterli malzemenin elde edilebilmesi için başlangıç malzemesi miktarı kritik öneme sahiptir. Kaçınılmaz olarak, homojenizasyon sırasında (adım 3.10) az sayıda mitokondri kaybolacaktır, çünkü tüm hücreler lize edilmez veya üç kolon yıkama sırasında (adım 4.6). Protokolümüz verim üzerindeki saflığa odaklanırken, mitokondri izolasyonunun etkinliği ve dolayısıyla verimleri ölçülmemiş veya optimize edilmemiştir. Daha fazla Tomm22 boncuğu ve daha fazla sütun kullanılmasının mitokondri geri kazanımının verimini arttırması beklenmektedir. Aynı zamanda, homojenizasyon adımının kapsamlı bir optimizasyonu da mitokondriyal verimin artmasına yol açabilir. Bu protokol ve burada RAW264.7 hücreleri ve BMDM'ler için bildirdiğimiz başlangıç hücre sayıları proteomik için yeterlidir ve diğer uygulamalar için ayarlanabilir. Birincil BMDM'ler söz konusu olduğunda, tek bir farenin bir çoğaltma için yeterli olduğunu bulduk. Gerektiğinde, prosedür BMDM'leri birden fazla hayvandan izole etmek için ölçeklendirilebilir, bu da daha sonra yeterli malzeme elde etmek için havuzlanabilir. Hücre sayısı, hücre tipine, boyutuna ve mitokondriyal içeriğine bağlı olarak optimize edilebilir. (2) Tomm22, tüm hücre tiplerinden ve dokularından mitokondri üzerinde eksprese edilir21, ancak ifade düzeyi değişebilir. Bu nedenle, farklı koşulları karşılaştırmak için bir deney tasarlarken, Tomm22'nin ifade düzeylerinin karşılaştırılabilir olduğundan emin olmak önemlidir. Ayrıca, Tomm22'nin her yerde bulunan ekspresyonu nedeniyle, karmaşık dokulardaki hücre tipine özgü mitokondriyal proteinleri incelemek mümkün değildir. (3) Saf mitokondri üretmek için gereken süre (yaklaşık 2.5 saat), metabolik profillerdeki değişiklikler gibi geçici olayların incelenmesiyle uyumlu değildir. Bu durumda, doğrudan etiket tabanlı bağışıklık yakalamayı öneririz9, aynı zamanda hücre tipine özgü mitokondrilerin incelenmesine de izin verir in vivo20. (4) Tek başına Tomm22 antikoru etiketli boncuklar kullanılarak elde edilen izole mitokondri üzerine yapılan çalışmalar fonksiyonel tahlillerde aktivite göstermiş olsa da;11, protokolümüzle üretilen mitokondrinin aşağı akış aktivitesine dayalı analizlerle uyumlu olup olmadığı belirlenmeye devam etmektedir. MitoTracker veya tetrametilrhodamine metil ester perklorat (TMRM) boyama veya respirometri ölçümleri, izole mitokondrinin işlevselliğini ölçmek için potansiyel yaklaşımlardır22. (5) "Mito-saf" numuneyi kolondan çıkardıktan sonra, saf mitokondri fraksiyonunda (Şekil 2B). Tripsin sindirimi ve protein kütle spektrometrisi ile herhangi bir girişim gözlemlememize rağmen, bu boncukların ve immünoglobulinlerin varlığı diğer aşağı akış uygulamalarında dikkate alınmalıdır. Tomm22 antikoru, farelerde üretilen monoklonal bir antikordur23ve bu nedenle, immünoblotlamada farelere karşı ikincil antikorlar kullanıldığında, immünoglobulin zincirlerinin boyutunda spesifik olmayan bantlar üreteceğini akılda tutmak önemlidir. (6) Hücre süspansiyonunun tam homojenizasyonu, mitokondrinin başarılı bir şekilde izole edilmesinin anahtarıdır. Burada, hem RAW264.7 hücrelerini hem de BMDM'leri lize etmek için 25 G iğneli bir şırınga kullanıyoruz. Bununla birlikte, hücre tipine ve boyutuna bağlı olarak, bir Dounce homojenizatörünün kullanımı gibi diğer mekanik homojenizasyon yöntemleri veya hücre homojenizatör cihazları gibi daha kontrollü yaklaşımlar daha uygun olabilir. Nazik sonikasyon gibi mekanik olmayan homojenizasyon yöntemleri de düşünülebilir. Doku homojenizasyon yaklaşımları diğer çalışmalarda daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır24,25. (7) İmmünoblotlama ile doğrulama en basit ve ucuz yöntem olmasına rağmen, sonuçları her zaman tüm organel seviyesindeki değişikliklerle ilişkili olmayabilir. Bu nedenle, sırasıyla mitokondri ve diğer organellerin zenginleşmesini veya tükenmesini tam olarak doğrulamak için proteomik kullanmanızı öneririz.
Burada tarif edilen iki aşamalı mitokondri saflaştırma protokolü, mitokondriyal saflığı artıran sıralı örnekler üretmemize izin verdi ve bu, çıkarma proteomikleri12 yoluyla yeni mitokondriyal protein adaylarını keşfetmemizi sağladı. Analizimiz için, önemli ölçüde zenginleştirilmiş mitokondriyal proteinleri seçmek için katı eşikler kullanıyoruz ve bu, bilinen bazı mitokondriyal proteinleri tanımlamakta başarısız olsa da (Şekil 3A), yeni mitokondriyal protein keşfi için yanlış pozitif oran azalır. Bununla birlikte, protokolümüz tarafından ortaya konan herhangi bir aday proteinin ortogonal yaklaşımlarla doğrulanması gerektiğini vurgulamak önemlidir. Mitokondri ile mikroskobik olarak veya proteaz koruma testleri ile ilişkiyi doğrulamak için karboksi-terminal GFP etiketlemesini veya endojen proteine karşı antikorların kullanılmasını öneririz.
Yöntemimizin değiştirilmemiş hücreler ve dokular durumunda doğrudan uygulanması, mitokondrilerin sağlıklı ve hastalık koşullarında çevrelerine nasıl değiştiğini ve uyum sağladığını araştırmak için güçlü bir araç sunar. Protokolümüzün hücre hatlarına, hayvan hastalıkları modellerine, insan sıvılarına ve hatta cerrahiden biyopsilere uygulanması, mitokondri ve bunlarla ilişkili bozukluklar hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için özellikle yararlı olabilir.

Mitokondri, hücrenin metabolik ihtiyaçlarını algılayabilen ve adapte edebilen karmaşık ve dinamik organellerdir. Hücresel metabolizmanın karmaşıklığının merkezinde yer alan mitokondri, karbonhidrat, protein, lipit, nükleik asit ve ko-faktör metabolizması reaksiyonlarının birleştiği metabolik merkezler olarak işlev görür1. Ayrıca, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin yolları için ve iyonlardaki ve reaktif oksijen türlerindeki değişikliklere yanıt olarak sinyal organelleri olarak da hizmet ederler 2,3. Bugüne kadar, yaklaşık 1.100 protein mitokondri 4,5,6 ile eşleştirilmiştir, ancak özellikle sadece belirli hücre tiplerinde veya belirli çevresel koşullar altında geçici olarak ifade edilenler olmak üzere daha fazlasının keşfedilmeyi beklediğini varsayabiliriz. İlgilenilen metabolik durumlarda mitokondriyal kompozisyondaki değişiklikleri ölçmek için yeni yaklaşımlar geliştirmek, bu organeller hakkındaki bilgimizi artıracak ve mitokondriyal disfonksiyon ile karakterize bozukluklar için yeni terapötik yolları vurgulayacaktır7.
Şu anda, farklı verim ve saflık seviyelerine sahip farklı mitokondri izolasyon protokolleri mevcuttur8. Santrifüj tabanlı yaklaşımlar, basitlikleri ve düşük maliyetleri nedeniyle en popüler olanlardır. Çoğu uygulama için uygun olmasına rağmen, diferansiyel santrifüjleme, daha düşük mitokondriyal saflık elde etme ve daha karmaşık yoğunluk gradyanı bazlı uygulamalar kullanıldığında büyük miktarlarda başlangıç malzemesi gerektirme dezavantajına sahiptir. Son yıllarda, mitokondri izolasyonu için etiket tabanlı bağışıklık yakalama ("MITO-IP")9 ve floresan ile aktive organel sıralama10 gibi yeni yöntemler ortaya çıkmıştır. Her iki prosedür de yüksek saflıkta örnekler üretebilse de, birincisi, afinite saflaştırması için mitokondrileri etiketlemek için genetik mühendisliği gerektirir, bu da protokolleri değiştirilmemiş organizmalardan veya insan donörlerinden gelen birincil materyalle uyumsuz hale getirir. Bu arada, ikincisi akış sitometrisine ve sıralama cihazlarına erişime bağlıdır. Farklı izolasyon yöntemlerini birleştirmek, daha sağlam protokoller ve daha fazla saflık üretme sözü verir.
Burada, mevcut iki yöntemin kombinasyonuna dayanan mitokondri izolasyonu için yeni bir protokol sunuyoruz: (1) ham bir mitokondriyal fraksiyonu izole etmek için diferansiyel santrifüjleme ve (2) her yerde bulunan bir mitokondriyal dış membran proteini olan dış mitokondriyal membranın translokazına karşı antikorlara kovalent olarak bağlanmış süperparamanyetik boncuklarla mitokondrinin etiketsiz bağışıklık yakalaması 22 (Tomm22)11 (Şekil 1). Tanımladığımız prosedür kantitatif protein kütle spektrometrisi ile uyumludur ve etiketsiz olduğu ve genetik manipülasyon gerektirmediği için, hücre hatlarından vücut sıvılarına ve tüm hayvan dokularına kadar çok çeşitli araştırma modellerine uygulanabilir. Ayrıca, protokolde iki adımın kullanılması, yeni mitokondriyal proteinlerin keşfi ve ekspresyonlarının incelenmesi için çıkarma proteomikleri 6,12'nin kullanılmasını sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD Plastipal</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G Needle</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TOM22 Microbeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-127-693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>11577692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP-120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>5-31F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns and plungers</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>12343115&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BH93B-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline 10X</td>
			<td>Eurobio Scientific</td>
			<td>CS3PBS01-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C19196</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step tag-free isolation of mitochondria for improved protein discovery and quantification

Merkezi metabolizmadan nörodejenerasyona karşı bağışıklık tepkisine kadar çoğu fizyolojik ve hastalık süreci mitokondri içerir. Mitokondriyal proteom 1.000'den fazla proteinden oluşur ve her birinin bolluğu dış uyaranlara yanıt olarak veya hastalığın ilerlemesi sırasında dinamik olarak değişebilir. Burada, yüksek kaliteli mitokondrileri birincil hücrelerden ve dokulardan izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. İki aşamalı prosedür, (1) ham mitokondrileri izole etmek için mekanik homojenizasyon ve diferansiyel santrifüjleme ve (2) saf organelleri izole etmek ve kirleticileri ortadan kaldırmak için mitokondrinin etiketsiz bağışıklık yakalamasını içerir. Her saflaştırma aşamasındaki mitokondriyal proteinler kantitatif kütle spektrometrisi ile analiz edilir ve zenginleştirme verimleri hesaplanır, böylece yeni mitokondriyal proteinlerin çıkarılabilir proteomiklerle keşfedilmesine izin verilir. Protokolümüz, hücre hatlarındaki, birincil hücrelerdeki ve dokulardaki mitokondriyal içeriği incelemek için hassas ve kapsamlı bir yaklaşım sağlar.

Mitochondria are complex and dynamic organelles able to sense and adapt to the metabolic needs of the cell. Central to the complexity of cellular metabolism, mitochondria act as metabolic hubs where carbohydrate, protein, lipid, nucleic acid, and co-factor metabolism reactions converge1. They also serve as signaling organelles for pathways of the innate immune response and in response to changes in ions and reactive oxygen species2,3. To date, around 1,100 proteins have been mapped to mitochondria4,5,6, yet we can assume that many more remain to be discovered, especially those expressed only in certain cell types or transiently under specific environmental conditions. Developing new approaches for quantifying changes in mitochondrial composition in metabolic states of interest will increase our knowledge of these organelles and highlight novel therapeutic avenues for the disorders characterized by mitochondrial dysfunction7.
Currently, different mitochondria isolation protocols are available, with differing yields and levels of purity8. Centrifugation-based approaches are the most popular, due to their simplicity and low cost. Although suitable for most applications, differential centrifugation has the disadvantage of obtaining lower mitochondrial purity and requiring large amounts of starting material when more complex density gradient-based applications are used. In recent years, new methods for mitochondria isolation have emerged, such as tag-based immune capture (&#34;MITO-IP&#34;)9 and fluorescence-activated organelle sorting10. Although both procedures can generate samples with high purity, the former requires genetic engineering to tag mitochondria for affinity purification, making the protocols incompatible with primary material from unmodified organisms or human donors. Meanwhile, the latter is dependent on access to flow cytometry and sorting instruments. Combining different isolation methods offers the promise of generating more robust protocols and increased purity.
Here, we present a new protocol for mitochondria isolation based on the combination of two existing methods: (1) differential centrifugation to isolate a crude mitochondrial fraction, and (2) tag-free immune capture of mitochondria with superparamagnetic beads covalently bound to antibodies against translocase of outer mitochondrial membrane 22 (Tomm22)11, a ubiquitous mitochondrial outer-membrane protein (Figure 1). The procedure we describe is compatible with quantitative protein mass spectrometry, and because it is tag-free and does not require genetic manipulation, it can be applied to a wide range of research models, from cell lines to body fluids to whole animal tissues. Furthermore, the use of two steps in the protocol enables the use of subtractive proteomics6,12 for the discovery of novel mitochondrial proteins and the study of their expression.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Protein Keşfi ve Miktar Tayini için Mitokondrinin İki Adımlı Etiketsiz İzolasyonu  

Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

Our lab studies changes in mitochondria and energy metabolism and how these impact both healthy and pathological processes like immune activation, cancer, or metabolic disorders. Our aim is to help to develop new treatments to a wide variety of disorders by providing a better understanding of mitochondrial function and energy metabolism. Tools such as mass spectrometry based proteomics, metabolomics, and CRISPR-Cas9 genetic screens are becoming more popular for identifying molecular mechanisms in both the mitochondrial function and energy metabolism in specific cell types and environments.In contrast to other methods, our protocol employs two purification steps, differential centrifugation, and immune capture for mitochondrial isolation. This offers several advantages, like improved removal of contaminants, and it is also powerful tool for identifying new mitochondrial proteins. Our protocol provides insight into the composition, and therefore, mitochondrial function in different cell types and environments.This can help us better understand normal processes like immune activation, but also pathological processes like cancer. We will focus on mitochondrial macrophages. We will test how the composition of mitochondria changes during immune response to better understand their function.Our findings could lead to a development of drugs with, for example, anti-inflammatory effects.

Mevcut protokolde artan derecelerde mitokondriyal saflığa sahip üç örnek üretilmiştir: toplam hücreler, ham mitokondri ("mito-crude") ve saf mitokondri ("mito-saf") (Şekil 1). Mitokondrinin RAW264.7 makrofaj hücre hattından saflaştırılmasını, her fraksiyonun eşit protein miktarlarını bir jel üzerine yükleyerek ve immünoblotlama yaparak doğruladık ve mitokondriyal sitrat sentazın (Cs) her saflaştırma adımında zenginleştirildiğini bulduk; Bu arada, sitosol (GAPDH), plazma zarı (Na / K ATPaz), çekirdek (Lamin B), lizozomlar (Lamp1) ve endoplazmik retikulum (ER) (Pdi) proteinleri giderek kayboldu (Şekil 2A). BMDM'ler kullanılarak da benzer sonuçlar elde edildi. İzole mitokondrinin saflığının ve bütünlüğünün daha fazla doğrulanması için, saf mitokondriyal fraksiyon üzerinde elektron mikroskobu yapıldı. Klasik oval şekilli mitokondri ve antikor kaplı boncuklara karşılık gelen elektron yoğun parçacıklarla çevrili sağlam kristaller gözlemledik (Şekil 2B). Bu nedenle, protokolümüzün mitokondrileri zenginleştirdiği, diğer hücresel bileşenleri tükettiği ve mitokondriyal yapısal bütünlüğü koruduğu sonucuna varılabilir.
Daha sonra, kütle spektrometrisine (LC / MS) bağlı sıvı kromatografisi kullanılarak her fraksiyonun proteom analizi yapıldı. Toplam hücrelerden elde edilen ekstraktta, 907'si daha önce MitoCarta3.0 envanter5'te mitokondriyal olarak ek açıklamalı olan toplam 6.248 protein tanımlanmıştır. En az iki benzersiz peptit eşiğine sahip proteinleri filtreledikten sonra, her numunedeki her protein için toplam hücrelere kıyasla yoğunluklarına göre bir zenginleştirme puanı hesapladık. Daha sonra proteinleri yedi ana hücre altı bölmeye ayırdık: mitokondri, ER, lizozomlar, Golgi aparatı, hücre iskeleti, çekirdek ve sitosol, Gen Ontolojisi (GO) 16,17 ve MitoCarta3.05'i referans olarak kullanarak. Önemli olarak, ham ve saf mitokondri fraksiyonlarında sırasıyla 10 kattan fazla ve 20 kattan fazla mitokondriyal proteinler için ortalama bir zenginleşme gözlenmiştir (Şekil 2C). Buna karşılık, analiz edilen diğer altı hücresel bölmenin bileşenleri saflaştırma prosedürü sırasında tükenmiştir. Özellikle, ham mitokondri fraksiyonunda, ER ve lizozomal proteinler için geçici bir zenginleştirme gözlemledik, diferansiyel santrifüjleme protokollerini takiben sıklıkla mevcut olan iki kirletici protein sınıfı18. Bu muhtemelen organel-organel etkileşimlerinden ve benzer sedimantasyon katsayılarından, özellikle makrofajlarda oldukça bol miktarda bulunan lizozomlar için19'dan kaynaklanıyordu. Her ikisi de bağışıklık yakalamadan sonra çoğunlukla tükenmiş olsa da, mito-saf fraksiyondaki ER-mitokondri temas bölgelerinden proteinler için küçük bir sinyal tespit ettik.
Daha sonra toplam hücrelerden ve mito-saf örneklerden protein bolluğunu doğrudan karşılaştırdık ve mitokondriyal ve mitokondriyal olmayan proteinlere karşılık gelen iki ayrı popülasyon gözlemledik (Şekil 2D). MitoCarta proteinlerinin büyük çoğunluğu birlikte kümelenirken, MitoCarta olmayan proteinlerle kümelenmiş birkaç tane (% <5) bulduk. Bu proteinler (1) sitozolik mitokondri ile etkileşime giren proteinleri (MitoCarta'nın 3.0 sürümünde ek açıklamalı yeni bir kategori), (2) çift lokalize proteinleri veya (3) yanlış açıklamalı proteinleri temsil edebilir. Tersine, mitokondriyal proteinlerle kümelenen MitoCarta olmayan proteinlerin birkaç örneğini bulduk. Bu tür proteinler izolasyon prosedürünün kirleticilerini temsil edebilirken, daha önce mitokondride mevcut olarak sınıflandırılmamış proteinleri de temsil edebilirler.
Bu yeni potansiyel mitokondriyal protein sınıfını araştırmak için, mitokondri 6,12 de dahil olmak üzere organellar proteomların keşfi için yararlı olduğu kanıtlanmış bir yaklaşım olan çıkarmalı proteomikler kullanılmıştır. Subtraktif proteomikler, saflaştırma adımları sırasında mitokondrinin zenginleştirilmesi gerektiğini ve kirleticilerin tükenmesi gerektiğini varsayar6. Örneğin, kirleticiler diferansiyel santrifüjleme sırasında (örneğin, benzer çökeltme özellikleri nedeniyle) veya immün yakalama sırasında (örneğin, spesifik olmayan antikor bağlanması nedeniyle) birikebilirken, yalnızca iyi niyetli mitokondriyal proteinler her ikisinde de önemli ölçüde birikmelidir. Böylece, saf mitokondri fraksiyonunda bulunan ancak tutarsız zenginleştirme kalıpları gösteren proteinleri filtrelemek mümkündür. RAW264.7 hücreleri ile mevcut örnekte, mito-ham ve mito-saf numuneler için ≥1'lik benzersiz peptitler için bir eşik belirleyerek ve katı zenginleştirme eşikleri kullanarak, diferansiyel santrifüjlemeden sonra başlangıçta ham mitokondriyal fraksiyonda bulunan 1.127 proteinden geri kazanılmış mitokondriyal proteomların listesini, Tomm22 immünoseleksiyonunu kullanarak ikinci saflaştırma turunu takiben 481 proteine kadar rafine edebildik. Mito-saf fraksiyondaki MitoCarta açıklamalı proteinlerin sayısının azalması, seçim için uygulanan yüksek sıkılığı yansıtır. İlginçtir ki, mito-saf fraksiyonda bulunan proteinlerin 70'i MitoCarta3.0 envanterinde mevcut değildi (Şekil 3A, B). Bu son proteinler, yalnızca RAW264.7 makrofaj hücre hattında ve ilgili hücrelerde eksprese edilebilen ve daha fazla araştırmayı hak eden potansiyel yeni mitokondriyal aday proteinleri temsil edebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65252/65252fig01v2.jpg"> Şekil 1: İki adımlı, etiketsiz mitokondri izolasyon protokolünün çizimi . (A) Bir hücre süspansiyonu 25 G'lik bir iğne ile bozulur. (B) Çekirdekler ve bütün hücreler 2.000 x g'da santrifüjleme ile ayrılır ve süpernatant kurtarılır. (C) Ham mitokondri, süpernatantın 13.000 x g'de (mito-crude) diferansiyel santrifüjlenmesi ile izole edilir. (D) Ham mitokondri daha sonra süperparamanyetik boncuklara kovalent olarak bağlı Tomm22 antikorları (Ab) ile inkübe edilir. (E) Mitokondri-Tomm22 antikor-boncuk kompleksleri, manyetik sütunlar kullanılarak kirleticilerden ayrılır ve yayılır. (F) Saf mitokondriler santrifüjleme (mito-saf) ile toplanır ve konsantre edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65252/65252fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65252/65252fig02v2.jpg"> Şekil 2. İki makrofaj kaynağından mitokondri izolasyonunun temsili sonuçları. (A) Mitokondriyal sitrat sentaz (Cs - mitokondri), gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (Gapdh - sitosol), sodyum-potasyum pompası (Na / K ATPaz - plazma zarı), Lamin B (Lamin B - çekirdek), lizozomal ilişkili membran proteini 1 (Lamp1 - lizozom) ve protein disülfür-izomeraz (Pdi - ER) antikorları kullanılarak RAW264.7 (üstte) ve BMDM hücrelerinin (altta) protein immünoblot analizi. (B) RAW264.7 hücrelerinden saflaştırılmış mitokondrinin elektron mikroskopisi. Mitokondrileri çevreleyen yüksek yoğunluklu parçacıklar, sütunlardan elüsyondan sonra mito-saf numunelerle taşınan Tomm22 boncuklarına karşılık gelir. Ölçek çubukları: 80 nm. (C) RAW264.7 hücrelerindeki yedi hücresel bölmeden toplam hücreler, mito-ham ve mito-saf arasında zenginleştirme skorları. Protein ek açıklaması için MitoCarta3.0 ve GO kullanıldı ve ortalama puanlar temsil edildi. Kısaltma: ER = endoplazmik retikulum. (D) Toplam hücrelerdeki proteinler için protein bolluk değerleri (riBAQ) ve RAW264.7 hücrelerinden mito-saf örnekler. MitoCarta3.0 proteinleri turuncu renkte gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65252/65252fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65252/65252fig03v2.jpg"> Şekil 3. Subtraktif proteomik kullanarak yeni mitokondriyal proteinlerin keşfi. (A) Yeni mitokondriyal proteinlerin keşfi için çıkarma proteomik stratejisi. Yanlış pozitiflerin seçimini en aza indirmek için yüksek seçim eşikleri (4x ve 2x) uygulanır. (B) MitoCarta3.0 envanterinde daha önce açıklanmayan yeni mitokondriyal aday proteinlerin zenginleştirme verimleri (toplam hücrelerin katı). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65252/65252fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Tag-Free Isolation of Mitochondria for Improved Protein Discovery and Quantification at JoVE.com

Proteom ölçeğinde protein keşfi ve nicelleştirmesi ile uyumlu yüksek kaliteli mitokondri izolasyonu için iki aşamalı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz genetik mühendisliği gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir birincil hücre ve dokudan mitokondri incelemek için uygundur.

Most physiological and disease processes, from central metabolism to immune response to neurodegeneration, involve mitochondria. The mitochondrial ...

Laboratuvarımız mitokondri ve enerji metabolizmasındaki değişiklikleri ve bunların bağışıklık aktivasyonu, kanser veya metabolik bozukluklar gibi hem sağlıklı hem de patolojik süreçleri nasıl etkilediğini incelemektedir. Amacımız, mitokondriyal fonksiyon ve enerji metabolizmasının daha iyi anlaşılmasını sağlayarak çok çeşitli bozukluklara yeni tedaviler geliştirilmesine yardımcı olmaktır. Kütle spektrometrisine dayalı proteomik, metabolomik ve CRISPR-Cas9 genetik ekranları gibi araçlar, belirli hücre tiplerinde ve ortamlarında hem mitokondriyal fonksiyondaki hem de enerji metabolizmasındaki moleküler mekanizmaları tanımlamak için daha popüler hale gelmektedir.Diğer yöntemlerin aksine, protokolümüz mitokondriyal izolasyon için diferansiyel santrifüjleme ve bağışıklık yakalama olmak üzere iki saflaştırma adımı kullanır. Bu, kirleticilerin daha iyi giderilmesi gibi çeşitli avantajlar sunar ve aynı zamanda yeni mitokondriyal proteinleri tanımlamak için güçlü bir araçtır. Protokolümüz, kompozisyon ve dolayısıyla farklı hücre tipleri ve ortamlarında mitokondriyal fonksiyon hakkında fikir verir.Bu, bağışıklık aktivasyonu gibi normal süreçleri daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir, aynı zamanda kanser gibi patolojik süreçleri de daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir. Mitokondriyal makrofajlara odaklanacağız. İşlevlerini daha iyi anlamak için bağışıklık tepkisi sırasında mitokondri bileşiminin nasıl değiştiğini test edeceğiz.Bulgularımız, örneğin anti-enflamatuar etkileri olan ilaçların geliştirilmesine yol açabilir.

two-step-tag-free-isolation-mitochondria-for-improved-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Two-Step Tag-Free Isolation of Mitochondria for Improved Protein Discovery and Quantification

4.2K Görüntüleme.  University of Lausanne. Laboratuvarımız mitokondri ve enerji metabolizmasındaki değişiklikleri ve bunların bağışıklık aktivasyonu, kanser veya metabolik bozukluklar gibi hem sağlıklı hem de patolojik süreçleri nasıl etkilediğini incelemektedir. Amacımız, mitokondriyal fonksiyon ve enerji metabolizmasının daha iyi anlaşılmasını sağlayarak çok çeşitli bozukluklara yeni tedaviler geliştirilmesine yardımcı olmaktır. Kütle spektrometrisine dayalı proteomik, metabolomik ve CRISPR-Cas9 g...

Video: Yazar Spotlight: Gelişmiş Protein Keşfi ve Miktar Tayini için Mitokondrinin İki Adımlı Etiketsiz İzolasyonu  

Most physiological and disease processes, from central metabolism to immune response to neurodegeneration, involve mitochondria. The mitochondrial proteome is composed of more than 1,000 proteins, and the abundance of each can vary dynamically in response to external stimuli or during disease progression. Here, we describe a protocol for isolating high-quality mitochondria from primary cells and tissues. The two-step procedure comprises (1) mechanical homogenization and differential centrifugation to isolate crude mitochondria, and (2) tag-free immune capture of mitochondria to isolate pure organelles and eliminate contaminants. Mitochondrial proteins from each purification stage are analyzed by quantitative mass spectrometry, and enrichment yields are calculated, allowing the discovery of novel mitochondrial proteins by subtractive proteomics. Our protocol provides a sensitive and comprehensive approach to studying mitochondrial content in cell lines, primary cells, and tissues.

We present a two-step protocol for high-quality mitochondria isolation that is compatible with protein discovery and quantification at a proteome scale. Our protocol does not require genetic engineering and is thus suitable for studying mitochondria from any primary cells and tissues.

Biyoloji

Crude Mitochondrial Fraction Preparation

Begin by aspirating the media from the plates containing adherent raw 264.7. Add 10 milliliters of PBS per 15 centimeter plate. Use a cell scraper to detach the cells and pull them into a single 50 milliliter tube.Pipette the cell suspension up and down to homogenize. Next, transfer 5%of the cell suspension volume into a new 1.5 milliliter tube. Centrifuge at 300G for five minutes at room temperature.Discard the supernatant and place the total cell fraction pellet on ice. After centrifuging the remaining suspension as described previously, aspirate the supernatant and re-suspend the cell pellet in five milliliters of ice cold mitochondria buffer. Centrifuge the suspension at 300G for five minutes at four degrees Celsius.Re-suspend the pellet in 0.5 milliliters of cold mitochondrial buffer. And transfer the suspension to a 1.5 milliliter tube. Next, homogenize the suspension, bypassing it 30 times through a 25 gauge needle fitted to a one milliliter syringe.Then add one milliliter of cold mitochondria buffer to the tube and mix by inversion. After centrifuging the cells, transfer one milliliter of the supernatant to a fresh tube on ice. Re-suspend the pellet in the buffer and homogenize the pellet by passing through a 25 gauge needle fitted to a one milliliter syringe.Pull the homogenized cell pellets and the supernatant from the previous steps into a single 1.5 milliliter tube. Centrifuge it at 2, 000G for five minutes at four degrees Celsius. Collect the the supernatant and divide it into four 1.5 milliliter tubes.Make up the volume in each tube to 1.5 milliliters using mitochondrial buffer. Invert the tubes to mix their contents and then centrifuge the tubes. Carefully remove the supernatant and the upper white cellular pellet.Keep one of the four tubes containing the brown mitochondrial pellet on ice as a crude mitochondrial fraction. Pull the remaining pellets into a new tube and make the final volume one milliliter with mitochondria buffer. Using this protocol, total cells and crude mitochondrial fractions were obtained from the raw 264.7 macrophage cell line and BMDM.Immuno blood analysis showed that the mitochondrial citrate synthase was enriched in the crude fraction. Proteins from cytosol, plasma membrane, nucleus, lysosome, and endoplasmic reticulum disappeared. Proteome analysis showed an enrichment of more than tenfold in the crude fraction.The other six cellular compartments were depleted during purification.

Ham Mitokondriyal Fraksiyon Hazırlığı

Superparamagnetic Antibody-Based Mitochondrial Purification

Begin by transferring one milliliter crude fraction of RAW 264.7 mitochondria into a 15-milliliter conical tube. Add 7 milliliters of salted mitochondrial buffer supplemented with 150 millimolar sodium chloride. To the suspension, add 50 microliters of TOM22 beads and then incubate the tube on a rotating wheel at low speed.Place a column on the magnet and equilibrate the column with eight milliliters of salted mitochondrial buffer. Discard the flow-through. After sample incubation, transfer it to the column and discard the flow-through.Next, wash the column three times with eight milliliters of salted mitochondrial buffer. Remove the column from the magnet and place it in a 15-milliliter conical tube. To elute the mitochondria, add 1.5 milliliters of salted mitochondrial buffer and immediately apply a plunger to elute the purified fraction into the tube.Transfer the eluted fraction to a new 1.5-milliliter tube and perform centrifugation at 21, 000G for 10 minutes at 4 degrees Celsius. Discard the supernatant formed and store the brown pure mitochondrial pellet at 20 degrees Celsius for future studies. Immunoblot analysis of the purified mitochondrial extracts showed enrichment of mitochondrial citrate synthase and depletion of proteins from other cell organelles.Mitochondrial integrity studies using electron microscopy revealed mitochondria with a classic oval shape and intact cristae surrounded by electron-dense antibody-coated beads. Further, proteome analysis showed enrichment of mitochondrial proteins and two distinct populations corresponding to mitochondrial and non-mitochondrial proteins.