Başlamak için, hücreleri 75 santimetre karelik bir kültür şişesinde tutun. Kültür ortamını aspire edin ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile durulayın. Daha sonra, yapışma hücrelerini ayırmak için iki mililitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin.
Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin ve hücreleri 10 mililitre ortamda tekrar süspanse edin. Daha sonra, şişedeki hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 480 G'de santrifüjleyin ve ortamı aspire edin.
Hücreleri, kültürün orijinal birleşimine bağlı olarak 5 ila 10 mililitre ortamda yeniden süspanse edin. 100 mikrolitre hücreyi çıkarın ve 100 mikrolitre% 0.4tripan mavisi içeren 1.5 mililitrelik bir tüpe ekleyin. Hücreleri hemositometreye ekleyin ve mikroskop altında gözlemleyerek ve manuel çetele sayacını kullanarak sayın.
Hücreleri, fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamında mililitrede üç kez 10 ila dördüncü hücreye seyreltin. Üreticinin talimatlarına göre poli-D-lizin kaplı kapak kayması ile altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 2,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede ve nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 karbondioksitte büyüterek hücrenin örtü kızağına bağlanmasını sağlayın.
Ertesi gün, 20X objektif kullanarak ters mikroskop altında hücre ekini inceleyin. Arıtma stoğu çözeltilerini istenen konsantrasyonlarda hazırlayın ve yalnızca ortam kontrolü, test bileşiği ile eşleşen bir konsantrasyonda yalnızca araç kontrolü ve iyonofor FCCP ve test bileşikleri ile bir kontrol oluşturun. Her seferinde bir kapak fişi ile çalışarak, çalışma altındaki durum için hücrelere 1.8 mililitre ortam ekleyin.
Kontrol veya test bileşiği ile muamele edilen hücreleri, nemlendirilmiş bir ortamda 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte istenen süre boyunca inkübe edin. Tedavi süresinden sonra hücrelere 200 mikrolitre 10X TMRE ilave edilir. % 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir ortamda 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika inkübe edin.
Ortamı nazikçe aspire edin ve arka plan girişimini en aza indirmek için hücreleri PBS ile iki kez durulayın. Ardından, kapak kızağını tedavi koşullarıyla etiketlenmiş bir mikroskop lamı üzerine ters çevirin. Hücrelerin 549 nanometre uyarılma ve 575 nanometre emisyonda yaşadığını hayal edin.
Hücre bütünlüğü kaybolmadan önce yüksek hızlı görüntü yakalama ile birkaç Z-yığını alanını yakalamak için konfokal bir mikroskop kullanın. Görüntü dosyasını daha sonra analiz etmek üzere kaydedin ve saklayın. Aktif mitokondriye sahip hücreler TMRE boyamasını korudu ve yüksek floresan gösterdi.
Depolarize veya inaktif mitokondriler membran potansiyelini azaltır, TMRE'yi tutamaz ve düşük floresan sinyali gösterir.
