Kontrol ve etoposid ile muamele edilmiş germinal vezikül veya GV oositlerini, oda sıcaklığında 40 dakika boyunca PFA-Tx 100 tamponlu farklı plastik doku kültürü kaplarına yerleştirin. Oositleri oda sıcaklığında üç farklı 50 mikrolitrelik yıkama tamponunda durulayın ve bir saat boyunca sıcak bir blok üzerinde 25 mikrolitre bloke edici tampona yerleştirin. Ardından, gama H2AX'i tanıyan birincil antikoru hazırlayın.
Birincil antikoru bloke edici tampon ile bir ila 200 oranında seyreltin ve oositleri gece boyunca dört santigrat derecede 15 mikrolitrelik damlalara daldırın. Yumurtaları üç farklı 50 mikrolitrelik yıkama tamponunda yıkayın. Alexa Fluor 488 konjuge büyüme anti-tavşan ikincil antikorunu hazırlayın.
Bloke edici tampon ile seyreltildikten sonra, oositleri ışıktan korunan 37 santigrat derece sıcak bir blok üzerinde bir saat boyunca 15 mikrolitrelik antikor damlalarına daldırın. Uzak kırmızı bir floresan DNA boyası olan DRAQ7'yi alın ve oositleri üç farklı yıkama tamponu ile yıkamadan önce karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ona aktarın. Konfokal mikroskopi için 35 milimetrelik cam tabanlı bir Petri kabındaki oositlere küçük damlalar yıkama tamponu ekleyin.
Lazer denetleyiciyi ve konfokal sistemdeki lazerleri açın. Mikroskop denetleyicisini ve lambaları açtıktan sonra, konfokal yazılımı açın ve 40X yağ lensini seçin. Yumurtaların bulunduğu kabı numune tutucuya yerleştirin ve joystick'i kullanarak sahneyi X, Y ve Z eksenlerinde hareket ettirerek oositlere odaklanmaya çalışın.
Herhangi bir doygunluğu en aza indirmek için lazer gücünü, kazancı ve iğne deliği boyutunu her deney için bağımsız olarak ayarlayın. Her oosit için, ilgilenilen alanı özellikle DNA alanındaki çekirdeğe ayarlayın. DNA alanının sınırlarını tanımlayın ve Z adım boyutunu üç mikrometreye ayarlayın.
Ardından taramaya başlayın. Seçili klasördeki her hücre için görüntüleri kaydedin. ImageJ yazılımını açın ve resme, ardından renge ve bölünmüş kanallara tıklayın.
Tüm kanalları bölmek için. Arama tablosuna tıklayın ve her kanal için tercih edilen renkleri seçin Gama H2AX ve DNA kanallarını birleştirmek için görüntü, renk ve birleştirme kanallarına tıklayın. Yüksek düzeyde DNA hasarına sahip etrafı sarılmış nükleolus oositlerinde, görüntüye, yığınlara, Z-projesine tıklayın ve serbest seçimler komutuyla tüm DNA alanını seçin.
Gama H2AX floresansını ölçmek için analize ve ardından ölç'e tıklayın ve ölçümleri bir Excel dosyasına kopyalayın. Çevrelenmiş nükleolus GV evresindeki gama H2AX floresansı, etoposid tedavisinden sıfır saat sonra oositler bu şekilde gösterilmiştir. Gama H2AX, tüm etoposid konsantrasyonlarında maruziyetten hemen sonra artar ve artış konsantrasyona bağlıdır.
Etrafı sarılmış nükleolus GV evresindeki gama H2AX floresansı, etoposid tedavisinden 20 saat sonra oositler burada gösterilmektedir. Gamma H2AX, tüm etoposid konsantrasyonlarında maruziyetten 20 saat sonra azalır. Uzun süreli faz durmasından sonra, GV evresi oositleri, gama H2AX odaklarının sayısını ve yoğunluğunu azaltma kapasitesini gösterdi, bu da GV evresinde tutuklanan oositlerde aktif onarım süreçlerinin varlığını ima etti.
