Bu çalışmaya, "Araştırma ve Yenilik Altyapısının Güçlendirilmesi" Eylemi kapsamında uygulanan, "Rekabetçilik, Girişimcilik ve Yenilikçilik" (NSRF 2014-2020) Operasyonel Programı tarafından finanse edilen ve Yunanistan ve Avrupa Birliği (Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu) tarafından ortaklaşa finanse edilen "Biyomedikal Araştırmalarda 'kapasite geliştirme' altyapılarının kurulması (BIOMED-20)" (MIS 5047236) projesinden destek alıyoruz.

Tüm fare deneyleri yerel makamlar (Yanya Bölgesi, Yunanistan) tarafından onaylanmış ve 2010/63/EU sayılı Avrupa Toplulukları Konseyi Direktiflerine uygun olarak yürütülmüştür. Deneyler 3R'nin ilkelerine göre yapılmıştır. Deneyler için kullanılan tüm CD-1 fareleri, Yunanistan'daki Yanya Üniversitesi'nin hayvan barınağı tesisinde, kontrollü sıcaklık (22 °C) ve nem (%60) olan bir odada tutuldu ve ad libitum ile beslendi. Hayvan barınağı, üreme (EL33-BIObr01), tedarik (EL33-BIOsup01) ve deneyler (EL33BIO-exp01) için bir tesis işletme lisansına sahiptir.
1. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) tozunu (Malzeme Tablosuna bakınız) dimetil sülfoksit (DMSO) içinde seyreltin ( Malzeme Tablosuna bakınız) 200 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar. 10 μL alikot ekleyin ve −20 °C'de saklayın. Çözümü 1 ay içinde kullanın. NOT: IBMX tozu −20 °C'de tutulur.</li>
	<li>Tüm immünofloresan tamponları hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.<ol><li>Bir PBS tabletini (Malzeme Tablosuna bakınız) 200 mL ddH2Ο içinde seyrelterek steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.</li>
		<li>80 mL ddH 2 Ο, 0.59575 g HEPES, 1.81422 g PIPES, 0.38035 g EGTA ve 0.04066 g MgCl2ekleyerek PHEM tamponu yapın (Malzeme Tablosuna bakın) manyetik bir karıştırıcı ile çalkalarken (Malzeme Tablosuna bakın) ve aynı anda pH 6.9'a ulaşana kadar NaOH ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) (pH / ORP ölçer kullanarak kontrol edin [Malzeme Tablosuna bakın]). Ardından, 100 mL'lik bir son hacme ddH2Ο ekleyin.</li>
		<li>%4 PFA'lık bir son konsantrasyonda ısıtma altında manyetik bir karıştırıcı ile çalkalarken PFA tozunu (Malzeme Tablosuna bakın) PHEM tamponunda seyrelterek paraformaldehit-Triton-X-100 (PFA-Tx-100) tamponu hazırlayın. Ardından, bir şırınga ve 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak tamponu süzün (Malzeme Tablosuna bakın) ve %0,5 Tx-100 ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Bir deney için yeterli olan yaklaşık 10 mL PFA-Tx-100 (0.4 g PFA, 50 μL Tx-100) hazırlayın. 4 °C'de en fazla 1 hafta saklayınız. DİKKAT: PFA'yı kullanmak için eldiven giyin ve cilt ve gözlerle temasından kaçının.</li>
		<li>PBS'de sığır serum albümini (nihai konsantrasyon:% 0.5 w / v BSA) ekleyerek yıkama tamponu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve mekanik olarak çalkalayın. Mantar ve bakteriyel kontaminasyon riskini en aza indirmek için 1:1.000 seyreltmede %10 w/v NaN3 tamponu (sodyum azid) ekleyin. 10 mL ddH2O'ya 1 g NaN 3 tozu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek% 10 w / vNaN 3 tamponu yapın; NaN3 tamponunu oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>PBS'ye BSA (son konsantrasyon: %3 w/h) ekleyerek ve mekanik olarak çalkalayarak bloke edici tampon hazırlayın. 1:1.000 seyreltmede %10 NaN3 tamponu ekleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Diseke yumurtalıklardan GV oositlerinin toplanması ve DSB'lerin indüksiyonu
NOT: Tüm aletler ve solüsyonlar steril olmalıdır. Oosit kullanımı, stereo mikroskop altında bir ağız pipeti kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu) ve tüm damlalar mineral yağ ile kaplanır (bkz. Malzeme Tablosu ve Şekil 1E).
<ol><li>Fareleri servikal çıkık ile itlaf etmeden 46-48 saat önce 7 uluslararası birim (IU) hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile farelere intraperitoneal olarak enjekte edin. NOT: Kullanılan tüm fareler 8-12 haftalık olmalıdır.</li>
	<li>M2 kültür ortamını bir şırınga ve 0.2 μm'lik bir filtre ile filtreleyin ve oositleri faz I'de tutmak için 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpte (Malzeme Tablosuna bakınız) 200 μM'lik bir nihai konsantrasyona IBMX 200 mM ekleyin. Daha sonra, plastik bir doku kültürü kabında M2-IBMX besiyeri damlaları hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın) ve oosit izolasyonundan önce en az 30 dakika boyunca 37 ° C'de sıcak bir blok üzerine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). M2'yi 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Fareleri servikal çıkık ile feda edin, yumurtalıkları inceleyin ve M2-IBMX ile 5 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.</li>
	<li>Yumurtalıkları 1.5 mL M2-IBMX içeren plastik bir kapağa aktarın, peri-yumurtalık yağ dokusunu veya fallop tüpü segmentlerini çıkarın ve 27 G'lik bir iğne ile yumurtalıkların mekanik perforasyonu ile COC'leri serbest bırakın (bkz. Malzeme Tablosu ve Şekil 1A-C).</li>
	<li>COC'leri M2-IBMX damlaları (her biri yaklaşık 25-30 μL) içeren bir kültür kabına aktarın ve dar delikli bir cam Pasteur pipeti kullanarak tekrarlanan pipetleme yoluyla kümülüs hücrelerini çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu ve Şekil 1D).</li>
	<li>SN GV aşamalı oositleri seçin ve bunları ışıktan korunan 37 ° C'de sıcak bir blok üzerinde bir damla (25 μL) M2-IBMX ortamına aktarın (Şekil 1F).<ol><li>Çekirdeklerin periferik olarak konumlandırıldığı NSN oositlerinin aksine, daha büyük boyutlarına ve merkezi olarak yerleştirilmiş çekirdeklerine göre SN oositlerini arayın21. Her durumda, GV oosit tipi (SN veya NSN) hakkında nihai kararı vermeden önce DNA konfigürasyonunu konfokal mikroskop altında gözlemleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Etoposid kullanarak DSB'leri indükleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). GV aşamalı oositleri, karanlık koşullarda 37 ° C'de sıcak blok üzerinde 1 saat boyunca genotoksik ajanın damlalarına (her biri 25 μL) yerleştirin. NOT: Etoposit, DSB'leri DNA22'ye tanıtan bir topoizomeraz II inhibitörüdür. Etoposidi oda sıcaklığında 20 mg / mL'lik 10 μL'lik alikotlarda ışıktan koruyun. Test edilen konsantrasyonlar 5 μg/mL, 20 μg/mL ve 50 μg/mL'dir.</li>
	<li>GV evresi oositlerini uzun süre tutuklu tutmak için, oositleri 37 ° C ve% 5 CO2'de bir inkübatörde (Malzeme Tablosuna bakınız) 400 μM IBMX ile desteklenmiş M16 kültür ortamının damlalarına (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin. M16'yı 4 °C'de saklayın, ortamı bir şırınga ve 0.2 μm filtre ile filtreleyin ve kullanmadan önce en az 1 saat inkübe edin.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig01.jpg"> Şekil 1: Oosit izolasyon işlemi . (A) Peri-overian yağ dokusunun ve artık fallop tüpü segmentlerinin M2 besiyerinde yumurtalıklardan IBMX ile çıkarılması. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen fotoğraf. Ölçek çubuğu = 1 mm. (B) IBMX ile M2 ortamında izole yumurtalıklar. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = 1 mm. (C) IBMX ile M2 ortamında 27 G iğne kullanılarak yumurtalıkların mekanik delinmesi. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = 1 mm. (D) IBMX ile M2 ortamında perforasyon sonrası yumurtalıklardan salınan COC'ler. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (E) Ağız pipeti kullanılarak oosit toplama. (F) Çevredeki kümülüs hücrelerinin çıkarılmasından sonra, IBMX ile M2 ortamında denuded oositler. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
3. Oosit fiksasyonu ve immünofloresan
NOT: Oosit kullanımı, stereo mikroskop altında bir ağız pipeti kullanılarak gerçekleştirilir ve tüm damlalar mineral yağ ile kaplanır.
<ol><li>Kontrol ve etoposid ile muamele edilmiş GV oositlerini oda sıcaklığında 40 dakika boyunca PFA-Tx-100 tamponlu farklı plastik doku kültürü kaplarına yerleştirin.</li>
	<li>Oositleri oda sıcaklığında üç farklı damla yıkama tamponunda (her biri 50 μL) yıkayın. Yumurtaları her damlada 5 dakika bekletin.</li>
	<li>Oositleri, 37 ° C'de sıcak bir blok üzerinde 1 saat boyunca bloke edici tampon damlalarına (her biri 25 μL) yerleştirin.</li>
	<li>γH2AX'i (tavşan fosfo-Η2ΑΧ) (Ser139) tanıyan birincil antikoru hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) (stok çözelti: 1 mg / mL). Bloke edici tamponda 1:200 seyreltme kullanın ve oositleri gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor damlalarına (her biri 15 μL) yerleştirin. NOT: Fosfo-Η2ΑΧ (γH2AX), hem somatik hücrelerde hem de GV oositlerinde DSB'leri tespit etmek için yaygın bir belirteçtir18,23.</li>
	<li>Ertesi gün, yumurtaları oda sıcaklığında üç farklı damla yıkama tamponunda (her biri 50 μL) yıkayın. Yumurtaları her damlada 5 dakika bekletin.</li>
	<li>İkincil antikoru, Alexa Fluor 488-konjuge keçi anti-tavşanını hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) (stok çözelti: 2 mg / mL). Bloke edici tamponda 1:200 seyreltme kullanın ve oositleri 37 ° C'de ışıktan korunan sıcak bir blok üzerinde 1 saat boyunca ikincil antikor damlalarına (her biri 15 μL) yerleştirin.</li>
	<li>Oositleri, yalnızca geçirgen hücrelerde DNA'yı boyayan çok kırmızı bir floresan DNA boyası olan DRAQ7 damlalarına (her biri 25 μL) aktarın (stok çözelti: 0.3 mM; Malzeme Tablosuna bakınız). Karanlık koşullarda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkama tamponunda 1:250 seyreltme kullanın.</li>
	<li>Oositleri oda sıcaklığında üç farklı damla yıkama tamponunda (her biri 50 μL) yıkayın. Her damlada 5 dakika bekletin ve ardından konfokal mikroskopi için 35 mm'lik cam tabanlı bir Petri kabında (Malzeme Tablosuna bakınız) küçük damlalara (her biri yaklaşık 5 μL) yıkama tamponuna aktarın (Şekil 2A). NOT: Hem DNA boyasının hem de ikincil antikorun yıkanması aynı anda gerçekleştirilir.</li>
</ol>4. Konfokal mikroskopi
NOT: Oositlerin cam tabanlı tabaklara yerleştirilmesinden sonra floresan yoğunluğundaki azalmayı önlemek için hemen konfokal mikroskopi yapılmalıdır. Motorlu bir aşamaya sahip bir konfokal mikroskoba ( Malzeme Tablosuna bakınız) erişim gereklidir.
<ol><li>Mikroskop kurulumu<ol><li>Konfokal sistemde, lazer denetleyiciyi, lazerleri, mikroskop denetleyiciyi, iletilen ışık için lambaları ve PC'yi açın (Şekil 2B, D).</li>
		<li>Konfokal yazılımı açın ve 40x yağ lensini seçin.</li>
		<li>Çanağı numune tutucuya yerleştirin ve joystick'i kullanarak sahneyi XY ve Z eksenlerinde hareket ettirerek oositlere odaklanmaya çalışın (Şekil 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Oositlerin taranması<ol><li>Herhangi bir doygunluğu en aza indirmek için lazer gücünü, kazancı ve iğne deliği boyutunu her deney için bağımsız olarak ayarlayın.</li>
		<li>Her oosit için, ilgilenilen alanı, özellikle DNA bölgesindeki çekirdeğe ayarlayın. DNA alanının sınırlarını tanımlayın ve z adım boyutunu 3 μm olarak ayarlayın. Ardından, taramayı başlatın.</li>
		<li>Seçili klasördeki her hücre için görüntüleri kaydedin.</li>
		<li>Tarama tamamlandığında, yazılımdan çıkın, bilgisayarı kapatın ve lazer denetleyicisini, lazerleri, mikroskop denetleyicisini ve iletilen ışık için lambaları kapatın.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig02.jpg"> Şekil 2: Konfokal mikroskopi. (A) İmmünofloresan protokolü ve DNA boyaması yapıldıktan sonra, ayrı damla yıkama tamponunda, mineral yağ ile kaplanmış, cam tabanlı bir tabağa yerleştirilmiş ve konfokal mikroskopi görüntüleme için hazırlanmış sabit oositler. Her damla farklı bir deney kategorisi içerir. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = yakınlaştırılmış kısım için 1 mm/100 μm. (B) Konfokal mikroskop tablasına yerleştirilmiş cam tabanlı plaka. (C) Konfokal mikroskopi ile elde edilen oositlerin parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (D) Konfokal mikroskopi sistemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
5. Görüntüleme analizi
<ol><li>Fiji ImageJ-win64'ü tarayıcıya (https://imagej.net/software/fiji/downloads) indirin, açın ve verileri TIFF yığın dosyaları olarak içe aktarın. NOT: Her oosit dosyasını ayrı ayrı açın.</li>
	<li>Resmin üzerine tıklayın | Renk | Tüm kanalları bölmek için Kanalları Böl.</li>
	<li>LUT'a (Tabloya Bak) tıklayın ve her kanal için tercih edilen renkleri seçin.</li>
	<li>Resmin üzerine tıklayın | Renk | γΗ2ΑΧ ve DNA kanallarını birleştirmek için Kanalları Birleştir. Brightfield kanalını birleştirmeden bırakın.</li>
	<li>NSN oositlerinde ve düşük DNA hasarı olan SN oositlerinde, γΗ2ΑΧ DNA bölgesinde odaklar olarak tespit edilir. Bu durumda, " Çok noktalı" veya nokta komutuna tıklayın ve DNA ile çakışan her γΗ2ΑΧ odağını seçin. Tüm yığınlar için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Yüksek düzeyde DNA hasarı olan SN oositlerinde, γΗ2ΑΧ sinyali tüm DNA bölgesi boyunca dağılır. Bu durumda, üzerine tıklayın Resim | Yığınlar | Z projesini seçin ve Freehand seçimleri komutuyla tüm DNA alanını seçin.</li>
	<li>γΗ2ΑΧ floresansını ölçmek için Analiz Et | Ölçün ve ölçümleri bir .xlsx dosyasına kopyalayın. Ardından, ortalama floresansı hesaplayın, değerleri normalleştirin ve herhangi bir grafik oluşturmadan önce odak sayısını sayın.</li>
	<li>Analiz Et'e tıklayın | Ölçeği ayarlamak için Ölçeği Ayarla ve ardından Analiz | Araçlar | Kanallara ölçek çubuğu eklemek için Ölçek çubuğu.</li>
</ol>

Farelerin Profaz Tutuklu Oositlerinde DNA Hasarının Belirlenmesi

<ol>
	<li>Wang, X., Pepling, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+meiotic+prophase+one+in+mammalian+oocytes.">Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306 (2021).</li><li>Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+prophase+I+meiotic+arrest+maintenance+and+meiotic+resumption+in+mammalian+oocytes.">Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes.</a> Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).</li><li>Adhikari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+phosphorylation+of+Cdk1+mediates+prolonged+prophase+I+arrest+in+female+germ+cells+and+is+essential+for+female+reproductive+lifespan.">Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan.</a> Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).</li><li>Sun, S. C., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+asymmetric+division+in+oocytes.">Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).</li><li>Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+egg+activation:+From+Ca2++spiking+to+cell+cycle+progression.">Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression.</a> Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).</li><li>Solc, P., Schultz, R. M., Motlik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophase+I+arrest+and+progression+to+metaphase+I+in+mouse+oocytes:+comparison+of+resumption+of+meiosis+and+recovery+from+G2-arrest+in+somatic+cells.">Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells.</a> Molecular Human Reproduction. 16 (9), 654-664 (2010).</li><li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antral+follicles:+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+(electron+microscopic+and+autoradiographic+data).">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Molecular Reproduction and Development. 41 (4), 479-485 (1995).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+nonsurrounded+nucleolus+and+surrounded+nucleolus+oocytes+on+chromatin+accessibility+using+ATAC-seq.">Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq.</a> Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).</li><li>Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully-mature+antral+mouse+oocytes+are+transcriptionally+silent+but+their+heterochromatin+maintains+a+transcriptional+permissive+histone+acetylation+profile.">Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+human+nonhomologous+DNA+end+joining.">The mechanism of human nonhomologous DNA end joining.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 1-5 (2008).</li><li>Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+by+end+joining.">Repair of double-strand breaks by end joining.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Shibata, A., Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+the+DNA-PK+complex+and+53BP1+in+protecting+ends+from+resection+during+DNA+double-strand+break+repair.">Roles for the DNA-PK complex and 53BP1 in protecting ends from resection during DNA double-strand break repair.</a> Journal of Radiation Research. 61 (5), 718-726 (2020).</li><li>Mohiuddin, I. S., Kang, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PK+as+an+emerging+therapeutic+target+in+cancer.">DNA-PK as an emerging therapeutic target in cancer.</a> Frontiers in Oncology. 9, 635 (2019).</li><li>Marangos, P., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+progress+beyond+prophase+in+the+presence+of+DNA+damage.">Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage.</a> Current Biology. 22 (11), 989-994 (2012).</li><li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage.">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li><li>Bakkenist, C. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+activates+ATM+through+intermolecular+autophosphorylation+and+dimer+dissociation.">DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation.</a> Nature. 421 (6922), 499-506 (2003).</li><li>Marangos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+metaphase+I+arrest+is+mediated+by+the+spindle+assembly+checkpoint+and+maternal+age.">DNA damage-induced metaphase I arrest is mediated by the spindle assembly checkpoint and maternal age.</a> Nature Communications. 6, 8706 (2015).</li><li>Lavrentyeva, E. A., Shishova, K. V., Zatsepina, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+nuclear+dynamics+in+mouse+GV+oocytes+with+a+diverse+chromatin+configuration.">Differences in nuclear dynamics in mouse GV oocytes with a diverse chromatin configuration.</a> Biology Bulletin Russian Academy of Sciences. 46, 332-341 (2019).</li><li>Montecucco, A., Zanetta, F., Biamonti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+etoposide.">Molecular mechanisms of etoposide.</a> EXCLI Journal. 14, 95-108 (1998).</li><li>Mayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+during+mouse+oocyte+maturation.">DNA damage response during mouse oocyte maturation.</a> Cell Cycle. 15 (4), 546-558 (2016).</li><li>Olive, P., Ban&#225;th, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature Protocols. 1, 23-29 (2006).</li><li>Wu, D., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXOSC10+sculpts+the+transcriptome+during+the+growth-to-maturation+transition+in+mouse+oocytes.">EXOSC10 sculpts the transcriptome during the growth-to-maturation transition in mouse oocytes.</a> Nucleic Acids Research. 48 (10), 5349-5365 (2020).</li><li>Simon, L., Emery, B., Carrell, D., Agarwal, A., Henkel, R., Majzoub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage:+COMET+assay.">DNA damage: COMET assay.</a> Manual of Sperm Function Testing in Human Assisted Reproduction. , 202-212 (2021).</li></ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Burada açıklanan yöntemi kullanarak, memeli oositlerinde DSB'leri tespit ettik. Bu yöntem, oositlerdeki DNA onarım sürecinin saptanmasına ve incelenmesine izin verir. Aynı protokol, memeli oositlerinde fizyolojik süreçlere katılan diğer proteinleri analiz etmek için de kullanılabilir. İnsanlarda kadın subfertilitesinin nedenini daha iyi anlamak için oositlerin potansiyel DNA hasarına nasıl tepki verdiğini incelemek önemlidir.
Memeli oositlerinde DNA hasar tepkisini incelemek, oositlerin duyarlılığı nedeniyle zor olabilir. Oosit kullanımı, belirli sıcaklıklar ve CO2 ve O2 konsantrasyonları gerektirir. Aynı zamanda yumurtalar ışıktan korunmalıdır. Αll kullanımı, oositler için zararlı olabileceğinden, aynı zamanda ortamın seyrelmesine neden olabileceğinden ve dolayısıyla fiksasyon prosedürünü olumsuz etkileyebileceğinden, dar olmayan cam pipetler kullanılarak yapılmalıdır. Fiksasyonun her adımında, seyreltme etkisini en aza indirmek için birkaç damla tampon kullanılır. DSB'leri gözlemlemenin alternatif bir yolu Comet testi24'tür. Bu teknik daha hassas olmasına rağmen daha karmaşıktır. Aynı zamanda, Comet tahlilini kullanarak, hasarın meydana geldiği DNA bölgesini tam olarak tespit etmek mümkün değildir ve GV evresi oositler25 gibi bol miktarda RNA molekülüne sahip hücrelerde, arka plan arttırılabilir ve bu da yanlış bir DNA hasar sinyalineyol açabilir 26.
Burada açıklanan immünofloresan protokolünü kullanarak, DSB'leri doğru bir şekilde tespit edebilir ve zaman içinde γH2AX floresansındaki azalma ile gösterildiği gibi GV evresi oositlerdeki onarım ilerlemesini tahmin edebiliriz. Bununla birlikte, bu yöntemin bir sınırlaması, bazı antikorların ooplazma boyunca spesifik olmayan dağılım gösterebilmesi ve böylece yüksek arka plan floresansına sahip görüntülere yol açabilmesidir. PFA-Tx-100 tamponu, daha az arka plan ve spesifik olmayan floresan tespitine izin vererek fiksasyon sürecini iyileştirdiğini gözlemlediğimiz için sıralı PFA ve Tx-100 yerine kullanılır. DSB tespiti için γH2AX kullanmanın ikinci bir sınırlaması, mayozbölünme 23'te γH2AX'in kendiliğinden fosforilasyonu nedeniyle GVBD'den sonra hasarın tahmin edilememesidir.
Bu immünofloresan protokolünde, oositler sıvı bir tamponda kalır ve slaytlar içinde saklanamaz. Bu gerçek, ikincil antikorun eklenmesinden sonra sabit hücrelerin günlerce korunmasını zorlaştırır. Kaliteli görüntüler elde etmek ve sinyal kaybı yaşamamak için sekonder antikor eklendikten sonra birkaç saat içinde görüntülemenin yapılması tercih edilir. Ayrıca, çekirdeklerin Z ekseni boyunca taranmasının, aşırı maruz kalma nedeniyle sinyalin zayıflamasına neden olabileceği de unutulmamalıdır. Bu nedenle, lazer gücünü azaltmak ve tarama hızını artırmak tercih edilir.
Son olarak, immünofloresan protokolünün bir diğer sınırlaması, sadece sabit/cansız hücreler için kullanılabilmesidir. Bu nedenle, konsantrasyonlarında herhangi bir dalgalanma olup olmadığını veya zaman içinde davranışlarında değişiklik olup olmadığını bilmeden, yalnızca belirli zaman noktalarında faktörlerin varlığını ve yokluğunu tahmin edebiliriz. Bu sorun, canlı hücre görüntüleme ve floresan etiketli belirteçler kullanılarak aşılabilir.

Memeli dişi üreme hücrelerinde mayoz bölünme süreci, doğumdan önce yumurtalıklarda başlatılır. Toplam oosit sayısı, öncelikle embriyogenez sırasında yumurtalıklarda belirlenir. Oositler mayoz bölünmeye girer ve faz I1'de tutuklanır. Ergenliğin başlamasından ve folikül uyarıcı hormon (FSH) ve luteinize edici hormonun (LH) üretimi ve endokrin etkisinden sonra, oositler mayozbölünmeyi yeniden başlatabilir ve tamamlayabilir 2. İnsanlarda faz tutuklaması 50 yıla kadar sürebilir3. Mayoz I'e girişi takip eden hücre bölünmeleri asimetriktir, bu da küçük bir kutup gövdesi ve boyutunu koruyan bir oosit üretimi ile sonuçlanır. Bu nedenle, çoğu sitoplazmik bileşen, erken embriyogenez sırasında ooplazmada depolanır4. Daha sonra, oositler çekirdeklerini yeniden oluşturmadan veya kromozomlarını yoğunlaştırmadan mayoz II'ye girerler ve döllenme5'e kadar metafaz II'de durmaya devam ederler.
Oositleri somatik hücrelerden ayıran benzersiz bir özellik, oositin GV evre6 olarak adlandırılan sağlam bir çekirdeğe (germinal vezikül [GV] tutuklaması) sahip olduğu faz I'deki durma durumudur. Kromatin organizasyonuna dayanarak, GV evresi oositleri iki kategoriye ayrılır: çevrelenmemiş nükleolus (NSN) ve çevrili nükleolus (SN)7,8. NSN GV evresi oositlerinde, kromatin tüm nükleer bölge boyunca yayılır ve transkripsiyon aktiftir, SN oositlerinde kromatin nükleozu çevreleyen kompakt bir halka oluşturur ve transkripsiyon sessizdir9. Her iki GV evresi oosit türü de mayotik yeterlilik gösterir; mayoza aynı oranda girerler, ancak NSN oositleri düşük gelişim kapasitesi sunar ve iki hücreli evre embriyo10'un ötesine geçemez.
Profaz I tutuklamasının uzamış durumu, DNA hasarı birikimi insidansını arttırır11. Bu nedenle, oositlerdeki DNA hasar yanıt mekanizmaları, genetik bütünlüğe sahip gametlerin üretimine izin vermek ve elde edilen embriyonun fizyolojik bir kromozomal içeriğe sahip olmasını sağlamak için gereklidir.
DNA hasar tepkisinin merkezi bir yönü DNA onarımıdır. Ökaryotik hücrelerde DSB onarımı için ana yollar arasında homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), homolog rekombinasyon (HR) ve alternatif NHEJ12,13,14,15 bulunur. NHEJ daha hızlı ancak hataya daha açık bir mekanizmadır, İK ise tamamlanması için daha fazla zaman gerektirir ancak yüksek sadakate sahiptir16.
Oositlerin DNA hasarı onarımı için kullandıkları mekanizmalar hakkında yeterli bilgi yoktur. Çalışmalar, tam büyümüş memeli oositlerinde etoposit, doksorubisin veya UVB veya iyonlaştırıcı radyasyon gibi genotoksik ajanların kullanımıyla indüklenen DNA hasarının, faz I tutuklamasından çıkış zamanlamasını ve oranlarını etkilemediğini göstermiştir17. Oositler, yüksek hasar seviyelerinin varlığında bile GV yıkımına (GVBD) uğrayabilir. Bu hasar, γH2AX'in gözlemlenmesiyle belirlenebilir. H2AX'in (γΗ2ΑΧ) bu fosforile formu, kırılma bölgesinde bulunan ve kırık uçlarda birikecek faktörlerin ve proteinlerin onarılmasına yardımcı olmak için bir iskele işlevi gören bir DSB belirtecidir18.
DNA hasarını takiben hücre döngüsü durmasının olmaması, onarılmamış DNA'ya sahip oositlerin mayoz bölünmeye yeniden girmesine izin veren yetersiz DNA hasarı kontrol noktasından kaynaklanmaktadır. Yüksek düzeyde DNA hasarını takiben, bir kontrol noktası, ATM / Chk1'e bağlı bir yolun aktivasyonu yoluyla faz durmasını koruyabilir. DSB'lere sınırlı kontrol noktası yanıtı, ATM17,19'un sınırlı aktivasyonundan kaynaklanmaktadır. Mayoz I'in M fazında, araştırmalar, DNA hasarının, E3 ubikitin ligaz anafaz teşvik edici kompleks/siklozomun aktivasyonunu önleyen bir iğ montaj kontrol noktasını (SAC) indüklenen mayoz I kontrol noktasını aktive edebileceğini göstermiştir (APC/C) ve dolayısıyla M-fazı çıkışı. Ayrıca, SAC proteinlerinin ablasyonu, M-fazı durması durumunun üstesinden gelir, böylece mayoz I kontrol noktası20'nin kurulmasında SAC'nin öneminin altını çizer.
Önceki araştırmaların açıkça gösterdiği gibi, DSB'ler fare oositlerinde sağlam bir profaz kontrol noktası oluşturamaz. Bu tür bir hasar onarılmazsa, kromozomal anormallikler taşıyan embriyolara yol açabilir. Bu nedenle, oositlerin potansiyel genetik hakaretlerle başa çıkmak için kullandıkları benzersiz yolları daha iyi anlamak için kadın gametogenezinin farklı aşamalarında DNA hasar tepkisini incelemek önemlidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated</td>
			<td>APTACA</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cc syringes</td>
			<td>SoftCare</td>
			<td>114.104.21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-H2A.X (Ser139)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>07-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE Heating Magnetic Stirrer</td>
			<td>VELP Scientifica</td>
			<td>F20500162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO Anhydrous</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>90082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ7 DNA dye</td>
			<td>BioStatus</td>
			<td>DR71000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE MgCl2. 6H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1058330250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etoposide</td>
			<td>CHEMIPHARM</td>
			<td>L01CB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>532057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 150i CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M125 Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>13412H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1064981000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ800N Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm</td>
			<td>DURAN WHEATON KIMBLE</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH/ORP meter&#160;</td>
			<td>Hanna Instruments Ltd</td>
			<td>HI2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG Protein Lyophilised</td>
			<td>Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology)</td>
			<td>GWB-2AE30A (now OPPA01037)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QBD4 Dry block heater</td>
			<td>Grant Instruments (Cambridge) Ltd</td>
			<td>A25218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25 mm 0.2 &#956;m filters</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of dna double-stranded breaks in mouse oocytes

Oositler kadın vücudundaki en büyük ve en uzun ömürlü hücreler arasındadır. Embriyonik gelişim sırasında yumurtalıklarda oluşurlar ve mayoz I'in profazında tutuklanırlar. Hareketsiz durum, oositler büyümek için bir uyaran alana ve mayoza devam etme yetkinliğini elde edene kadar yıllarca sürebilir. Bu uzun süreli tutuklama durumu, onları dişi gametlerin genetik bütünlüğünü ve dolayısıyla gelecekteki embriyonun genetik bütünlüğünü etkileyen DNA'ya zarar veren hakaretlerin birikmesine karşı son derece duyarlı hale getirir. 
Sonuç olarak, DNA hasar yanıt mekanizmalarının kurulması için ilk adım olan DNA hasarını tespit etmek için doğru bir yöntemin geliştirilmesi hayati önem taşımaktadır. Bu makale, 20 saatlik bir süre boyunca faz tutuklu oositlerde DNA hasarının varlığını ve ilerlemesini test etmek için ortak bir protokolü açıklamaktadır. Spesifik olarak, fare yumurtalıklarını inceliyoruz, kümülüs-oosit komplekslerini (COC'ler) alıyoruz, kümülüs hücrelerini COC'lerden çıkarıyoruz ve tutuklama durumunu korumak için oositleri 3-izobütil-1-metilksantin içeren Μ2 ortamında kültürlüyoruz. Daha sonra, oositler, çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler) oluşturmak için sitotoksik, antineoplazmik ilaç, etoposid ile muamele edilir. 
İmmünofloresan ve konfokal mikroskopi kullanarak, histon H2AX'in fosforile formu olan çekirdek protein γH2AX'in seviyelerini tespit ediyor ve ölçüyoruz. H2AX, DNA hasarından sonra DSB'lerin bölgelerinde fosforile olur. Oositlerdeki DNA hasarını takiben DNA bütünlüğünün geri kazanılamaması kısırlığa, doğum kusurlarına ve spontan düşük oranlarının artmasına neden olabilir. Bu nedenle, DNA hasar tepki mekanizmalarının anlaşılması ve aynı zamanda bu mekanizmaları incelemek için sağlam bir yöntemin oluşturulması, üreme biyolojisi araştırmaları için esastır.

The process of meiosis in mammalian female germ cells is initiated in the ovaries before birth. The total number of oocytes is established in the ovaries primarily during embryogenesis. Oocytes enter meiosis and remain arrested at prophase I1. After the onset of puberty and the production and endocrine action of follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), oocytes may reinitiate and complete meiosis2. In humans, prophase arrest can last for up to 50 years3. The cell divisions following the entry into meiosis I are asymmetric, resulting in the production of a small polar body and an oocyte that retains its size. Thus, most cytoplasmic components are stored in the ooplasm during early embryogenesis4. Then, the oocytes enter meiosis II, without reforming their nucleus or decondensing their chromosomes, and remain arrested at metaphase II until fertilisation5.
A unique characteristic that distinguishes oocytes from somatic cells is the state of arrest in prophase I, when the oocyte possesses an intact nucleus (germinal vesicle [GV] arrest), referred to as the GV stage6. Based on the chromatin organization, GV-stage oocytes are classified into two categories: non-surrounded nucleolus (NSN) and surrounded nucleolus (SN)7,8. In NSN GV-stage oocytes, the chromatin spreads throughout the whole nuclear region, and transcription is active, while in SN oocytes, the chromatin forms a compact ring that surrounds the nucleolus, and transcription is silent9. Both types of GV-stage oocytes show meiotic competence; they enter meiosis at the same rate, but the NSN oocytes present low developmental capacity and cannot develop beyond the two-cell stage embryo10.
The protracted state of prophase I arrest increases the incidence of DNA damage accumulation11. Therefore, DNA damage response mechanisms in oocytes are essential for allowing the production of gametes with genetic integrity and for ensuring that the resulting embryo has a physiological chromosomal content.
A central aspect of the DNA damage response is DNA repair. The main pathways for DSB repair in eukaryotic cells include non-homologous end joining (NHEJ), homologous recombination (HR), and alternative NHEJ12,13,14,15. NHEJ is a faster but more error-prone mechanism, while HR requires more time to be completed but has high fidelity16.
There is not enough knowledge about the mechanisms that oocytes use for DNA damage repair. Studies have shown that DNA damage induced in fully grown mammalian oocytes by the use of genotoxic agents, such as etoposide, doxorubicin, or UVB or ionizing radiation, does not affect the timing and rates of exit from prophase I arrest17. Oocytes can undergo GV breakdown (GVBD) even in the presence of elevated levels of damage. This damage can be determined by the observation of &#947;H2AX. This phosphorylated form of H2AX (&#947;&#919;2&#913;&#935;) is a DSB marker, which is located at the site of breaks and functions as a scaffold to help repair factors and proteins to accumulate at broken ends18.
The absence of cell cycle arrest following DNA damage is due to an insufficient DNA damage checkpoint that allows oocytes with unrepaired DNA to re-enter meiosis. Following high levels of DNA damage, a checkpoint can maintain prophase arrest through the activation of an ATM/ Chk1-dependent pathway. The limited checkpoint response to DSBs is due to the limited activation of ATM17,19. In the M-phase of meiosis I, research has shown that DNA damage may activate a spindle assembly checkpoint (SAC)-induced meiosis I checkpoint, which prevents the activation of the E3 ubiquitin ligase anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) and, therefore, M-phase exit. Moreover, the ablation of SAC proteins overcomes the state of M-phase arrest, thus underlining the importance of the SAC in the establishment of the meiosis I chekpoint20.
As previous research clearly shows, DSBs cannot induce a robust prophase checkpoint in mouse oocytes. If such damage is left unrepaired, it could lead to embryos carrying chromosomal abnormalities. Therefore, it is important to study the DNA damage response at different stages of female gametogenesis to better understand the unique pathways that oocytes use to cope with potential genetic insults.

Yazar Spotlight: Memeli Oositlerinde ve Preimplantasyon Embriyolarında DNA Hasar Tepkisini Anlamak 

Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Our research aims to understand how the cell cycle is regulated in mammalian oocytes and in preimplantation embryos. A key aspect of our research involves examination of repair capacity and DNA damage response in different maturation states is in oocytes and also in preimplantation embryos. We are particularly interested in understanding how the checkpoints respond and which repair mechanisms establish after potential DNA damage.Our lab was the first to mechanistically examine the DNA damage response in mammalian oocytes. We have shown the absence of the G2 prophase DNA damage checkpoint in mammalian oocytes. And we observed the importance of the spindle assembly checkpoint in establishing metaphase arrest after damage.By using this protocol, it is possible to detect DNA double strand breaks with accuracy and to determine whether oocytes have DNA damage and whether DNA damage is being repaired. This protocol involves the use of immunofluorescence which allows us to identify the exact sites of damage to DNA.

Burada gösterilen prosedür kullanılarak, fare yumurtalıkları diseke edildi, yağ çıkarıldı ve tamamen büyümüş GV evresi oositler toplandı. Daha sonra, kümülüs hücreleri dar bir pipet kullanılarak tekrarlayan pipetleme ile çıkarıldı ve taze M2-IBMX besiyeri damlalarına yerleştirildi ve sıcak bir blok (37 °C) üzerinde mineral yağ ile kaplandı (Şekil 1A-F). 20 mg/mL'lik bir stok etoposid konsantrasyonu kullanılarak üç farklı etoposid konsantrasyonu (5 μg/mL, 20 μg/mL ve 50 μg/mL) hazırlandı. GV evresi oositleri, mineral yağ ile kaplanmış ve 37 ° C'de ışıktan korunan damlalar halinde 1 saat boyunca üç farklı etoposid konsantrasyonuna yerleştirildi. Daha sonra protokol bölümünde ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi immünofloresan protokolü izlendi ve oositler cam tabanlı tabaklara yerleştirildi ve konfokal mikroskopi ile gözlendi (Şekil 2).
SN GV evresi oositlerinde, DNA hasarından hemen sonra, γH2AX varlığı tüm etoposid konsantrasyonlarında (5 μg / mL, 20 μg / mL ve 50 μg / mL) arttı ve γH2AX tüm DNA bölgesi boyunca dağıldı (Şekil 3). DSB miktar tayini ve tahmini, DNA bölgelerinde γH2AX floresan yoğunluğu gözlemlenerek gerçekleştirildi. γH2AX floresansı, artan etoposid konsantrasyonları ile orantılı olarak yoğunlaştı. Ayrıca, uzun süreli faz durmasından sonra (etoposid tedavisinden 20 saat sonra), GV evresi oositleri, γH2AX odaklarının sayısını ve yoğunluğunu azaltma kapasitesini gösterdi, bu da GV evresinde tutuklanan oositlerde aktif onarım süreçlerinin varlığını ima etti (Şekil 3E).
γH2AX floresansının DNA yoluyla dağıtıldığı SN oositlerinin aksine, NSN oositlerinde, γH2AX, 20 μg / mL'de etoposid ile tedaviden hemen sonra odaklarda gösterilmiştir. DNA alanıyla çakışan odakların sayısını tahmin ettik, her odağın floresansını hesapladık ve tüm oositlerin ortalama floresansını sunduk. Hem floresan hem de odak sayısı, iki oosit kategorisi arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterdi (Şekil 4).
Konfokal mikroskopi, farklı Z yığınlarındaki odakların sayısı ve yoğunluğu hakkında bilgi sağlar, böylece farklı zaman noktalarında DNA hasarının varlığını ve onarım dinamiklerini belirlemeye yardımcı olur. Galvano tarama, düşük arka plan ile hassas tarama ve tarama görüntülerinin daha iyi analiz edilmesini sağlar.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig03.jpg"> Şekil 3: Uzun süreli GV tutuklamasından sonra üç farklı etoposid konsantrasyonu ile tedavi edilen SN GV evresi oositlerinde γH2AX'in azaltılması. (A) etoposid tedavisinden 0 saat sonra SN GV evresi oositlerinde γH2AX floresansı. γH2AX, tüm etoposid konsantrasyonlarında maruziyetten hemen sonra artar ve artış konsantrasyona bağlıdır (yeşil: γΗ2ΑΧ, macenta: DNA). Görüntüler Z-yığını projeksiyonlarıdır ve parlaklık/kontrast Fiji / ImageJ kullanılarak her kanal için ayarlanmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Farklı etoposid konsantrasyonları ile tedaviden 0 saat sonra SN GV evresi oositlerinde γH2AX floresan grafiği. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Her nokta bir oositi temsil eder (oosit sayısı grafikte gösterilmiştir), (ns = anlamlı değil, ** p < 0.005, **** p < 0.0001, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA).  (C) etoposid tedavisinden 20 saat sonra SN GV evresi oositlerde γH2AX floresansı. γH2AX, tüm etoposid konsantrasyonlarında maruz kaldıktan 20 saat sonra azalır (yeşil: γΗ2ΑΧ, macenta: DNA). Görüntüler Z-yığını projeksiyonlarıdır ve parlaklık/kontrast Fiji/ImageJ kullanılarak her kanal için ayarlanmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) Farklı etoposid konsantrasyonları ile tedaviden 20 saat sonra SN GV evresi oositlerinde γH2AX floresan grafiği. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Her nokta bir oositi temsil eder (oosit sayısı grafikte gösterilmiştir), (ns = anlamlı değil, * p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.0005, **** p < 0.0001, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA).  (E) Etoposid ile tedavi edilen oositlerde profaz durmasından sonra SN GV evresi oositlerinde γH2AX floresan azalmasının çubuk grafiği. Her sütunun üzerindeki sayı, γH2AX floresansındaki düşüş yüzdesini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig04.jpg"> Şekil 4: 20 μg/mL'de etoposid ile tedaviden sonra NSN GV evresi oositlerinde Η2ΑΧ'nin fosforilasyonu. (A) Bir kontrol NSN GV aşaması oositinin temsili konfokal görüntüleri (yeşil: γΗ2ΑΧ, macenta: DNA). Görüntüler Z-yığını projeksiyonlarıdır ve parlaklık/kontrast Fiji/ImageJ kullanılarak her kanal için ayarlanmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Etoposid ile tedavi edilmiş bir NSN GV aşaması oositinin temsili konfokal görüntüleri (yeşil: γΗ2ΑΧ, macenta: DNA). Oositler etoposid tedavisinden 0 saat sonra tespit edildi. Görüntüler Z-yığını projeksiyonlarıdır ve Fiji/ImageJ kullanılarak her kanal için parlaklık/kontrast ayarlanmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) 20 μg / mL etoposid tedavisinden sonra NSN GV evresi oositlerinde normalleştirilmiş γΗ2ΑΧ floresansı. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Her nokta, iki bağımsız deneyden (**** p < 0.0001, eşlenmemiş parametrik olmayan t-testi, Mann-Whitney U-testi) alınan bir oositi temsil eder (oosit sayısı grafikte gösterilmiştir). (D) 20 μg / mL etoposid tedavisinden sonra NSN GV evresi oositlerinde γΗ2ΑΧ odaklarının sayısı. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Her nokta, iki bağımsız deneyden (**** p < 0.0001, eşleştirilmemiş parametrik olmayan t-testi, Mann-Whitney U-testi) alınan bir oositi temsil eder (oosit sayısı grafikte gösterilmiştir). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Understanding DNA Damage Response in Mammalian Oocytes and Preimplantation Embryos at JoVE.com

Oosit genom bütünlüğünün korunması, elde edilen embriyoda genetik sadakati sağlamak için gereklidir. Burada, memeli dişi üreme hücrelerinde DNA çift sarmallı kırılmaları tespit etmek için doğru bir protokol sunuyoruz.

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Araştırmamız, memeli oositlerinde ve preimplantasyon embriyolarında hücre döngüsünün nasıl düzenlendiğini anlamayı amaçlamaktadır. Araştırmamızın önemli bir yönü, farklı olgunlaşma durumlarında onarım kapasitesinin ve DNA hasar yanıtının incelenmesini içerir, oositlerde ve ayrıca preimplantasyon embriyolarındadır. Özellikle kontrol noktalarının nasıl tepki verdiğini ve potansiyel DNA hasarından sonra hangi onarım mekanizmalarının oluştuğunu anlamakla ilgileniyoruz.Laboratuvarımız, memeli oositlerindeki DNA hasar tepkisini mekanik olarak inceleyen ilk kişi oldu. Memeli oositlerinde G2 profaz DNA hasar kontrol noktasının olmadığını gösterdik. Ve iş mili montaj kontrol noktasının, hasardan sonra metafaz durması oluşturmadaki önemini gözlemledik.Bu protokolü kullanarak, DNA çift iplikçik kopmalarını doğru bir şekilde tespit etmek ve oositlerde DNA hasarı olup olmadığını ve DNA hasarının onarılıp onarılmadığını belirlemek mümkündür. Bu protokol, DNA'daki hasarın kesin bölgelerini belirlememizi sağlayan immünofloresan kullanımını içerir.

detection-of-dna-double-stranded-breaks-in-mouse-oocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

1.3K Görüntüleme.  University of Ioannina. Araştırmamız, memeli oositlerinde ve preimplantasyon embriyolarında hücre döngüsünün nasıl düzenlendiğini anlamayı amaçlamaktadır. Araştırmamızın önemli bir yönü, farklı olgunlaşma durumlarında onarım kapasitesinin ve DNA hasar yanıtının incelenmesini içerir, oositlerde ve ayrıca preimplantasyon embriyolarındadır. Özellikle kontrol noktalarının nasıl tepki verdiğini ve potansiyel DNA hasarından sonra hangi onarım mekanizmalarının oluştuğunu anlamakl...

Video: Yazar Spotlight: Memeli Oositlerinde ve Preimplantasyon Embriyolarında DNA Hasar Tepkisini Anlamak 

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Gelişim Biyolojisi

Collection of Germinal Vesicle Oocytes from the Ovaries of CD-1 Mice and Induction of DNA Double-Strand Breaks

To begin, prepare drops of M2 IBMX Medium in a plastic tissue culture dish, and place the dish on a hot block at 37 degrees Celsius for at least 30 minutes before oocyte isolation. Dissect the ovaries of the euthanized mice and place them in a five milliliter round bottom tube with M2 IBMX. Transfer the ovaries to a plastic lid containing 1.5 milliliters of M2 IBMX.Remove any peri-ovarian adipose tissue, or fallopian tube segments, and release the cumulus oocyte complexes by mechanical perforation of the ovaries with a 27-gauge needle. Transfer the cumulus oocyte complexes to a culture dish with drops of M2 IBMX. And remove the cumulus cells by repeated pipetting using a narrow bore glass pasture pipette.Select the surrounded nucleus germinal vesicle or GV stage oocytes, and transfer them in a drop of M2 IBMX medium on hot block at 37 degrees Celsius protected from light. After inducing double strand breaks using etoposide, place the GV stage oocytes in drops of the genotoxic agent for one hour on the hot block in the dark. Add drops of M16 culture medium supplemented with 400 micromolar IBMX to the oocytes to keep them arrested for a prolonged period.Place the oocytes in an incubator at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.

CD-1 Farelerinin Yumurtalıklarından Germinal Vezikül Oositlerinin Toplanması ve DNA Çift İplikli Kırılmaların İndüksiyonu

Fixation and Confocal Imaging of Germinal Vesicle-Oocyte Collected from CD-1 Mice

Place the control and etoposide-treated germinal vesicle, or GV, oocytes in different plastic tissue culture dishes with PFA-Tx 100 buffer for 40 minutes at room temperature. Rinse the oocytes in three distinct 50-microliter washing buffers at room temperature and place them in 25 microliters of blocking buffer on a hot block for one hour. Next, prepare the primary antibody that recognizes gamma H2AX.Dilute the primary antibody with the blocking buffer at a one to 200 ratio and immerse the oocytes in 15-microliter drops at four degrees Celsius overnight. Wash the oocytes in three different 50-microliter washing buffers. Prepare the Alexa Fluor 488 conjugated growth anti-rabbit secondary antibody.After diluting it with the blocking buffer, immerse the oocytes in 15-microliter drops of the antibody for one hour on a 37 degrees Celsius hot block protected from light. Take a far-red fluorescent DNA dye DRAQ7 and transfer the oocytes to it for 10 minutes at room temperature in the dark before washing them with three different washing buffers. Add small drops of washing buffer to the oocytes in a 35-millimeter glass-bottom Petri dish for confocal microscopy.Switch on the laser controller and the lasers in the confocal system. After turning on the microscope controller and the lamps, open the confocal software and choose the 40X oil lens. Place the dish with the oocytes into the specimen holder and try to focus on the oocytes by moving the stage on X, Y, and Z axes using the joystick.Set the laser power, the gain, and the pinhole size independently for each experiment to minimize any saturation. For each oocyte, set the area of interest specifically in the nucleus at the DNA area. Define the borders of the DNA area and adjust the Z-step size to three micrometers.Then start the scanning. Save the images for each cell in the selected folder. Open the ImageJ software and click on image, followed by color, and split channels.To split all the channels. Click on lookup table and choose the preferred colors for each channel Click on image, color, and merge channels to merge the channels for gamma H2AX and DNA. In the surrounded nucleolus oocytes with high levels of DNA damage, click on image, stacks, Z-project, and with the freehand selections command, select the entire DNA area.Click on analyze, followed by measure to measure the gamma H2AX fluorescence and copy the measurements into an Excel file. The gamma H2AX fluorescence in the surrounded nucleolus GV stage oocytes zero hours after the etoposide treatment is shown in this figure. The gamma H2AX increases immediately after the exposure at all the etoposide concentrations, and the increase is concentration-dependent.The gamma H2AX fluorescence in the surrounded nucleolus GV stage oocytes 20 hours after the etoposide treatment is shown here. Gamma H2AX reduces 20 hours after the exposure at all the etoposide concentrations. After protracted prophase arrest, the GV stage oocytes showed the capacity to reduce the gamma H2AX foci number and intensity, implying the presence of active repair processes in the GV stage arrested oocytes.