Dondurulmuş memeli dokularından tek çekirdekleri izole ettikten sonra, bir pipet ucu kullanarak ayrıştırıcı kartuşundaki yuvarlak folyoyu dikkatlice delin. Sükroz gradyan temizliğini kolaylaştırmak için, kartuştan 900 mikrolitre çekirdek süspansiyonunu çıkarın ve iki mililitrelik bir tüpte hazırlanan 500 mikrolitre sükroz yastık çözeltisine veya SCS'ye ekleyin. Karışım homojen olana kadar pipetleyerek iyice karıştırın.
Daha sonra, tüpü bir açıyla tutun ve 1.400 mikrolitre çekirdek süspansiyon SCS karışımını yeni bir 500 mikrolitre SCS üzerine damla damla ekleyerek açıkça görülebilen bir faz ayrımı oluşturun. Tüpü dikkatlice kapatın ve faz ayrımını bozmadan tekrar buzun üzerine yerleştirin. Tüpleri önceden soğutulmuş bir santrifüjde dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 13.000 g'da dikkatlice döndürün.
Paleti bozmadan süpernatanı çıkarın ve paleti 50 mikrolitre buz gibi soğuk NSR'de dikkatlice yeniden askıya alın. Aynı numunenin iki paletini 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe çekin. Toplam bir mililitre hacme 900 mikrolitre buz gibi NSR ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.
Numuneyi 500 g'da dört santigrat derecede beş dakika boyunca sallanan bir kova rotor santrifüjü ile santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 100 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Saymak için, 10 mikrolitre çekirdek süspansiyonunu 20 mikrolitre PBS içinde seyreltin.
Floresan sayaç sayma plakasının bir karıştırma kuyusuna 25 mikrolitre propidyum iyodür boyama çözeltisi ekleyin. Ardından 25 mikrolitre seyreltilmiş çekirdek süspansiyonu ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Lekeli numunenin 50 mikrolitresini karıştırma kuyusundan yükleme kuyusuna aktarın.
Sayma plakasını hücre sayacına yükleyin ve sayımı başlatın. Saydıktan sonra, numuneleri PBS ile tek çekirdekli RNA dizilimi için istenen konsantrasyona seyreltin. Kısmen otomatikleştirilmiş çekirdek izolasyon protokolü kullanılarak, kabarcıklanma, döküntü veya topaklanma belirtileri olmadan kaliteli çekirdekler elde edildi.
Her örnekteki gen sayımlarının, UMI sayımlarının ve mitokondriyal içeriğin dağılımını temsil eden keman grafikleri gösterilir. Her dokudan beklenen hücre tipleri tanımlandı ve tüm hayvanlar tüm kümelere katkıda bulundu, bu da protokolün getirdiği düşük teknik değişkenliği gösterdi. Ayrıca, hücresel oranlar, UMI sayıları ve gen sayımları, doku tipi başına her üç örnekte de karşılaştırılabilirdi.
