Başlamak için, FBS'de donmuş bir SH-SY5Y hücresi stoğunu hızla çözün. % 10 DMSO ile desteklenir ve önceden ısıtılmış ortamla on kat seyreltilir. Sonra hücreleri santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
Hücre peletini beş mililitre önceden ısıtılmış ortamda ve bir T25 şişesinde tohum hücrelerinde yeniden süspanse edin. PDL ile kaplanmış kapak fişleri hazırlamak için, steril odacıklı lamellerin her bir kuyucuğuna mililitre PDL çözeltisi başına 600 mikrolitre 50 mikrogram uygulayın. Her kuyuya eklenen PDL hacmi, kuyu boyutuna göre değişir.
Kapak fişlerini inkübe edin, oda sıcaklığını bir saat boyunca ayarlayın. İnkübasyondan sonra, PDL çözeltisini çıkarın ve kapak fişini 1.8 mililitre damıtılmış su ile üç kez durulayın. Kaplanmış haznenin iki saat kurumasını bekleyin.
SH-SY5Y hücreleri% 80 ila 90 birleşmeye ulaştığında, tripsin çözeltisi ekleyerek bunları ayırın. Önceden ısıtılmış bir DMEM ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin. Hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve peleti DMEM'de yeniden süspanse edin.
Otomatik hücre sayacındaki hücreleri sayın. Daha sonra, hücreleri PDL kaplı odacıklı kapak camına santimetrekare başına 1.5 çarpı 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda tohumlayın. Birinci ve üçüncü günde, farklılaştırma için araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere ortamı sırasıyla beş veya% 2 FBS,% 1 antibiyotik antimikotik ve% 10 mikromolar RA veya% 95 etanol ile desteklenmiş DMEM ile değiştirin.
Farklılaşma durumuna bağlı olarak iki veya% 10 FBS,% 1 antibiyotik antimikotik ve 20 milimolar hepes ile desteklenmiş önceden ısıtılmış Fenil kırmızısı serbest DMEM'de bir PKMO stoğu hazırlayın. Altıncı günde, hücreleri görüntüleme ortamıyla iki kez durulayın ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 30 dakika boyunca PKMO çözeltisi ile inkübe edin. Boyamadan sonra, hücreleri önceden ısıtılmış görüntüleme ortamıyla üç kez durulayın.
Son yıkama için, hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, son yıkamayı 20 milimolar hepes içeren önceden ısıtılmış taze görüntüleme ortamıyla değiştirin.
