Görüntü alımı için LightBox yazılımını açın. Lazer ve filtre setlerini seçmek için, boya listesinden boyamada kullanılan boyayı seçerek turuncu boya parametrelerini kullanın. Genel bir bakış kullanarak, hücrelere odaklanmak için canlıya tıklayın.
Hücreler odaklandıktan sonra, konfokal edinim ayarlarını yapın. Ardından, dikdörtgen ROI düğmesini seçin ve bölgeyi şekillendirmek için tıklayıp sürükleyerek ilgilenilen bir mitokondri etrafında ilgi çekici bir bölge oluşturun. Uyarılmış emisyon tükenmesi veya sabit alımı için dedektör geçitini ayarlamak için, genel menünün yanında, geçit menüsünü seçin veya menüyü görünüme eklemek için tıklayın ve basılı tutun.
Stead alımı için, uyarma lazerini 15 satır birikimi ile %20 ila 20'ye ve sabit tükenme lazerini %25 ila 10'e ayarlayın. Dört mikrosaniyelik bir piksel bekleme süresi ve 20 ila 25 nanometre piksel boyutu kullanın. Zaman açılır menüsünü seçerek, ardından yineleme sayısını beş ve 25 veya 30 saniyelik bir zaman aralığı olarak ayarlayarak zaman atlamalı çekim gerçekleştirin.
Ses seviyesi seçeneği kullanılarak ve istenen Z hacim aralığı ve adım boyutu ayarlanarak bir Z yığını alınabilir. Yazılım algoritması ile ham sabit görüntüleri evrişimden çıkarmak için stead görüntü evrişim yazılımını açın. Mikroskobik parametrelerin doğru olduğundan emin olduktan sonra, ekspres düğmesini seçin ve değişen derecelerde evrişim gücü için evrişim türünü çok hızlı, standart, agresif veya muhafazakar olarak ayarlayın.
Evrişimi kaldırma işlemini yürütün. Görüntüleri ICS2 formatında kaydedin. J görüntüsünde, dosyaya tıklayın ve ardından ICS2 dosyalarını evrişim yazılımından açmak için açın.
Eklentileri seçin, ardından segmentasyonu ve ardından eğitilebilir Weka segmentasyon eklentisinde evrişimsiz sabit görüntüleri açmak için eğitilebilir Weka segmentasyonunu seçin. Segmentasyon ayarlarında, Gauss bulanıklığı, membran projeksiyonları ve sobel filtre özelliklerini seçin. Bir sınıfı cristae, diğerini arka plan olarak etiketleyin.
Ardından, her iki sınıfa da atamak için yapının üzerine bir çizgi çizin. Ardından, cristae veya arka plan için sağ taraftaki ekle düğmesini seçin. Ardından, eklentiye sağlanan bilgilere dayalı olarak bir harita oluşturmak için sol taraftaki tren sınıflandırıcı düğmesini seçin.
Sınıflandırıcı ayarlarını gelecekteki segmentasyon için kaydetmek için sınıflandırıcıyı kaydet düğmesine tıklayın. İkili bir maske oluşturmak için J görüntüsündeki görüntüyü eşiklemek için cristae olasılık haritasını kullanın ve ardından analize gidin, ardından parçacıkları analiz edin. Son olarak, çok noktalı bir çizgi çizin, çizgi kalınlığını birkaç piksel genişliğe ayarlayın ve çizgiyi mitokondriye sığacak şekilde eğrin.
Bu çalışmada, farklılaşmamış, retinoik asitle farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinde mitokondrinin gösterildiği gibi hızlandırılmış görüntüleme ile görüntülenmesi. Dekonvolüted stead görüntüleri, belirli bir alandaki cristae periyodikliğini ve cristae boyut ve şekil ölçümlerini belirlemek için kullanılabilir.
