Başlamak için, Nil Kırmızısı tozunu asetonda mililitre konsantrasyonda üç miligramda çözün. Çözeltiyi periyodik karıştırma ile oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Çözeltide kalan çökelti miktarına bağlı olarak bir veya iki kez 0.22 mikrometrelik bir filtre kullanarak çözeltiyi filtreleyin.
Ardından, stok çözeltisini DPBS'de bire 500 oranında seyrelterek çalışma çözeltisini hazırlayın. Paraformaldehitle sabitlenmiş RPE hücrelerine 200 mikrolitre çalışma solüsyonu ekleyin ve ışıktan koruyan bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri DPBS ile iki kez yıkayın, ardından 200 mikrolitre DPBS ekleyin ve dört santigrat derecede saklayın.
BODIPY boyama için, BODIPY'yi susuz DMSO içinde çözerek 3.8 milimolar bir stok konsantrasyonu hazırlayın. Ardından, stok çözeltisini DPBS'de bire 300 oranında seyrelterek çalışma çözeltisini hazırlayın. Paraformaldehitle sabitlenmiş RPE hücrelerine 200 mikrolitre BODIPY çalışma solüsyonu ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde inkübe edin.
Ertesi gün, hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın ve dört santigrat derecede saklamadan önce 200 mikrolitre DPBS ekleyin. APOE immün boyama için, DPBS'yi %1 BSA, %0.5 Tween 20 ve %0.5 Triton X-100 ile birleştirerek bir tampon çözeltisi hazırlayın. Paraformaldehitle sabitlenmiş RPE hücrelerini bir saat boyunca 200 mikrolitre tampon çözeltisinde bloke edin ve geçirgenleştirin.
İnkübasyondan sonra, tampon çözeltisinde bire 100 oranında seyreltilmiş APPLE birincil antikoru ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri DPBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca bir ila 1000 oranında seyreltilmiş 200 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin.
İnkübasyondan sonra, hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın ve dört santigrat derecede saklamadan önce 200 mikrolitre DPBS ekleyin.
