Konfokal mikroskop ve 40X objektif kullanarak, kullanılan lipid işaretleyici için uygun floresan kanallarıyla bir tarama profili oluşturun. Çekim modunu ve kanalları ayarladıktan sonra, Yazılım Otomatik Odaklama'ya tıklayarak odak stratejisini optimize edin. Ardından Z Yığınının aralığını 20 mikron olarak ayarlayın.
Bundan sonra, döşemeleri optimize edin ve döşeme konumlarını seçmek için görüntüleyiciyi açın. Ardından, bir toplu görüntü işleme yöntemi kullanarak, genişletilmiş odak derinliği yöntemiyle her bir Z Yığını için maksimum projeksiyonlar oluşturun. Görüntüleri dışa aktarmadan önce, sıkıştırmayı yok olarak ayarlayın ve orijinal verilerin işaretli olduğundan emin olun.
Ortaya çıkan görüntü, lipid işaretleyiciyi ifade eden, yalnızca floresan kanalının maksimum projeksiyon gri tonlamalı TIFF'sidir. Nil Red, BODILY veya APOE'yi temsil eden TIFF görüntülerini tanımlayın ve kullanılan yönteme bağlı olarak bunları Nil Red, BODILY veya APOE adlı bir dizin içindeki Görüntüler klasörüne taşıyın. Lipid birimi yazılımını açın.
Tahmin sekmesinde, üç noktaya tıklayarak ve adlandırılmış dizine giderek ilgili dizini seçin. Sınıf girişini kontrol ederek lipid biriminin görüntüleri doğru bir şekilde tanımladığını onaylayın. Görev ilerleme durumunu gözlemlemek için Tahmin Et'e tıklayın, ardından Maske Analizi aracını kullanarak oluşturulan maskeleri yineleyin ve maske görüntülerinden eşik lipid birikintilerinin nicel sayısını sağlayın.
RPE'nin başarılı bir şekilde farklılaşması ve olgunlaşması, pigmentasyon ve poligonal morfoloji ile birleşik bir tek tabaka gösterdi. Buna karşılık, başarısız farklılaşma, ölmekte olan hücre kümelerini gösterdi. Floresan görüntülerde, Nil Kırmızısı ve BODIPY birikintileri küçük, parlak dairesel noktalar olarak ortaya çıktı.
Negatif bir sonuç, zayıf boyama veya yüksek arka plan yoğunluğu nedeniyle arka plan floresansını bir tortu olarak yanlış algılayarak yanlış görüntü segmentasyonu gösterir. Boyut, şekil ve sinyal yoğunluğu bakımından değişen ve varyasyonu en aza indirmek için boyama ve görüntüleme yöntemlerinin optimizasyonunu gerektiren APOE birikintileri gösterilmiştir.
