İkinci sınıf bir laminer akış başlığı altında çalışırken, farelerden toplanan perivasküler yağ dokularını veya PVAT'leri iki kez sırayla yıkayarak başlayın. İlk olarak, %10 penisilin-streptomisin içeren PBS kullanmak ve daha sonra %1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş PBS kullanmak. Durulanan dokuları steril bir 60 milimetre Petri kabına aktarın ve üzerine 200 mikrolitre sindirim solüsyonu ekleyin.
Steril makas kullanarak, dokuları bir milimetre küp büyüklüğünde parçalara ayırın. Steril makas yardımıyla, ucunu genişletmek için plastik bir pipet ucu kesin. Daha sonra kıyılmış doku karışımını geniş uçlu pipet ucunu kullanarak 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Sindirimi başlatmak için dokulara altı mililitre sindirim solüsyonu ekleyin. Tüpü yatay olarak bir rafa bağladıktan sonra, 30 ila 45 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcıda 37 santigrat derecede inkübe edin. Her 5 ila 10 dakikada bir, tüpü inkübatördeki çalkalayıcıdan çıkarın ve manuel olarak kuvvetlice yukarı ve aşağı sallayın.
Sindirilmiş doku karışımını 70 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne geçirin. Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak ve sindirimi söndürmek için süzgeci eşit hacimde kültür ortamıyla durulayın. Süzüntüyü yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.
Stromal vasküler fraksiyonu veya SVF'yi izole etmek için tüpü santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için tüpü ters çevirin ve peleti beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Süpernatanı atmadan önce tüpü beş dakika boyunca 1.800 G'de tekrar santrifüjleyin.
Peleti uygun hacimde bir kültür ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri kollajen kaplı 12 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve% 5 karbondioksit içeren nemli bir atmosferde 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kültür ortamını aspire ederek ve hücreleri önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış antibiyotik takviyeli PBS ile yıkayarak hücre kalıntılarını ve kırmızı kan hücrelerini çıkarın.
Son olarak, her bir oyuğa bir mililitre taze kültür ortamı ekleyin ve istenen birleşme aşamasına ulaşana kadar hücreleri kültürlemeye devam edin.
