Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82130012 ve 81830010) ve Şanghay Göğüs Hastanesi'nin temel araştırmaları için Yetiştirme projeleri (Hibe Numarası: 2022YNJCQ03) tarafından desteklenmiştir.

Hayvan protokolleri, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne bağlı Şanghay Göğüs Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası: KS23010) ve ilgili etik düzenlemelere uygundu. Bu deney için 4-8 haftalık erkek ve dişi C57BL/6 fareler tercih edilmelidir.
1. Cerrahi aletlerin, tamponların ve kültür ortamlarının hazırlanması
<ol><li>Cerrahi aletler (örn. cerrahi makas ve standart forseps) 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklavlayın. Mikrocerrahi aletleri% 75 alkol ile dezenfekte edin.</li>
	<li>% 1 v / v penisilin-streptomisin ve% 10 v / v penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 10 mL PBS ile desteklenmiş steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. NOT: Aşağıdaki bölümlerde, özellikle belirtilmemişse, PBS, normal steril PBS'yi ifade eder.</li>
	<li>Krebs Ringer HEPES BSA tamponunu hazırlayın:% 1 sığır serum albümini (BSA), Krebs Ringer çözeltisinde çözülmüş 20 mM HEPES.</li>
	<li>Taze sindirim çözeltisi hazırlayın: tip 1 kollajenaz (1 mg / mL) ve dispas II (4 mg / mL) Krebs Ringer HEPES BSA tamponunda çözülür. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin.</li>
	<li>Kollajen kaplı 12 oyuklu bir plaka hazırlayın.<ol><li>Kollajen çözeltisini (1 mg/mL) steril deiyonize su ile 40 μg/mL konsantrasyonuna seyreltin. 6-10 μg/cm2'lik bir konsantrasyon elde etmek için her bir oyuğun yüzeyine 1 mL seyreltilmiş kollajen çözeltisi ekleyin. Kaplamayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Kalan çözeltiyi çıkarın ve her bir kuyuyu 2 kez 1 mL PBS ile durulayın. Plakayı hemen kullanın veya plakayı sınıf II laminer akış başlığında havayla kurutun ve kaplanmış plakayı 2-8 °C'de saklayın. Saklarken, kaplanmış plakaları parafilm ile kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kültür ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu Dulbecco's-Modifiye Eagles Medium (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 v / v penisilin-streptomisin. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.</li>
	<li>Lipitojenik indüksiyon ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu DMEM, %10 FBS, %1 v/v penisilin-streptomisin, 1 nM triiyodotironin, 1 μM rosiglitazon, 1 μM insülin, 0.5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) ve 1 μM deksametazon. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.</li>
	<li>Bakım ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu DMEM, %10 FBS, %1 v/v penisilin-streptomisin, 1 nM triiyodotironin, 1 μM rosiglitazon ve 1 μM insülin. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.</li>
</ol>2. Perivasküler yağ dokusunun diseksiyonu ve izolasyonu (PVAT)
<ol><li>Fareyi% 2 izofluran anestezisi altında servikal çıkık veya aşırı dozda karbondioksit ile ötenazi yapın. Cilt dezenfeksiyonu için% 75 alkol püskürtün.</li>
	<li>Fareyi sırtüstü pozisyonda (yukarı bakacak şekilde) yerleştirin.</li>
	<li>Cildi kaldırın, küçük bir kesi yapın ve ventral orta hat boyunca pelvisten boyuna kadar cerrahi makasla cildi ve karın kaslarını künt bir şekilde ayırın. Orta hattın her iki tarafındaki diyaframı ve kaburgaları keserek kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarın.</li>
	<li>Karaciğeri, dalak, bağırsakları ve böbreği dikkatlice çıkarın. Bağırsak duvarını kesmekten kaçının.</li>
	<li>Akciğerleri ve yemek borusunu çıkarın.</li>
	<li>Bir elinizde forseps ile kalbi nazikçe kaldırın ve diğer elinizde cerrahi makasla aort damarını omurgadan ayırın. Ardından, kalbi ve aortu %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS'li 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Mikrocerrahi forsepsleri ve mikrocerrahi makasları alkolden çıkarın ve fazla alkolü çıkarmak için 25 mL PBS'de durulayın. Stereo mikroskop altında, timus ve diğer dokuları kalpten ve aorttan çıkarın, ardından kalbi çıkarın ve aortu PVAT'lerle bırakın.</li>
	<li>PVAT'lı aortu %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS'li 60 mm'lik temiz bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>PVAT'ları soymak için mikrocerrahi forseps kullanın, bir çift forseps aortu sabitler ve diğeri yağ dokusunu çeker. Perivasküler yağ dokusuna verilen zararı en aza indirirken damar dokusunu mümkün olduğunca çıkarın.</li>
	<li>Torasik aortu çevreleyen PVAT'ı, buz üzerine yerleştirilmiş %1 v/v penisilin-streptomisin ile desteklenmiş yüksek glikozlu DMEM içeren 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne toplayın.</li>
</ol>3. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu
<ol><li>Toplanan dokular %10 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ve %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ile sırayla durulayın. NOT: Bu adımdan itibaren, tüm deneyler steril koşullar altında sınıf II laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Dokuları steril 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın, 200 μL sindirim solüsyonu ekleyin ve steril makas kullanarak 1 mm3 parçaya kıyın.</li>
	<li>Karışımı plastik bir pipet ucu kullanarak 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, ucu steril bir makas kesimi ile genişletildi ve sindirim reaksiyonunu başlatmak için 6 mL sindirim solüsyonu ekleyin. NOT: Altı fareden PVAT depoları için bir sindirim reaksiyonu (3 mL sindirim solüsyonu) yeterlidir.</li>
	<li>Dokuları 37 °C'de orbital çalkalayıcı (etkili karıştırma için 150 rpm frekans) ile bir inkübatörde 30-45 dakika inkübe edin. Tüplerin yatay olarak sallanmasını sağlamak için tüpleri bir rafa düz bir şekilde bağlayın. Her 5-10 dakikada bir 10 saniye boyunca elle kuvvetlice yukarı ve aşağı sallayın. NOT: Doku parçası kalmayan homojen, sarımsı bir sindirim sıvısı görüldüğünde sindirim kesilebilir.</li>
	<li>Sindirilmiş dokuları 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak ve sindirimi durdurmak için hücre süzgecini eşit hacimde kültür ortamı ile durulayın.</li>
	<li>Süzüntüyü yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca 1.800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için tüpü ters çevirin ve peletleri 5 mL PBS'de yeniden süspanse edin. 1.800 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Tüpü ters çevirerek süpernatanı atın ve peletleri uygun bir hacimde kültür ortamında yeniden süspanse edin. NOT: Her altı fareden toplanan hücre peletleri, 1 mL kültür ortamında yeniden süspanse edilir ve 12 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna ekilir.</li>
	<li>Hücreleri kollajen kaplı 12 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve gece boyunca %5CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, kültür ortamını aspire edin, hücre kalıntılarını ve kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için hücreleri% 1 v / v penisilin-streptomisin içeren önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS ile yıkayın ve her bir kuyucuğa 1 mL taze kültür ortamı ekleyin.</li>
</ol>4. Periaortik yağ dokusundan SVF kaynaklı preadipositlerin adipojenik indüksiyonu
<ol><li>Hücreler ~% 60-70 birleşmeye ulaşana kadar kültür ortamını her gün değiştirin. NOT: Hücrelerin %60-70 birleşmeye ulaşması genellikle 3-4 gün sürer.</li>
	<li>Hücreler% 60-70 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını aspire edin ve kahverengi adipojenik indüksiyon ortamı ile değiştirin. Adipojenik farklılaşmanın indüksiyon gününü farklılaşmanın 0. günü olarak düşünün.</li>
	<li>72 saat sonra (farklılaşmanın 3. günü), ortamı bakım ortamıyla yenileyin. Hücreler deneyler için kullanılana kadar bakım ortamını her 2 günde bir değiştirin.</li>
	<li>Adipojenik hücreleri, Yağ Kırmızısı O boyama14 ve batı lekeleme15 gibi uygun bir şekilde analiz edin.</li>
</ol>

Murin Perivasküler Yağ Dokusundan İzole Edilen Preadipositlerin Kültürlenmesi

<ol>
	<li>Akoumianakis, I., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+adipose+tissue+and+the+cardiovascular+system:+is+fat+always+bad.">The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad.</a> Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).</li><li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+perivascular+adipose+tissue+inhibits+VSMC+apoptosis+and+aortic+aneurysm+formation+in+mice+via+the+secretome+of+browning+adipocytes.">Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).</li><li>Xia, N., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+perivascular+adipose+tissue+in+obesity-induced+vascular+dysfunction.">The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+view+of+mammalian+adipocyte+stem+and+progenitor+cell+heterogeneity.">Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity.</a> Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).</li><li>Angueira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+lineage+of+thermogenic+perivascular+adipose+tissue.">Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue.</a> Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+regulates+human+perivascular+adipose+progenitor+cell+differentiation.">Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+sympathetic+nerves+and+inflammation+in+perivascular+adipose+tissue.">Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).</li><li>Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+isolate+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells.</a> Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).</li><li>Senesi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+enzymatic+procedures+to+isolate+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue:+preliminary+results.">Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).</li><li>Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+vascular+fraction+technologies+and+clinical+applications.">Stromal vascular fraction technologies and clinical applications.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).</li><li>Suh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+cellular+and+cell-derived+regenerative+therapies+in+dermatology+and+aesthetic+rejuvenation.">Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation.</a> Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).</li><li>Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+adipose+tissue-derivatives+in+modern+dermatology.">Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology.</a> Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).</li><li>Kraus, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+adipocyte+differentiation+in+cell+culture.">Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture.</a> Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).</li><li>Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cort&#233;s, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+imaging+of+brown+adipocytes+from+the+stromal+vascular+fraction+of+interscapular+adipose+tissue+from+newborn+mice.">Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methotrexate+improves+perivascular+adipose+tissue/endothelial+dysfunction+via+activation+of+AMPK/eNOS+pathway.">Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).</li><li>Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue-derived+extracellular+vesicle+miR-221-3p+mediates+vascular+remodeling.">Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling.</a> FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).</li><li>Ruan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue-derived+complement+3+is+required+for+adventitial+fibroblast+functions+and+adventitial+remodeling+in+deoxycorticosterone+acetate-salt+hypertensive+rats.">Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).</li><li>Adachi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beiging+of+perivascular+adipose+tissue+regulates+its+inflammation+and+vascular+remodeling.">Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling.</a> Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Stanek, A., Bro&#380;yna-Tkaczyk, K., My&#347;li&#324;ski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+obesity-induced+perivascular+adipose+tissue+(PVAT)+dysfunction+in+vascular+homeostasis.">The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis.</a> Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).</li><li>Queiroz, M., Sena, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+age-related+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease.</a> Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).</li><li>Fitzgibbons, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+mouse+perivascular+and+brown+adipose+tissues+and+their+resistance+to+diet-induced+inflammation.">Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-&#947;+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis.">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-&#947; deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li><li>Piacentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profiling+unveils+autoimmune+response+signatures+in+the+perivascular+adipose+tissue+of+abdominal+aortic+aneurysm.">Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+reveals+perivascular+adipose+tissue+plasticity+in+response+to+angiotensin+II.">RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II.</a> Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).</li><li>Shi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+aortic+perivascular+adipose+tissue+inflammation+associates+with+aortic+valve+disease.">Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease.</a> Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation.">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li><li>Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fern&#225;ndez-Alfonso, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+perivascular+adipose+tissue+impacting+vascular+homeostasis.">Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).</li><li>Bar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+resonance+imaging-based+detection+of+heterogeneous+endothelial+response+in+thoracic+and+abdominal+aorta+to+short-term+high-fat+diet+ascribed+to+differences+in+perivascular+adipose+tissue+in+mice.">In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).</li></ol>

Yazarların beyan edecekleri finansal veya başka türlü herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Fare periaortik yağ dokusundan SVF'den türetilen preadipositlerin izolasyonu ve adipojenik indüksiyonu için pratik ve uygulanabilir bir yaklaşım öneriyoruz. Bu protokolün avantajları basit ve ekonomik olmasıdır. Başarılı izolasyon için yeterli sayıda fare kritik öneme sahiptir, çünkü yetersiz doku düşük SVF yoğunluğuna ve zayıf büyüme durumuna neden olabilir ve sonuçta lipojenik verimliliği etkileyebilir. Ek olarak, SVF'nin adipojenik potansiyeli yaşla birlikte azaldığı için fare yaşı...

Olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyonun (SVF) karışımından oluşan perivasküler bir yapı olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT), sekretomu aracılığıyla komşu damar duvarı ile parakrineal olarak etkileşime girdiğine inanılmaktadır1. Vasküler homeostazın kritik bir düzenleyicisi olarak, PVAT disfonksiyonu kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde rol oynar 2,3,4. Adiposit dokusunun SVF'si, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, mezotelyum hücreleri, nöronal hücreler ve adipoz kök ve progenitör hücreler (ASPC'ler) dahil olmak üzere birkaç beklenen hücre popülasyonundan oluşur5,6. Yağ dokusunun SVF'sinde bulunan ASPC'lerin olgun adipositlere yol açabileceği iyi bilinmektedir5. SVF'nin PVAT'ta kritik bir olgun adiposit kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır. Birkaç çalışma, PVAT-SVF'nin belirli indüksiyon koşulları altında olgun adipositlere farklılaşabileceğini göstermiştir 6,7,8.
Şu anda, SVF'yi yağ dokusundan izole etmek için biri enzimatik sindirim ve diğeri enzimatik olmayan olmak üzere iki izolasyon sistemi vardır9. Enzimatik yöntemler tipik olarak daha yüksek çekirdekli progenitör hücre verimi ile sonuçlanır10. Bugüne kadar, SVF'nin yara iyileşmesi, ürogenital ve kardiyovasküler hastalıklarda vasküler rejenerasyonu ve neovaskülarizasyonu desteklemedeki faydaları, özellikle dermatoloji ve plastik cerrahide12,13 yaygın olarak gösterilmiştir11. Bununla birlikte, PVAT'tan türetilen SVF'nin klinik uygulama beklentileri iyi araştırılmamıştır, bu da SVF'nin PVAT'tan izolasyonu için standart bir yöntemin olmamasına bağlanabilir. Bu protokolün amacı, torasik aortu çevreleyen fare PVAT'ından SVF'den türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için standart bir yaklaşım oluşturmak ve PVAT fonksiyonunun daha fazla araştırılmasını sağlamaktır. Bu protokol, genç farelerden elde edilen periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşma tekniklerini optimize eder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>11210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>310109003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-2877</td>
			<td>1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>CT-002-50A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-adiponectin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22554</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-COX IV</td>
			<td>CST</td>
			<td>4850</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FABP4</td>
			<td>CST</td>
			<td>2120</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PGC1&#945;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab191838</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PPAR&#947;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-14889</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-UCP1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10983</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Actinin</td>
			<td>CST</td>
			<td>6487</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes</td>
			<td>Shanghai Model Organisms Center, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital shaker</td>
			<td>Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.</td>
			<td>LYZ-103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (cattle)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11070-73-8</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Ringer&#39;s Solution</td>
			<td>Pricella&#160;</td>
			<td>PB180347</td>
			<td>protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>A600395-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>B548117-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue

Perivasküler yağ dokusu (PVAT), kan damarlarını çevreleyen ve beyaz, bej ve kahverengi adipositlerin fenotiplerini sergileyen bir yağ dokusu deposudur. Son keşifler, PVAT'ın vasküler homeostazın düzenlenmesinde ve kardiyovasküler hastalıkların patogenezine katılmadaki merkezi rolüne ışık tutmuştur. PVAT özelliklerinin ve regülasyonunun kapsamlı bir şekilde anlaşılması, gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Periaortik adipositlerin primer kültürleri, PVAT fonksiyonunu ve periaortik adipositler ile vasküler hücreler arasındaki karışmayı incelemek için değerlidir. Bu makale, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için ekonomik ve uygulanabilir bir protokol sunmaktadır ve bu, in vitro adipogenez veya lipogenezin modellenmesi için yararlı olabilir. Protokol, genç farelerden periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşmasını ana hatlarıyla belirtir. Bu protokol, PVAT işlevinin araştırılması için tezgah tarafında teknolojik temel taşı sağlayacaktır.

Perivascular adipose tissue (PVAT), a perivascular structure composed of a mixture of mature adipocytes and a stromal vascular fraction (SVF), is believed to interact with the adjacent vessel wall via its secretome paracrineally1. As a critical regulator of vascular homeostasis, PVAT dysfunction is implicated in the pathogenesis of cardiovascular diseases2,3,4. The SVF of adipocyte tissue consists of several expected cell populations, including endothelial cells, immune cells, mesothelium cells, neuronal cells, and adipose stem and progenitor cells (ASPCs)5,6. It is well known that ASPCs residing in the SVF of adipose tissue can give rise to mature adipocytes5. SVF is inferred to be a critical source of mature adipocytes in PVAT. Several studies have shown that PVAT-SVF can differentiate into mature adipocytes under specific induction conditions6,7,8.
Currently, there are two isolation systems for isolating SVF from adipose tissue, one is enzymatic digestion and the other is non-enzymatic9. Enzymatic methods typically result in a higher yield of nucleated progenitor cells10. To date, the benefits of SVF in promoting vascular regeneration and neovascularization in wound healing, urogenital, and cardiovascular diseases have been widely demonstrated11, especially in dermatology and plastic surgery12,13. However, the clinical application prospects of PVAT-derived SVF have not been well explored, which may be attributed to the lack of a standardized method for the isolation of SVF from PVAT. The objective of this protocol is to establish a standardized approach for the isolation, culture, and adipogenic induction of SVF-derived preadipocytes from mouse PVAT surrounding the thoracic aorta, enabling further investigation of PVAT function. This protocol optimizes tissue processing and cell differentiation techniques for culturing periaortic adipocytes obtained from young mice.

Yazar Spotlight: Fare Perivasküler Yağ Dokusundan SVF'den Türetilmiş Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonunun Önemi 

Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu

We aim to establish a standardized approach for the isolation culture and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mass PVAT. This protocol enables us to conduct further investigations into PVAT function and into the communication between periaortic adipocytes and vascular cells in vitro. The main challenges we currently face in our experiments include the restricted of availability of PVAT and the requirements for additional human and the material resources when compared to using immortalized preadipocytes.Our protocol allows for the study of perivascular adipose tissue function and it's relationship with vascular cells. We also offers a basis for studying PVAT ring and genes, and heterogeneity, and provides a platform for exploring the important regulator of PVAT differentiation and the adipogenesis in vitro.

Yukarıda açıklanan bu protokolü kullanarak, fare torasik aortlarını çevreleyen PVAT'leri dikkatlice izole ettik (Şekil 1A-D). PVAT'lar steril makas kullanılarak yıkandıktan ve küçük parçalara ayrıldıktan sonra (Şekil 1E,F), doku parçaları tip 1 kollajenaz (1 mg/mL) ve dispas II (4 mg/mL) içeren bir sindirim solüsyonunda sindirildi ve 37 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde 30-45 dakika inkübe edildi (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about The Significance of Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of SVF-Derived Preadipocytes from Mouse Perivascular Adipose Tissue at JoVE.com

Burada, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin vererek, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonunu, kültürünü ve adipojenik indüksiyonunu açıklıyoruz.

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown ...

Amacımız, kütle PVAT'ından stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyon kültürü ve adipojenik indüksiyonu için standart bir yaklaşım oluşturmaktır. Bu protokol, PVAT fonksiyonu ve periaortik adipositler ile vasküler hücreler arasındaki iletişim hakkında daha fazla araştırma yapmamızı sağlar in vitro. Şu anda deneylerimizde karşılaştığımız ana zorluklar arasında PVAT'ın mevcudiyetinin kısıtlanması ve ölümsüzleştirilmiş preadipositlerin kullanımına kıyasla ek insan ve malzeme kaynakları için gereksinimler yer alıyor.Protokolümüz, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin verir. Ayrıca PVAT halkası ve genleri ile heterojenliği incelemek için bir temel sunuyoruz ve PVAT farklılaşmasının önemli düzenleyicisini ve in vitro adipogenezi keşfetmek için bir platform sağlıyoruz.

isolation-culture-adipogenic-induction-stromal-vascular-fraction

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

1.2K Görüntüleme.  Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Amacımız, kütle PVAT'ından stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyon kültürü ve adipojenik indüksiyonu için standart bir yaklaşım oluşturmaktır. Bu protokol, PVAT fonksiyonu ve periaortik adipositler ile vasküler hücreler arasındaki iletişim hakkında daha fazla araştırma yapmamızı sağlar in vitro. Şu anda deneylerimizde karşılaştığımız ana zorluklar arasında PVAT'ın mevcudiyetinin kısıtlanması ve ölümsüzleştirilmiş preadiposi...

Video: Yazar Spotlight: Fare Perivasküler Yağ Dokusundan SVF'den Türetilmiş Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonunun Önemi 

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.

Biyoloji

Dissection and Isolation of Murine Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

Begin by spraying the properly euthanized mouse with 75%alcohol to disinfect the skin. Then place the mouse in a supine position. Lift the skin of the animal's abdominal region, and using surgical scissors, make a small incision in it.Then using the scissors, bluntly separate the skin and abdominal muscles from the pelvis to the neck, along the ventral midline. Expose the heart and lungs by cutting the diaphragm and ribs along both sides of the midline. Next, carefully remove the liver, spleen, bowels, and kidney, avoiding damage to the intestinal wall.Following that, remove the lungs and esophagus. Now gently lift the heart using forceps held in one hand and separate the aorta from the spine with surgical scissors held in the other hand. Then place the heart and aorta in a 60 millimeter petri dish, containing antibiotic supplemented PBS.Retrieve the microsurgical forceps and microsurgical scissors from the alcohol, and rinse them in 25 milliliters of PBS to remove excess alcohol. Working under a stereo microscope, remove the thymus and other tissues from the heart and aorta. Then remove the heart, leaving the aorta with the perivascular adipose tissues or PVATs.Transfer the aorta along with the PVATs to a clean 60 millimeter petri dish containing antibiotic supplemented PBS. Using one pair of microsurgical forceps, hold the aorta, and using another pair, pull off the attached adipose tissues to separate the PVATs from the aorta. Remove as much vascular tissue as possible while causing minimal harm to the PVATs.Finally, transfer the collected PVATs into a two milliliter microcentrifuge tube, containing antibiotic supplemented, high glucose, DMEM, placed on ice.

Murin Perivasküler Yağ Dokusunun Diseksiyonu ve İzolasyonu (PVAT)

Isolation of Stromal Vascular Fraction (SVF) from Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

While working under a class two laminar flow hood, begin by sequentially washing the perivascular adipose tissues or PVATs collected from mice two times. First, using PBS containing 10%penicillin-streptomycin, and, next, using PBS supplemented with 1%penicillin-streptomycin. Transfer the rinsed tissues into a sterile 60-millimeter Petri dish and add 200 microliters of digestion solution to it.Using sterile scissors, mince the tissues into pieces having a dimension of one cubic millimeter. With the help of sterile scissors, cut a plastic pipette tip to broaden its end. Then transfer the minced tissue mix to a 15-milliliter centrifuge tube using the broad-ended pipette tip.Add six milliliters of the digestion solution to the tissues to initiate digestion. After tying the tube horizontally on a rack, incubate it at 37 degrees Celsius in an orbital shaker for 30 to 45 minutes. Every 5 to 10 minutes, remove the tube from the shaker in the incubator and manually shake it up and down vigorously.Pass the digested tissue mix through a 70-micron cell strainer into a 50-milliliter centrifuge tube. Rinse the strainer with an equal volume of culture medium to maximize cell yield and quench digestion. Transfer the filtrate to a new 15-milliliter centrifuge tube.Centrifuge the tube to isolate the stromal vascular fraction or SVF. Invert the tube to discard the supernatant and re-suspend the pellet in five milliliters of PBS. Centrifuge the tube again at 1, 800 G for five minutes before discarding the supernatant.Re-suspend the pellet in an appropriate volume of culture medium. Seed the cells into a collagen-coated 12-well plate and incubate overnight at 37 degrees Celsius in a humid atmosphere with 5%carbon dioxide. On the next day, remove cell debris and red blood cells by aspirating the culture medium and washing the cells with antibiotic-supplemented PBS pre-warmed to 37 degrees Celsius.Finally, add one milliliter of fresh culture medium to each well, and continue culturing the cells until they reach the desired stage of confluency.