Lentiviral enfeksiyon için, tripsinizli MPNST hedef hücrelerini saydıktan sonra, 15 santimetrelik çanak başına 2,5 milyon hücreyi koruyarak plakalayın. Katyonik polimerin mililitresi başına beş mikrogram varlığında, çözülmüş virüslü hücreleri 0.5 enfeksiyon çokluğunda transdüksiyon yapın. Puromisin ilavesinden üç gün sonra hücreleri tripsinize edin.
Hücre popülasyonunun yarısını 200 G'de bir masa üstü santrifüjde beş dakika santrifüjleyin. Hücre popülasyonunun diğer yarısını yeniden kapladıktan sonra, daha önce gösterildiği gibi hasat ve santrifüjlemeden önce yaklaşık yedi popülasyon ikiye katlanması için büyütün. İstenilen süreye karşılık gelen yeniden süspanse hücre peletini iki adet 15 mililitrelik polimetilpenten tüpe bölün.
Tüp başına 500 mikrolitre% 10 SDS ekleyin. Karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. DNA'yı sonikleştirmek için tüpleri bir DNA kesme cihazına yerleştirin.
Fenol ve kloroform ilavesini takiben. 45 ila 60 saniye boyunca mümkün olan maksimum hızda kuvvetlice girdap yaparak iyice karıştırın. Elde edilen berrak üst fazın üç mililitresini her tüpten başka bir taze 15 mililitrelik tüpe aktarın.
0.5 mililitre üç molar sodyum asetat ve dört mililitre izopropanol ekleyin ve iyice karıştırın. Tüpleri 7, 200 G ve 20 santigrat derecede 30 dakika santrifüjledikten ve süpernatanı attıktan sonra, pelete 0,5 mililitre% 70 etanol ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek yerinden çıkarın. Her iki tüpten yeniden süspanse edilmiş peletleri 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde birleştirin.
Ekranda gösterilen koşulları kullanarak PCR reaksiyonlarını gerçekleştirin. İkinci PCR reaksiyonundan sonra, dört numuneyi bir mikro santrifüj tüpünde birleştirin. Ve buna 80 mikrolitre 6X yükleme boyası ekleyin.
Jeli görselleştirin ve yaklaşık 250 baz çiftinde bir bandı onaylayın. Dört farklı Bcl-6 kısa firkete RNA'sını eksprese eden, hedef olmayan bir kontrol ve lentivirüs ile transdüksiyona tabi tutulan insan MPNST hücreleri, Bcl-6 kısa firkete RNA'larının birçoğunun hücre sayılarını önemli ölçüde azalttığını ortaya koydu. İmmün leke, hücre sayısındaki azalma derecesinin Bcl-6 yıkım derecesi ile ilişkili olduğunu gösterdi.
