Yabani tip ve Agrobacterium ile enfekte olmuş bambu yapraklarından genomik DNA'yı çıkararak başlayın. Aşağıdaki PCR koşullarını kullanarak vahşi tip ve Agrobacterium ile enfekte olmuş bambu yapraklarından hedef genlerin hedef bölgesini içeren genomik DNA'yı çoğaltın. PCR'den sonra, bir mikrolitre age-1, bir mikrogram PCR ürünü ve beş mikrolitre 10X tampon içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayarak endonükleaz enzim sindirimi gerçekleştirin.
Ardından, 50 mikrolitrelik son hacme su ekleyin. Sindirim karışımını 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Jel elektroforezi kullanarak, sindirilmiş DNA fragmanlarının oranını analiz edin.
Gen düzenleme verimliliğini değerlendirmek için vahşi tip ve Agrobacterium ile enfekte olmuş örneklerden sindirilmiş parçaları karşılaştırın. Emilen ışık miktarını ve yaprak foto koruma sisteminin aktivasyonunu artırmak için bambu fidelerini yüksek ışık yoğunluğu koşullarına maruz bırakın. Ardından, IMAGING-PAM florometresini açın ve bambu yapraklarının in vivo fotosistem II klorofil floresansını ölçmek için aktinik ışık yoğunluğunu ayarlayın.
RUBY geni tarafından üretilen kırmızı beta şerit rengi, bambu yapraklarında başarılı Agrobacterium aracılı gen ekspresyonunu gösterdi. Dört Agrobacterium suşundan GV3101 suşu, enfekte bambu yapraklarında en önemli beta şerit birikimine neden oldu. CRISPR-Cas9 yapıları ve yüksek ışık tedavileri ile enfeksiyondan sonra, yaprak bıçaklarının belirli alanları daha düşük fotokimyasal olmayan söndürme değerleri gösterdi.
Ayrıca, enzim sindirimi ve dizileme analizi, düzenlenen bölgelerde PeVDE geninin başarılı mutasyonunu doğruladı. Hem sgRNA1 hem de sgRNA2 tarafından düzenlendikten sonra PeVDE fragmanının Sanger dizileme sonuçları, PeVDE geninde uzun bir fragmanın silindiğini gösterdi. 30 günlük Agrobacterium enfeksiyonundan sonra, hem PeVDE hem de PeCCR5 için sgRNA'larla transfekte edilen yaprak alanları daha düşük fotokimyasal olmayan söndürme değerleri sergiledi.
